任洪玥，楊進，劉霞，姚杰，林昌虎，涂成龍,3,*

1. 貴州醫(yī)科大學公共衛(wèi)生與健康學院，貴陽 550025 2. 貴州醫(yī)科大學環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點實驗室，貴陽 550025 3. 貴州醫(yī)科大學毒性檢測中心，貴陽 550025

干擾上述牙源性細胞生理功能及成釉過程的各種因素，都有可能影響牙齒的正常發(fā)育，產(chǎn)生不良后果。目前認為，牙胚發(fā)育過程中持續(xù)過量地氟攝入是導致釉質(zhì)發(fā)育障礙引起氟斑牙發(fā)生的根本原因，但具體發(fā)病機制尚不完全清楚[4]。自由基學說提出，高生物活性的氟化物對成釉細胞抗氧化防御系統(tǒng)的破壞是導致“氟斑牙”呈現(xiàn)釉基質(zhì)蛋白滯留與釉質(zhì)礦化不全的關鍵機制之一[5-8]。而值得注意的是，在我國西南部“燃煤型氟斑牙”病區(qū)環(huán)境中常合并高硫煤系分布，敞爐燃煤致居室內(nèi)空氣污染易出現(xiàn)超國家限量濃度的SO2與含氟煙氣并存的情況。早前有相關研究就該現(xiàn)象進行了動物實驗研究，發(fā)現(xiàn)相較于二者單獨染毒，同時接觸大劑量氟化物與SO2煙氣時大鼠氟斑牙患病程度更嚴重，提示SO2對氟致氟斑牙的過程可能起到加強作用[9]；再有，SO2與氟化物共同暴露時將對雄性大鼠腎及睪丸組織產(chǎn)生更嚴重的損傷[10-11]，更加說明SO2的存在將使氟化物產(chǎn)生更復雜的毒性效應。但以上研究均未就SO2在“氟硫聯(lián)合”過程中發(fā)揮毒作用所涉及的可能機制進行討論。而除了對呼吸系統(tǒng)造成損害外，SO2還可影響多臟器的生理功能，是一種具有多種毒作用的全身性毒物。SO2經(jīng)呼吸道吸收入血后在血液微堿性的環(huán)境中即轉(zhuǎn)變?yōu)槠溲苌铩獊喠蛩猁}和亞硫酸氫鹽(物質(zhì)的量比約為3∶1)，以其衍生物的形式隨血液循環(huán)至全身，對體內(nèi)組織細胞產(chǎn)生毒作用[12]。降低體內(nèi)抗氧化物質(zhì)水平、削弱體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)是SO2發(fā)揮毒作用的關鍵環(huán)節(jié)[13]。因此，本研究以氧化應激為切入點，探討SO2體內(nèi)衍生物對大鼠切牙組織抗氧化防御系統(tǒng)及成釉器細胞絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)信號轉(zhuǎn)導通路關鍵蛋白與AE2蛋白表達的影響，探究其對牙齒發(fā)育相關生理過程的潛在毒性及可能機制，為后續(xù)深入“氟硫聯(lián)合”過程中SO2毒作用的毒理學研究提供實驗資料。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗動物分組及處理

本研究采用SPF級雄性4周齡Wistar大鼠，體質(zhì)量100～120 g，購于長沙市天勤生物技術有限公司，動物許可證編號：SCXK(湘)2019-0013。適應性飼養(yǎng)1周后按體質(zhì)量隨機分5組，即高、中、低二氧化硫衍生物混合液染毒組、生理鹽水對照組、高劑量二氧化硫衍生物混合液+抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)拮抗組，染毒劑量分別為100 mg·kg-1·d-1(1/10LD50)、50 mg·kg-1·d-1(1/20LD50)和25 mg·kg-1·d-1(1/40LD50)，對照組予0.9%氯化鈉注射液，高劑量+NAC組每次腹腔注射前30 min予200 mg·kg-1NAC水溶液灌胃，后與高劑量染毒組進行相同操作，各染毒組均于每日上午9:00行腹腔注射一次，給藥容積為2 mL·kg-1，連續(xù)4周。飼養(yǎng)期間動物自由飲水、攝食，環(huán)境溫度為(22±2) ℃，光照明暗各12 h，相對濕度為(50±10)%。末次給藥后禁食24 h，取相應生物樣本進行實驗。

