丁艷麗 李珍 付涌玉

摘要：為了培育不結(jié)果或少結(jié)果的藤本月季新品種，降低植株?duì)I養(yǎng)消耗，節(jié)約管理成本，促進(jìn)月季開(kāi)花，提高其觀賞性，選定適合的月季品種作為父母本，進(jìn)行雜交試驗(yàn)。首先對(duì)父本花粉生活力和發(fā)芽率的測(cè)定和母本開(kāi)花生物學(xué)特性的觀測(cè)，接著開(kāi)展了有性雜交和播種育苗，最后從形態(tài)和DNA方面對(duì)雜種進(jìn)行鑒定。

關(guān)鍵詞：三倍體;雜交

現(xiàn)代月季通常指薔薇科、薔薇屬中一類(lèi)四季開(kāi)花的雜種品種群，主要包括四大類(lèi)：雜種香水月季、豐花月季、微型月季和藤本月季?，F(xiàn)代月季經(jīng)過(guò)200多年的發(fā)展，已逐漸形成了龐大的類(lèi)群，特別是歐美及日本等月季發(fā)達(dá)國(guó)家的新品種更是層出不窮，令人矚目?，F(xiàn)代月季的品種群（2n=2x、3x、4x、x、5x、6x、8x），種類(lèi)繁多，來(lái)源廣泛。

國(guó)內(nèi)月季育種現(xiàn)狀：月季的育種最早始于中國(guó)，其最早記錄是公元960 年把Rosa chinensis 用于月季雜交。北宋時(shí)代，我國(guó)月季品種廣栽于洛陽(yáng)、山東、兩淮、蘇州、揚(yáng)州等地，當(dāng)時(shí)已經(jīng)開(kāi)展播種天然授粉種子并由實(shí)生苗中選育新品種的活動(dòng)。到宋代，僅洛陽(yáng)就有41個(gè)月季品種，達(dá)到了世界水平。但是從明代開(kāi)始我們落伍了，野生資源、古老品種遭到嚴(yán)重破壞和流失，直到不久前我國(guó)的月季育種還基本處于停滯或緩慢發(fā)展?fàn)顟B(tài)。我國(guó)月季育種工作開(kāi)始于新中國(guó)成立以后，20世紀(jì)50～70年代，我國(guó)自育品種‘黑旋風(fēng)’、‘上海之春’、‘浦江朝霞’相繼問(wèn)世，上海、北京、杭州等地新品種選育工作開(kāi)始發(fā)展。1986年中國(guó)月季協(xié)會(huì)成立后，大力倡導(dǎo)新品種的培育工作，全國(guó)許多城市相繼成立了月季協(xié)會(huì)，高校、科研機(jī)構(gòu)以及月季愛(ài)好者開(kāi)始重視月季的育種工作，我國(guó)月季育種和發(fā)展進(jìn)入了新時(shí)代。1957～2016年的60年間，我國(guó)自育新品種共計(jì)455個(gè)。

植物的多倍體情況在植物界里隨處可見(jiàn)，如馬鈴薯、小麥、棉花、無(wú)籽西瓜、香蕉、番茄、巨峰葡萄等等。多倍體育種是指通過(guò)人工的方法將植物染色體組進(jìn)行加倍，或是直接從自然界中選育染色體組加倍的突變體，從而獲得新品種的方法。多倍體的特點(diǎn)有巨大性、品質(zhì)與產(chǎn)量提高、生理特性改變、遺傳變異性、不孕性與可孕性等特點(diǎn)。由于多倍體的諸多特點(diǎn)，多倍體育種在植物育種學(xué)和分子生物學(xué)方面早已成為研究熱門(mén)。多倍體植物品種的育種方法主要有兩大類(lèi)，一類(lèi)是植物在自然界中自然加倍，人們根據(jù)自己的需求，到自然界中去發(fā)現(xiàn)自然加倍的物種，將其直接引種過(guò)來(lái);另一類(lèi)就是通過(guò)人工誘導(dǎo)的方法產(chǎn)生。人工誘導(dǎo)多倍體的方法比較多，如使用溫度刺激、機(jī)械創(chuàng)傷、嫁接、電離輻射、射線等方法誘使植物加倍的物理方法;如使用秋水仙素等化學(xué)誘變劑誘導(dǎo)植物加倍;如仿效自然加倍的途徑，使用傳統(tǒng)雜交技術(shù)、組織培養(yǎng)技術(shù)、細(xì)胞融合技術(shù)進(jìn)行多倍體育種。

