高爽（遼寧省盤(pán)錦檢驗(yàn)檢測(cè)中心,遼寧 盤(pán)錦 124080）

由于碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物的過(guò)度使用，耐藥腸桿菌科細(xì)菌(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE)菌株的檢出率呈上升趨勢(shì)，產(chǎn)碳青霉烯酶菌株對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物具有耐藥性，對(duì)幾乎所有的β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物都存在耐藥，CRE對(duì)全球的公共衛(wèi)生安全都造成了威脅[1]。因此，快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)耐碳青霉烯類(lèi)腸桿菌科細(xì)菌十分必要。目前，主要采用Carba NP試驗(yàn)及碳青霉烯類(lèi)失活試驗(yàn)法檢測(cè)腸桿菌科細(xì)菌碳青霉烯酶，但以上檢測(cè)方法只能檢測(cè)碳青霉烯酶的活性，不能區(qū)分碳青霉烯酶的類(lèi)型，因此，亟需找到一種能快速、準(zhǔn)確對(duì)碳青霉烯酶類(lèi)型進(jìn)行區(qū)分的檢測(cè)方法[2]。Carba plus紙片法通過(guò)酶抑制劑原理，通過(guò)讀取抑菌圈直徑區(qū)分碳青霉烯酶的類(lèi)型[3]。碳青霉烯類(lèi)抗生素是一種常見(jiàn)的廣譜抗菌藥物，由于廣泛應(yīng)用，耐碳青霉烯類(lèi)抗生素的細(xì)菌不斷增加，耐藥機(jī)制主要為可水解的碳青霉烯類(lèi)抗生素β-內(nèi)酰胺酶-碳青霉烯酶產(chǎn)生[4]。為了進(jìn)一步研究耐碳青霉烯類(lèi)菌株的耐藥原因，本研究旨在探討Carba plus紙片法檢測(cè)耐藥腸桿菌科細(xì)菌的碳青霉烯酶類(lèi)型的評(píng)估能力及與β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集醫(yī)院2018年6月-2020年6月臨床分離非重復(fù)的65株耐碳青霉烯類(lèi)腸桿菌科細(xì)菌為研究組，另選取同期分離的68株碳青霉烯類(lèi)敏感腸桿菌科細(xì)菌為對(duì)照組。

1.2 儀器與試劑 儀器：VITEK-MS質(zhì)譜儀和VITEK-2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定藥敏儀、CFX96熒光定量PCR擴(kuò)增儀、Bio-Rad ChemiDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)、GNP29270型恒溫孵育箱、BG-subMIDI(v)可見(jiàn)光電泳透射儀。

試劑：VITEK-MS CHCA基質(zhì)液、血瓊脂平皿和亞胺培南藥敏紙、M-H藥敏瓊脂平皿、Mastdiscs combi Carba plus試劑盒、Premix TaqTM酶、DLl000 DNA Marker和DL2000 DNA Marker、PCR 擴(kuò)增試劑、培養(yǎng)基。

1.3 方法

1.3.1 Carba plus紙片法檢測(cè) 根據(jù)紙片擴(kuò)散法的藥敏試驗(yàn)操作步驟，配制0.5麥?zhǔn)蠞岫刃迈r菌懸液，在MH藥敏平皿均勻涂布上，將Carba plus紙片(A-E)、亞胺培南紙片均貼在藥敏平板上，使各紙片間保持足夠的距離，以便出現(xiàn)清晰的抑制區(qū)。于35℃條件下孵育18-24h，對(duì)每張紙片的抑菌圈直徑進(jìn)行測(cè)量。

1.3.2 耐藥基因檢測(cè) 通過(guò)煮沸法對(duì)細(xì)菌DNA模板進(jìn)行提取，用特異性引物對(duì)碳青霉烯酶基因、β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因進(jìn)行擴(kuò)增。

1.3.3 PCR檢測(cè) PCR體系：Taq PCR Master Mix體系12.5tA，ddH2O 9.5pL，上游引物和下游引物各1弘L，模板DNA1 td。

PCR反應(yīng)條件：于94℃條件下進(jìn)行預(yù)變性5min；于94℃條件下變性30s，退火30s；于72℃條件下進(jìn)行延伸；重復(fù)變性、退火、延伸，30個(gè)循環(huán)；于72℃條件下繼續(xù)延伸7min。將擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，再放凝膠成像上進(jìn)行觀(guān)察。

1.4 Carba plus紙片法檢測(cè)碳青霉烯酶的評(píng)價(jià) 以PCR耐藥基因序列分析作為診斷金標(biāo)準(zhǔn)[5]，比較Carba plus紙片法檢測(cè)碳青霉烯酶的診斷效能。

診斷敏感度=真陽(yáng)性例數(shù)/（真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù)）×100%，診斷特異度=真陰性例數(shù)/（真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù)）×100%，診斷準(zhǔn)確度=（真陽(yáng)性例數(shù)+真陰性例數(shù)）/總例數(shù)×100%。陽(yáng)性預(yù)測(cè)值（%）=真陽(yáng)性/（真陽(yáng)性+假陽(yáng)性）×100%。陰性預(yù)測(cè)值（%）=真陰性/（真陰性+假陰性）×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 以SPSS20.0軟件行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以[n(%)]形式顯示，行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 Carba plus紙片法檢測(cè)結(jié)果與耐藥基因序列分析結(jié)果對(duì)比 65株耐碳青霉烯類(lèi)腸桿菌科細(xì)菌菌株Carba plus紙片法檢測(cè)結(jié)果：KPC陽(yáng)性37株，MBL陽(yáng)性21株，OXA-48陽(yáng)性4株，未檢測(cè)出產(chǎn)酶類(lèi)型3株；68株碳青霉烯類(lèi)敏感腸桿菌科細(xì)菌菌株均未檢測(cè)出產(chǎn)酶類(lèi)型。見(jiàn)表1。