1.2 主要試劑

亞硫酸鈉(Na2SO3)、亞硫酸氫鈉(NaHSO3)分析純，購自美國Sigma公司，N-乙酰半胱氨酸購自美國Sigma公司，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、還原型谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH)檢測試劑盒購自南京建成生物有限公司，大鼠活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)Elisa測定試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司，AE2兔抗大鼠多克隆抗體購自美國Invitrogen公司，p38 MAPK兔抗大鼠單克隆抗體、p-p38 MAPK兔抗大鼠單克隆抗體、SAPK/JNK兔抗大鼠多克隆抗體、p-SAPK/JNK兔抗大鼠單克隆抗體、ERK1/2兔抗大鼠多克隆抗體、p-ERK1/2兔抗大鼠多克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，Histone H3兔抗大鼠單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗購自北京愛必信生物技術有限公司。

二氧化硫體內(nèi)衍生物混合液的制備。取適量亞硫酸鈉與亞硫酸氫鈉，以3∶1的物質(zhì)的量比溶于0.9%生理鹽水，每日新鮮配制。

1.3 大鼠切牙組織氧化應激相關指標測定

完整分離大鼠雙側(cè)下頜骨及切牙組織，取其中一側(cè)用紗布仔細去除包繞的肌肉及結(jié)締組織后置液氮中研磨成骨粉，并于組織破碎儀中進一步粉碎。取適量骨粉按1∶9的質(zhì)量體積比加入預冷的0.9%生理鹽水制成10%組織勻漿，蛋白含量的測定采用BCA法。按不同測定指標的樣品前處理要求離心后取上清液，依試劑盒說明書檢測切牙組織中MDA、GSH水平及SOD、GSH-Px活性。

1.4 切牙組織ROS水平測定

骨粉的制備同1.3，取適量骨粉按1∶9的質(zhì)量體積比加入預冷的PBS(0.01 mol·L-1, pH=7.4)，冰上充分研磨混勻制成切牙組織勻漿液，5 000×g，離心10 min，取上清液按照試劑盒說明書測定切牙組織ROS水平。

1.5 Western blot法測定大鼠成釉器細胞MAPKs/AP-1信號通路相關蛋白及AE2蛋白表達水平

取前述待用的另一側(cè)大鼠切牙組織，參考Houari等[14]的處理方法，仔細撥開包繞切牙根部的下頜骨，分離出成釉細胞組織，用含PMSF的RIPA裂解液4 ℃勻漿，冰上裂解15 min提取總蛋白，用BCA試劑盒進行蛋白定量，分子量為30～160 kD與12～60 kD的蛋白分別選用8%或12% SDS-PAGE分離膠進行電泳分離，轉(zhuǎn)膜后5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，磷酸化蛋白用5% BSA封閉液封閉1 h，分別加入適量AE2抗體(1∶1 000)、p38 MAPK抗體(1∶1 000)、p-p38 MAPK抗體(1∶1 000)、SAPK/JNK抗體(1∶1 000)、p-SAPK/JNK抗體(1∶1 000)、ERK1/2抗體(1∶1 000)、p-ERK1/2抗體(1∶1 000)及β-actin抗體(1∶2 000) 4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗膜10 min共3次，1∶4 000倍稀釋二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜10 min共3次，ECL顯色液顯影，凝膠成像系統(tǒng)掃描并檢測蛋白條帶密度。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果(Results)

2.1 二氧化硫體內(nèi)衍生物混合液對大鼠切牙組織抗氧化防御系統(tǒng)的影響

與對照組比較，中、高劑量組大鼠切牙組織SOD、GSH-Px活性和GSH水平下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；MDA、ROS水平升高(P<0.05)。與高劑量組比較，高劑量+NAC組SOD和GSH-Px活性升高，GSH水平上升，MDA、ROS含量下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，如表1所示。