目前國(guó)內(nèi)的月季育種目標(biāo)主要集中在花色育種、花香育種、抗性育種，育種方法主要是雜交育種、誘變育種、分子育種。在國(guó)內(nèi)，月季的倍性育種少有報(bào)道。北京聯(lián)合大學(xué)特殊教育學(xué)院鮑平秋團(tuán)隊(duì)采用四倍體藤本月季‘多特蒙德’作為母 本 ，二倍體‘北京俏’‘北京紅’作為父本，進(jìn)行雜交育種，培育出了三倍體雜交新種‘特嬌’、‘特俏’、‘多嬌’、‘多俏’。三倍體月季，一方面可以使結(jié)實(shí)率降低;另一方面，可以獲得更好的觀賞效果，同時(shí)降低水肥消耗、節(jié)約養(yǎng)護(hù)管理成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)王康的專(zhuān)業(yè)碩士論文是對(duì)古老月季‘月月粉’的四倍體誘導(dǎo)、鑒定和特性研究。

1 確定三倍體育種目標(biāo)

三倍體月季，一方面可以使結(jié)實(shí)率降低;另一方面，可以獲得更好的觀賞效果，同時(shí)降低水肥消耗、節(jié)約養(yǎng)護(hù)管理成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。培育三倍體月季，要按照?qǐng)@林植物育種目標(biāo)多樣性、高效性、季節(jié)性、兼用性等特點(diǎn)，遵循育種目標(biāo)的預(yù)見(jiàn)性、可操作性、可檢驗(yàn)性等特點(diǎn)，來(lái)選擇適合的父母本，已達(dá)到預(yù)訂的育種目標(biāo)。

2 根據(jù)育種目標(biāo)，確定父本與母本

2.1 母本的選擇

選擇母本需要考慮到它的開(kāi)花生物學(xué)特性，包括天然授粉結(jié)實(shí)率、自花授粉結(jié)實(shí)率、孤雌生殖結(jié)實(shí)率、天然授粉果實(shí)平均結(jié)子率及種子萌發(fā)率，選擇結(jié)實(shí)率高，種子萌發(fā)率高，優(yōu)點(diǎn)突出的二倍體或四倍體月季品種作為母本。

2.2 父本的選擇

在選擇父本時(shí)，除要求花粉量大、花粉萌發(fā)率高外，還要兼顧性狀遺傳規(guī)律。根據(jù)育種目標(biāo)和現(xiàn)有材料，我們選擇適合的二倍體或者四倍體月季品種作為父本。

2.2.1 父本花粉生活力測(cè)定

花粉采集：摘取選定的父本植株上含苞待放、花瓣抱合的花蕾，在陰涼干燥的室內(nèi)，用鑷子分別取出的花蕾中的花藥，將花藥放置在硫酸紙上，自然干燥，待花藥開(kāi)裂散粉后收集花粉，進(jìn)行花粉生活力的測(cè)定。

用解剖針在載玻片上撒少量花粉，滴1滴I-IK溶液，蓋上蓋玻片，用吸水紙將多余藥液吸干，將載波片放在顯微鏡下觀察花粉染色情況。每種花粉觀察3個(gè)視野，分別統(tǒng)計(jì)花粉染色情況，從而得出各種花粉生活力狀況。

2.2.2 父本花粉發(fā)芽率測(cè)定

（1）父本花粉發(fā)芽率測(cè)定方法：在500ml容量的燒杯中倒入100ml蒸餾水，放在微波爐中加熱煮開(kāi)，加入0.4g瓊脂和10mg蔗糖，攪拌均勻后，繼續(xù)加熱煮開(kāi)，加入0.01g硼酸，用玻璃棒攪拌均勻。

（2）制片：用玻璃棒蘸少許培養(yǎng)基，趁熱滴入凹形載玻片的凹槽內(nèi)，等培養(yǎng)基冷卻后，用解剖針均勻撒上少量花粉粒。

（3）培養(yǎng)：在培養(yǎng)皿下面墊一層濾紙，向?yàn)V紙上滴水直至濾紙吸足水，以保持濕度，將制好的載玻片放入培養(yǎng)皿內(nèi)，蓋好培養(yǎng)皿，放在25℃的恒溫箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。