表1 Carba plus紙片法檢測(cè)結(jié)果與耐藥基因序列分析結(jié)果對(duì)比

2.2 Carba plus紙片法與PCR耐藥基因序列分析檢測(cè)KPC酶的結(jié)果比較 以耐藥基因檢測(cè)作為檢測(cè)碳青霉烯酶類(lèi)型的金標(biāo)準(zhǔn)，得到Carba plus紙片法預(yù)測(cè)腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)KPC酶的準(zhǔn)確度為94.74%，敏感度為84.44%，特異度為100.00%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為84.44%，陰性預(yù)測(cè)值為100.00%。見(jiàn)表2。

表2 Carba plus紙片法與PCR耐藥基因序列分析檢測(cè)KPC酶的結(jié)果比較

2.3 Carba plus紙片法與PCR耐藥基因序列分析檢測(cè)MBL酶的結(jié)果比較 以耐藥基因檢測(cè)作為檢測(cè)碳青霉烯酶類(lèi)型的金標(biāo)準(zhǔn)，得到Carba plus紙片法預(yù)測(cè)產(chǎn)MBL酶的準(zhǔn)確度為97.74%，敏感度為100.00%，特異度為97.37%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為86.36%，陰性預(yù)測(cè)值為100.00%。見(jiàn)表3。

表3 Carba plus紙片法與PCR耐藥基因序列分析檢測(cè)MBL酶的結(jié)果比較

2.4 Carba plus紙片法與PCR耐藥基因序列分析檢測(cè)OXA-48酶的結(jié)果比較 以耐藥基因檢測(cè)作為檢測(cè)碳青霉烯酶類(lèi)型的金標(biāo)準(zhǔn)，得到Carba plus紙片法預(yù)測(cè)產(chǎn)OXA-48酶的準(zhǔn)確度為99.25%，敏感度為100.00%，特異度為99.23%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為100.00%，陰性預(yù)測(cè)值為100.00%。見(jiàn)表4。

表4 Carba plus紙片法與PCR耐藥基因序列分析檢測(cè)OXA-48酶的結(jié)果比較

2.5 耐藥基因擴(kuò)增結(jié)果 65株CRE中有24株菌產(chǎn)碳青霉烯酶，其中18株CRE同時(shí)攜帶其他β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因；65株CRE中有39株產(chǎn)CTX-M型ESBL酶，3株CRE產(chǎn)DHA-1型質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶。

3 討論

碳青霉烯類(lèi)抗生素是抗菌譜最廣、抗菌活性最強(qiáng)的非典型β-內(nèi)酰胺抗生素，對(duì)產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶及AmpC酶的細(xì)菌具有較強(qiáng)的抗菌作用[6-8]。由于CRE的耐藥形勢(shì)十分嚴(yán)峻，且耐藥機(jī)制較多樣，發(fā)生CRE感染會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的后果，對(duì)CRE菌株進(jìn)行快速、正確的診斷，有助于區(qū)別產(chǎn)酶類(lèi)型，有助于明確感染暴發(fā)的流行本質(zhì)[9]。Carba plus紙片法是一種鑒定產(chǎn)碳青霉烯酶類(lèi)型的新方法，通過(guò)酶抑制劑原理，讀取抑菌圈直徑，以對(duì)KPC型、MBLs型、OAX-48型碳青霉烯酶進(jìn)行區(qū)別，在鑒定產(chǎn)酶時(shí)還能夠分析菌株的產(chǎn)酶類(lèi)型，為控制醫(yī)院感染提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)[10-11]。隨著碳青霉烯類(lèi)抗生素的廣泛應(yīng)用，耐藥的細(xì)菌不斷增加，認(rèn)為其耐藥機(jī)制與碳青霉烯酶的產(chǎn)生有關(guān)[12]。

本研究結(jié)果顯示，Carba plus紙片法預(yù)測(cè)產(chǎn)KPC酶的敏感度僅為84.44%?？紤]原因可能與KPC基因的編碼質(zhì)粒出現(xiàn)轉(zhuǎn)移有關(guān)[13]。Carba plus紙片法預(yù)測(cè)產(chǎn)MBL酶的敏感度、陰性預(yù)測(cè)值均為100.00%，但陽(yáng)性預(yù)測(cè)值僅為86.36%。考慮原因與選取的產(chǎn)MBL酶菌株的基因型種類(lèi)不全有一定的關(guān)系[14]。Carba plus紙片法預(yù)測(cè)產(chǎn)OXA-48酶的特異度為99.23%，沒(méi)有達(dá)到100.00%。考慮原因可能為Carba plus紙片中有替莫西林，替莫西林使肺炎克雷伯桿菌產(chǎn)生耐藥，出現(xiàn)假陽(yáng)性，使產(chǎn)OXA-48酶的特異度變低[15]。

綜上所述，Carba plus紙片法可準(zhǔn)確區(qū)別CRE菌株的產(chǎn)酶類(lèi)型；CRE的碳青霉烯酶的耐藥機(jī)制為攜帶KPC型的碳青霉烯酶基因，與β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因有關(guān)。