楊百霞，謝國棟，倪 峰，崔曉佳，葛 琴

（南通大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院/南通市腫瘤醫(yī)院放療科，江蘇 226361）

放射性肺損傷（radiation-induced lung injury，RILI）是胸部腫瘤放療最常見的并發(fā)癥之一，病變周圍的肺組織因接受超過閾值的放射劑量，產(chǎn)生不可逆性損傷[1]。目前精確放療技術(shù)不斷改進(jìn)，大大降低了輻射劑量和體積，但仍有30%以上患者發(fā)生RILI。RILI在肺癌放療中的發(fā)病率最高（5%～25%），其次是縱隔淋巴瘤（5%～10%）和乳腺癌（1%～5%）[2]。RILI病理變化包括放射性肺炎和放射性肺纖維化兩個階段，是動態(tài)的連續(xù)過程[3-4]。目前RILI發(fā)生機制尚不明確，是由多種細(xì)胞因子參與，涉及細(xì)胞損傷、氧化應(yīng)激、基因改變等復(fù)雜過程。尋找放射性肺損傷的防護藥物是臨床上亟待解決的問題。

3-3’二吲哚甲烷（diindolylmethane，DIM）是吲哚-3-甲醇（indole-3-carbinol，I3C）衍生物，為小分子化合物，人體口服吸收順利，耐受性良好，無明顯毒副作用[5]。I3C及DIM可以正向調(diào)節(jié)電離輻射導(dǎo)致的DNA損傷、修復(fù)密切相關(guān)蛋白ATM及BRCA1表達(dá)及其磷酸化[6]。DIM通過ATM/BRCA1磷酸化激活，選擇性增加正常組織耐輻射能力，延長受照動物的存活時間，而不影響腫瘤組織的放射治療敏感性[7]。本研究通過建立放射性肺損傷小鼠模型[8-11]，探討DIM對放射性肺損傷的防護作用及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 120只清潔級雌性C57BL/6小鼠，體重20±2 g（無錫江南實驗動物中心），自由進(jìn)食進(jìn)水，常溫下適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后用于實驗。DIM（純度＞99%，江蘇普樂司生物科技有限公司），EDTA抗原修復(fù)液、抗轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）一抗（1∶100，英國Abcam公司），BSA（Sigma），二抗:HRP標(biāo)記山羊抗兔（1∶200，KPL公司），抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）一抗（1∶100，Santa Cruz公司）；二抗:HRP標(biāo)記的山羊抗兔鼠（即用型，丹麥DAKO公司）。Synergy直線加速器（瑞典ELEK-TA公司），正置光學(xué)顯微鏡（E100）、成像系統(tǒng)（DS-U3）（日本尼康公司），凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型構(gòu)建:將120只C57BL/6小鼠隨機分為空白對照組、單純照射組、單純DIM組、照射+DIM組、照射+潑尼松組，每組24只。10%水合氯醛麻醉小鼠后，單純照射組、照射+DIM組、照射+潑尼松組小鼠采用加速器6MV-X射線單次全胸照射，劑量16 Gy。照射+DIM組于照射前30 min灌胃DIM 75 mg/kg[12]，照射+潑尼松組于照射前30 min灌胃潑尼松5 mg/kg；單純DIM組僅灌胃DIM 75 mg/kg，空白對照組給予同等容量生理鹽水灌胃。小鼠經(jīng)單次16 Gy X射線全胸照射后無死亡。照射后于24 h、1周、2周、4周頸椎脫臼法處死小鼠，每次每組處死6只小鼠。將肺組織以10%甲醛液固定，常規(guī)取材、石蠟包埋、切片，HE染色，于顯微鏡下進(jìn)行觀察。與空白對照組小鼠比較，主要表現(xiàn)為肺泡壁充血，有炎細(xì)胞浸潤，與文獻(xiàn)報道基本一致，表明模型建立成功。

1.2.2 肺組織病理學(xué)評分:根據(jù)肺組織病變（肺泡壁充血、出血、炎細(xì)胞浸潤及肺氣腫）程度評分:基本正常為0分，輕微或極少量計0.5分，輕度或少量計1分，中度或較多計2分，重度或多量計3分，極重度或大量計4分。根據(jù)病變區(qū)域占整個制片區(qū)域的比例評分，基本正常計0分，局部病變（＜12%）計0.5分，小范圍病變（12%～25%）計1分，中等范圍病變（25%～50%）計2分，大范圍病變（50%～75%）計3分，廣泛病變（＞75%）計4分。累加所有分?jǐn)?shù)，取平均分，分值越高提示損傷程度越嚴(yán)重。

