雷 君，張少軍，王黎黎

（長江航運總醫(yī)院感染科，湖北武漢 430010）

乙肝病毒（HBV）感染呈世界性流行，全球約有2.57億慢性HBV感染者，每年有88.7萬人死于HBV感染。我國慢性HBV感染者約7 000萬，其中慢性乙型肝炎患者2 000萬～3 000萬。對于慢性乙型肝炎患者根據(jù)病情、家族史及伴隨疾病等因素，適時啟動抗病毒治療是延緩病情進(jìn)展的最有效手段。核苷（酸）類似物是最主要的抗乙肝病毒藥物，受到經(jīng)濟(jì)條件的限制，我國最早上市的拉米夫定（lamivudine，LAM）和阿德福韋酯（adefovir，ADV）仍在臨床上廣泛應(yīng)用。長期服用拉米夫定的患者HBV DNA聚合酶P區(qū)可發(fā)生變異，簡稱YMDD變異[1]，5年發(fā)生率可高達(dá)70%，YMDD變異對拉米夫定產(chǎn)生耐藥，對恩替卡韋的敏感性下降，需要及時調(diào)整抗病毒治療方案[2]。

小鼠乙肝模型是目前研究HBV感染及治療最常用的動物模型，采用尾靜脈高壓法注射復(fù)制性質(zhì)粒建立短期HBV模型，相對簡單易行[3]。本研究通過建立乙肝病毒YMDD突變小鼠模型，進(jìn)行HBV復(fù)制水平及藥物敏感性研究，為后續(xù)耐藥研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒 采用的野生型HBV質(zhì)粒為具備復(fù)制能力的PH-BV 4.1 kb質(zhì)粒（四川大學(xué)感染性疾病研究室）,包含1.3拷貝的HBV基因組（ayw亞型）。突變型HBV質(zhì)粒是在野生型PH-BV 4.1 kb質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，使用Quik Change Multi Site-Directed Mutagenesis Kit試劑盒（上海英駿生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行rtM204I位點突變，通過引物設(shè)計、PCR擴增、轉(zhuǎn)染、培養(yǎng)、搖菌后行質(zhì)粒抽提，并完成質(zhì)粒測序鑒定[4]。

1.2 小鼠模型建立及分組處理 選取雄性BALB/c小鼠16只，6～8周齡，體重18～20 g，合格證號SCXK（川）2020-030，飼養(yǎng)于武漢大學(xué)實驗動物中心，許可證號SYXK（鄂）2019-0013。隨機分為野生型組和突變型組，每組8只。預(yù)先將10μg質(zhì)粒溶于2 mL PBS，經(jīng)尾靜脈分別注射野生型和突變型HBV質(zhì)粒，5～8 s內(nèi)注射完畢。每組小鼠再分成2個亞組各4只，分別給予生理鹽水（空白對照）和拉米夫定灌胃處理，連續(xù)3 d。參考文獻(xiàn)報道及前期預(yù)實驗結(jié)果[4-5]，拉米夫定灌胃劑量為500 mg/kg·d，空白對照組小鼠給予相同容量生理鹽水灌胃[6]。

1.3 標(biāo)本留取及處理 灌胃處理3天后處死各組小鼠，留取肝臟標(biāo)本，保存于液氮中待測。抽提小鼠肝臟HBV-DNA復(fù)制中間體，進(jìn)行Southern雜交檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 25.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。HBV復(fù)制水平通過Imagine J進(jìn)行灰度統(tǒng)計分析，計量資料中的HBV-DNA復(fù)制中間體水平為連續(xù)變量，兩組之間的比較均采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 rtM204I突變質(zhì)粒測序 測序結(jié)果顯示，HBV突變質(zhì)粒出現(xiàn)rtM204I位點突變，其他位點序列與野生型質(zhì)粒一致。見圖1。

圖1 拉米夫定耐藥突變株測序圖

2.2 突變質(zhì)粒生物學(xué)特性研究 Southern雜交發(fā)現(xiàn)，兩組小鼠體內(nèi)均檢測到HBV復(fù)制，但突變型組HBV復(fù)制水平較野生型組降低，見圖2，提示rtM204I位點突變影響HBV的復(fù)制能力。

圖2 野生型和YMDD突變型小鼠HBV復(fù)制能力

2.3 拉米夫定處理后兩組HBV-DNA復(fù)制中間體水平比較 野生型組小鼠在拉米夫定灌胃處理后，HBV-DNA復(fù)制中間體水平較空白對照組明顯下降（P＜0.05），表明拉米夫定對野生型HBV-DNA的復(fù)制有很好的抑制作用；但突變型組小鼠給予拉米夫定灌胃后，HBV-DNA復(fù)制中間體水平與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖3，表明rtM204I位點突變影響拉米夫定對HBV-DNA復(fù)制的抑制作用。

圖3 拉米夫定處理后野生型和YMDD突變型小鼠的HBV-DNA復(fù)制中間體水平

3 討 論

乙肝病毒感染導(dǎo)致肝炎、肝硬化及肝癌的發(fā)生，嚴(yán)重威脅人類健康。我國乙肝病毒感染患者群體基數(shù)較大，長期穩(wěn)定地抑制乙肝病毒復(fù)制是延緩慢性乙肝患者病情進(jìn)展的唯一方法，一旦出現(xiàn)耐藥，后續(xù)抗乙肝病毒藥物的選擇變得更加棘手，乙肝耐藥一直是臨床關(guān)注的熱點問題[7]。耐藥突變是指在藥物選擇壓力下，HBV基因組上某些位點發(fā)生突變，導(dǎo)致藥物對HBV的抑制作用減弱或消失[8]。為了進(jìn)行藥物敏感性研究，建立有效的體內(nèi)研究模型尤為重要。拉米夫定為最早應(yīng)用的核苷類抗病毒藥物，其rtM204I位點突變是最早發(fā)現(xiàn)的耐藥突變位點，患者在使用拉米夫定6個月后即可檢測到，用藥2年的檢出率達(dá)25%～40%，且該位點也是恩替卡韋耐藥的重要突變位點，一旦rtM204I位點突變，則恩替卡韋耐藥的風(fēng)險明顯增加，2年耐藥發(fā)生率可達(dá)到16%[9-10]。

YMDD變異主要是rtM204I/V變異，rtM204I/V株較野生株復(fù)制能力低，rtL180M的出現(xiàn)使突變株HBV的復(fù)制接近野生株的水平，故rtM204I/V變異通常與突變rtL180M聯(lián)合出現(xiàn)；180位點的變異能夠使dNTP的結(jié)合位點重排，從而使突變的HBV復(fù)制恢復(fù)到野生株水平，但單獨rtL180M變異并不能引起拉米夫定耐藥[11-12]。本研究單獨對rtM204I突變位點進(jìn)行研究，其突變株的HBV-DNA復(fù)制能力較野生株有所下降，對拉米夫定的敏感性也明顯降低，符合YMDD變異的生物學(xué)特性。然而，單一突變位點的研究有局限性，后續(xù)將進(jìn)一步構(gòu)建rtM204VI+rtL180M聯(lián)合突變位點小鼠模型，研究其相關(guān)生物學(xué)特性。

綜上所述，本研究構(gòu)建乙肝病毒rtM204I突變質(zhì)粒，通過小鼠尾靜脈注射突變質(zhì)粒建立HBV突變小鼠模型，并進(jìn)行HBV-DNA復(fù)制能力及藥物敏感性的檢測，為今后深入開展乙肝病毒突變位點相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。