表1 二氧化硫體內(nèi)衍生物對大鼠切牙組織抗氧化防御系統(tǒng)相關指標的影響Table 1 Effects of sulfur dioxide derivatives on indexes of antioxidant defense system of rat incisor tissue n=6)

2.2 二氧化硫體內(nèi)衍生物對大鼠成釉器細胞MAPKs/AP-1信號通路相關蛋白表達的影響

如圖1所示，低、中、高劑量組及高劑量+NAC組大鼠成釉器細胞p-p38 MAPK/p38 MAPK及p-ERK/ERK改變較對照組均無顯著差異。而低劑量組大鼠成釉器細胞JNK磷酸化水平改變較對照組無顯著差異，中、高劑量組磷酸化JNK/JNK水平較對照組升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且經(jīng)趨勢性檢驗，JNK磷酸化水平升高趨勢表現(xiàn)出二氧化硫衍生物染毒劑量依賴性(F=158.58，P<0.05)。與高劑量組比較，高劑量+NAC組磷酸化JNK/JNK水平顯著降低(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 二氧化硫體內(nèi)衍生物對大鼠切牙成釉器細胞MAPKs信號通路關鍵蛋白表達的影響注：(a)MAPKs信號通路關鍵蛋白蛋白免疫印跡條帶；(b)成釉器細胞MAPKs信號通路關鍵蛋白相對表達水平；A對照組，B高劑量組，C中劑量組，D低劑量組，E高劑量+NAC組；與對照組比較，# P<0.05；與高劑量組比較，*P<0.05；n=3。Fig. 1 Effects of sulfur dioxide derivatives on expression of key proteins in MAPKs signaling pathway of rat incisor enamel organ cellsNote: (a) Immunoblotting bands of key proteins in MAPKs signaling pathway; (b) Relative expression of key proteins in MAPKs signaling pathway; A means control group, B means high-dose group, C means medium-dose group, D means low-dose group, and E means high dose+NAC group; # P<0.05 vs control group; *P<0.05 vs high-dose group; n=3.

如圖2所示，與對照組比較，中、高劑量組大鼠成釉器細胞胞漿中c-Fos、c-Jun蛋白水平較對照組明顯下降(P<0.05)，核內(nèi)c-Fos、c-Jun蛋白水平明顯上升(P<0.05)，提示高劑量組AP-1蛋白發(fā)生核轉(zhuǎn)位。而高劑量+NAC組AP-1蛋白核轉(zhuǎn)位較高劑量組顯著減少(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。低劑量組較對照組核內(nèi)c-Fos蛋白水平升高，但總體AP-1蛋白核漿分布改變無明顯差異。

圖2 二氧化硫體內(nèi)衍生物對大鼠切牙成釉器細胞胞質(zhì)及胞核中c-Fos與c-Jun蛋白表達的影響注：(a)胞質(zhì)中c-Fos與c-Jun蛋白相對表達水平；(b)胞核中c-Fos與c-Jun蛋白相對表達水平；A對照組，B高劑量組，C中劑量組，D低劑量組，E高劑量+NAC組；與對照組比較，# P<0.05；與高劑量組比較，*P<0.05；n=3。Fig. 2 Effects of sulfur dioxide derivatives on expression of c-Fos and c-Jun protein in cytoplasm and nucleus of rat incisor enamel organ cellsNote: (a) Relative expression of c-Fos and c-Jun protein in cytoplasm; (b) Relative expression of c-Fos and c-Jun protein in nucleus; A means control group, B means high-dose group, C means medium-dose group, D means low-dose group, and E means high dose+NAC group; # P<0.05 vs control group; *P<0.05 vs high-dose group; n=3.