（4）鏡檢：花粉培養(yǎng)一段時(shí)間后，取出載玻片，放在顯微鏡下觀察花粉萌發(fā)情況。每種花粉觀察4個(gè)視野，以花粉管長(zhǎng)度等于或大于花粉直徑長(zhǎng)度為準(zhǔn)，分別記錄每個(gè)視野花粉的萌發(fā)數(shù)，計(jì)算花粉的發(fā)芽率。

3 月季三倍體雜交育種的技術(shù)

3.1 雜交親本選擇

親本應(yīng)具有我們所需要的優(yōu)良性狀和特性，優(yōu)點(diǎn)多缺點(diǎn)少，而且親本的優(yōu)缺點(diǎn)要能互相彌補(bǔ)。親本來(lái)源在地理上應(yīng)較遠(yuǎn)，生態(tài)類(lèi)型不同，這樣可以豐富雜種遺傳性，增強(qiáng)雜種優(yōu)勢(shì)。

3.2 母株和花朵的選擇

根據(jù)育種目標(biāo)的要求，選擇生長(zhǎng)健壯、發(fā)育良好的作為母株。去雄的花朵以選擇植株中上部和向陽(yáng)的花為好。每枝保留的花朵數(shù)一般以3～5朵為宜，多余的去掉，以保證雜種種子的營(yíng)養(yǎng)。

3.3 去雄

去雄時(shí)間都應(yīng)在雌雄蕊未成熟時(shí)，可先用手輕輕剝開(kāi)花蕾，用鑷子剔去花中的雄蕊，仔細(xì)檢查每片花瓣的基部，以免留有零星散生的雄蕊。小心操作，千萬(wàn)不要損傷雌蕊。

3.4 套袋

為避免計(jì)劃外植物花粉干擾，去雄后立即套上袋子。袋子兩端開(kāi)口，頂端向下卷折，用回形針夾住，下端應(yīng)縛在老枝上，因?yàn)楫?dāng)年生枝脆易斷。套袋后掛上紙牌，用鉛筆寫(xiě)明去雄日期。

3.5 授粉

待柱頭分泌黏液發(fā)亮?xí)r即可授粉。為確保授粉成功，最好連續(xù)授粉2～3次。授粉工具一般用毛筆、棉花球;特別少的花粉，用圓錐形橡皮頭授粉。授粉后應(yīng)立即封好套袋，并在紙牌上注明雜交組合、雜交日期、授粉數(shù)等。

3.6 雜交后的管理

雜交后，要細(xì)心管理，創(chuàng)造良好的、有利于雜交種子發(fā)育的條件，并注意觀察記載，及時(shí)防治病蟲(chóng)害，防止人為的破壞。

4 雜交后代播種、選育

4.1 播種

雜交果實(shí)后，逐個(gè)剖開(kāi)，將種子裝入透氣的牛皮紙袋中。再將牛皮紙袋沙藏在用滅菌靈藥液浸泡消毒過(guò)的泥瓦盆中沙藏，沙藏用的沙子是新的細(xì)河沙。裝好盆后，將瓦盆放在建筑物的北墻根，用草袋覆蓋，經(jīng)常檢查，保證沙子的濕度在60%左右。在第二年春季，將種子取出，進(jìn)行盆播。

4.2 選育

因?yàn)殡s交幼苗比較弱，一定要倍加呵護(hù)，做好水肥管理，以保證雜交后代的成活率。由于月季是異花授粉，F(xiàn)1就出現(xiàn)了分離，所以選擇在F1進(jìn)行。雜種植物至少要經(jīng)過(guò)3～5年的形狀觀察、比較、分析，最終做出性狀鑒定。

5 雜交后代倍性鑒定

5.1 形態(tài)鑒定

對(duì)雜種苗主要從株形、株高、小葉數(shù)、葉色、花期、花色、花瓣數(shù)、花徑、花型、天然授粉結(jié)實(shí)率方面進(jìn)行觀察。將雜種苗與父母本比較它們之間的關(guān)系。

5.2 氣孔觀察

分別取父母本與雜種苗的葉片，用解剖針、眼科鑷在葉背面剝下一層表皮，將撕下的表皮放在載玻片上，滴一滴清水，蓋上蓋玻片，放在顯微鏡下觀察氣孔情況。觀察氣孔大小，氣孔分布密度，并進(jìn)行比較。