1.2.3 Western blot檢測蛋白表達(dá):取照射后2周的小鼠肺組織，剪碎，RIPA裂解液提取蛋白，BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。用10%SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜。5%BSA室溫封閉2 h，加入一抗，4℃封閉過夜。次日洗去一抗（TGF-β1，1∶1 000；VEGF，1∶1 200），加入二抗室溫封閉1 h，將膜洗凈，滴加化學(xué)發(fā)光液，凝膠成像系統(tǒng)獲取蛋白條帶圖片，Image J軟件對條帶灰度值定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。計量資料以表示，組間差異性比較采用One-Way ANOVA檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠放射性肺損傷病變程度比較 照射后各時間點各組病變程度比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），單純照射組病變最明顯，其次是照射+潑尼松組，照射+DIM組病變程度最輕，照射后2周放射性肺損傷反應(yīng)最明顯。見表1、見圖1。

圖1 各組小鼠放射性肺損傷肺組織切片觀察（照射后2w）

表1 各組小鼠放射性肺損傷評分比較 分

2.2 各組肺組織TGF-β1、VEGF蛋白表達(dá)水平比較 單純照射組小鼠肺組織TGF-β1、VEGF蛋白表達(dá)水平高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；照射+DIM組小鼠TGF-β1、VEGF蛋白表達(dá)水平低于單純照射組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；見圖2、圖3。照射+潑尼松組小鼠TGF-β1、VEGF蛋白表達(dá)水平低于單純照射組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 各組肺組織TGF-β1、VEGF蛋白表達(dá)水平

圖3 各組肺組織TGF-β1、VEGF蛋白條帶灰度值統(tǒng)計

3 討 論

放射治療是治療胸部惡性腫瘤的重要手段之一，但RILI的發(fā)生限制了放療劑量和靶區(qū)體積[13-14]。有研究顯示，重度RILI病死率高達(dá)50%[15]，胸部放療患者有2.3%死于RILI[16]。RILI患者早期無明顯臨床表現(xiàn)，通常在晚期嚴(yán)重肺纖維化時才被診斷。目前臨床上對RILI的治療主要是緩解癥狀[17-18]，因此預(yù)防性治療尤為關(guān)鍵。

RILI的發(fā)生發(fā)展涉及多種復(fù)雜因素，目前普遍認(rèn)為放射線導(dǎo)致Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，產(chǎn)生多細(xì)胞因子級聯(lián)反應(yīng)，引起細(xì)胞因子瀑布效應(yīng)，激發(fā)炎癥反應(yīng)，不斷刺激引起肺組織纖維化[19-20]。肺組織受到輻射時引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生大量活性氧類物質(zhì)（reactive oxygen species，ROS），ROS誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步加重肺組織損傷[21-22]。而受損細(xì)胞釋放細(xì)胞因子和趨化因子，促使炎性細(xì)胞遷移到受損部位，釋放TGF-β1、TGF-α、IL-6等細(xì)胞因子。TGF-β1在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮舉足輕重的作用[23]，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞通過釋放TGF-β1導(dǎo)致肺纖維化的發(fā)生[24-25]，而TGF-β1誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達(dá)，進(jìn)而加速肺纖維化進(jìn)程[26-27]。有研究證實，DIM可通過多種機制發(fā)揮抗腫瘤作用，如調(diào)控PI3K/Akt通路增加腫瘤細(xì)胞凋亡，通過降低HIF-1抑制血管生成[28-29]。

本研究放射性肺損傷小鼠模型實驗結(jié)果顯示，照射前DIM干預(yù)能顯著減輕小鼠肺組織損傷，顯著減少放療誘導(dǎo)的小鼠肺組織TGF-β1和VEGF表達(dá)，提示DIM具有輻射防護作用，可能與抑制TGF-β1/VEGF信號通路有關(guān)。DIM有望成為防護放射性肺損傷的潛在藥物，但是其毒副作用、用藥劑量及作用機制還需進(jìn)一步研究。