2.3 二氧化硫體內(nèi)衍生物對大鼠成釉器細胞AE2蛋白表達水平的影響

如圖3所示，中、高劑量組AE2蛋白表達較對照組升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且經(jīng)趨勢性檢驗，升高趨勢表現(xiàn)出二氧化硫衍生物染毒劑量依賴性(F=530.167，P<0.05)。與高劑量組比較，高劑量+NAC組AE2蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。

3 討論(Discussion)

機體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)主要由抗氧化酶類和抗氧化劑構成，它們之間相互協(xié)同、相互代償共同發(fā)揮維持機體氧化與抗氧化動態(tài)平衡的作用。體內(nèi)氧化與抗氧化之間的平衡狀態(tài)被打破可誘導產(chǎn)生各種自由基引起組織氧化損傷，導致細胞功能異常甚至凋亡，從而對多種臟器造成損害[15]。已有多項研究表明，二氧化硫及其衍生物可引起大、小鼠腦、肺、心、肝、脾、腎、胃、腸和睪丸等組織抗氧化物質(zhì)含量減少，SOD、GSH-Px和過氧化氫酶(catalase, CAT)等抗氧化酶活性改變，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物含量增加[16-19]?？梢?，降低體內(nèi)抗氧化物質(zhì)水平、削弱體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)是二氧化硫及其衍生物發(fā)揮毒作用的關鍵環(huán)節(jié)之一。基于此，本研究通過亞急性腹腔注射二氧化硫體內(nèi)衍生物構建動物染毒模型，觀察二氧化硫衍生物對大鼠切牙組織抗氧化防御系統(tǒng)的影響。結(jié)果顯示，相較于對照組，中、高劑量染毒組大鼠切牙組織GSH含量、SOD活性和GSH-Px活性下降，同時，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA、ROS水平顯著上升，而預先給予活性氧抑制劑NAC再予高劑量二氧化硫衍生物時，大鼠切牙組織抗氧化防御系統(tǒng)各項指標均較單獨施予高劑量二氧化硫衍生物而言有了明顯改善，表明二氧化硫體內(nèi)衍生物可引起切牙組織細胞抗氧化防御系統(tǒng)紊亂，活性氧自由基蓄積，這與其他學者在大鼠心、肝、肺和腎等主要臟器組織中觀察到的結(jié)果類似。

圖3 二氧化硫體內(nèi)衍生物對大鼠切牙成釉器細胞AE2蛋白表達的影響注：A對照組，B高劑量組，C中劑量組，D低劑量組，E高劑量+NAC組；與對照組比較，# P<0.05；與高劑量組比較，*P<0.05；n=3。Fig. 3 Effect of sulfur dioxide derivatives on the expression of AE2 protein in incisor enamel organ of ratsNote: A means control group, B means high-dose group, C means medium-dose group, D means low-dose group, and E means high dose+NAC group; # P<0.05 vs control group; *P<0.05 vs high-dose group; n=3.

圖4 二氧化硫體內(nèi)衍生物通過ROS/JNK/AP-1通路誘導成釉細胞AE2蛋白表達潛在機制示意圖注：CA表示碳酸酐酶。Fig. 4 Schematic diagram of the potential mechanism of internal sulfur dioxide derivatives inducing AE2 protein expression in ameloblasts through ROS/JNK/AP-1 pathwayNote: CA stands for carbonic anhydrase.

綜上，二氧化硫衍生物可激活大鼠切牙組織氧化應激并主要通過ROS/JNK/AP-1信號通路誘導成釉器細胞AE2蛋白表達上調(diào)，具有影響切牙細胞生理功能進而干擾牙齒正常形成與發(fā)育的潛能。這提示我們，在氟合并硫高背景地區(qū)“燃煤型氟斑牙”的產(chǎn)生可能具有更復雜的影響因素，因此，進一步深入探討二氧化硫的這一“潛能”在“燃煤型氟斑牙”的形成過程中所發(fā)揮的作用，氧化應激與AE2在其中扮演了何種角色及此過程涉及的具體機制等問題將有助于從全新角度推進“燃煤型氟斑牙”患病機制的基礎性研究。