5.3 流式細(xì)胞分析儀測(cè)定方法

組培苗的獲得：

從父母本和雜交種苗上選取直徑0.5～0.8cm的新生枝條，用洗衣粉溶液輕輕洗滌，再用自來(lái)水沖洗干凈，然后放在濾紙上吸干枝條上的自來(lái)水。在超凈工作臺(tái)上將枝條剪成約2cm左右的帶芽的莖段，每個(gè)莖段要帶一個(gè)節(jié)。用70%的酒精消毒1min，用消毒過(guò)的蒸餾水振蕩沖洗3遍，再用0.1%的升汞溶液消毒2min，然后用消毒過(guò)的蒸餾水沖洗3次，再用70%的酒精消毒1min，用消毒過(guò)的蒸餾水振蕩沖洗3遍，再用0.1%的升汞溶液消毒2min，然后用消毒過(guò)的蒸餾水沖洗5次。消毒后，將莖段放在無(wú)菌濾紙上，接種在初代培養(yǎng)基上，3周后等芽長(zhǎng)到1cm左右時(shí)，將芽切下接種到繼代增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖。增殖30～45d后即可以將無(wú)根苗切離接種到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。

稱取100mg試管苗嫩莖及幼葉，在滴有2ml提取緩沖液的培養(yǎng)皿中研碎，260目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，離心（1000r/min）漂洗3次，獲得細(xì)胞核懸液。將細(xì)胞核懸液離心處理后，去掉上層清液，加入染色緩沖液，暗處常溫下染色30min。500目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，濾液用標(biāo)準(zhǔn)試管收集，染色緩沖液為提取緩沖液內(nèi)加入3000ml/L的RNA酶A和10ml/L EB（溴化乙錠），通過(guò)流式細(xì)胞分析儀的激發(fā)光源照射可激發(fā)經(jīng)熒光染色的DNA分子促發(fā)熒光，測(cè)定裝置測(cè)定熒光強(qiáng)度，與測(cè)定裝置相連的計(jì)算機(jī)分析軟件即可對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析，觀察細(xì)胞核DNA含量明顯增加的情況。隨著植物倍性水平的增高，細(xì)胞核DNA含量明顯增加。

5.4 根尖染色體測(cè)定

針對(duì)三倍體月季的倍性測(cè)定，還可以通過(guò)根尖染色體制片來(lái)進(jìn)行染色體數(shù)量測(cè)定，以確定雜交種倍性。

5.4.1 測(cè)定材料選取

選擇雜交種植株的莖段，利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行接種培養(yǎng)，直至生根。上午8～9點(diǎn)時(shí)，截取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的組培苗的根尖，長(zhǎng)約2cm。

5.4.2 預(yù)處理

將切下的根尖清洗后放入0.002mol/L、8-羥基喹啉溶液中，在室溫下浸泡45min，抑制紡錘絲的形成。

5.4.3 固定

將根尖取出后，用蒸餾水清洗三遍，投入到卡諾固定液中，放置到4℃冰箱中固定1h，迅速殺死細(xì)胞。

5.4.4 解離

將固定之后的根尖清洗3次，投放到5mol/L HCL中，在室溫下浸泡10min，使細(xì)胞壁軟化，易于壓片。

5.4.5 染色

將根尖取出，蒸餾水清洗3次，投入到卡寶品紅溶液中2～3h，進(jìn)行染色。

5.4.6 壓片

使用雙面刀片切去根尖部分，長(zhǎng)度約1mm，放置在載玻片上，滴加清水，將蓋玻片一側(cè)接觸水滴，輕輕蓋上蓋玻片，用濾紙吸去多余水分。在載玻片下墊上濾紙，使用鑷子輕微敲擊蓋玻片，使根尖細(xì)胞分散開(kāi)。

5.4.7 鏡檢

將根尖壓片制好后，放在顯微鏡下觀察染色體數(shù)，以確定被測(cè)雜交種的倍性。

6 結(jié)語(yǔ)

月季的育種方法很多，隨著時(shí)間發(fā)展，技術(shù)進(jìn)步，我國(guó)自育的月季新品種越來(lái)越多，培育新品種月季的方法也越來(lái)越多，而通過(guò)常規(guī)雜交育種，培育三倍體月季的研究不多，但是已經(jīng)有培育成功的報(bào)道，這足以證明這種月季三倍體育種方法可行，而且這種培育三倍體月季的方法也是月季育種中不可或缺的。

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