付瑩瑩，張 萍，鄭大威，林太鳳，王惠琴，吳西浩，宋佳宸

北京工業(yè)大學環(huán)境與生命學部，北京 100124

引 言

表面增強拉曼光譜(surface-enhanced Raman spectroscopy,SERS)技術是基于被測分子吸附在某些經特殊處理、具有納米結構的金屬表面，并且有極強拉曼散射增強效應的分子振動光譜技術[1]，其廣泛應用于生命科學、材料科學、環(huán)境科學、分析化學等領域。SERS活性基底的制備是SERS研究領域的熱點，高活性SERS基底的發(fā)展不僅可以拓寬其應用范圍，還可以作為SERS理論模型，不斷推動該技術的發(fā)展。為了獲得最佳SERS信號，對具有特殊性能的SERS活性基底的需求一直很大[2]。SERS活性納米結構可以分為兩種類型的基底：膠體基底和固體表面基底。目前，針對于金屬膠體主要通過合成各種形貌和尺寸的貴金屬納米結構來實現對待測物的SERS檢測[3]。剛性SERS固體活性基底一般采用化學刻蝕法[4]、電子束刻蝕[5]等方法刻蝕納米陣列，可以獲得很高的增強因子和光譜重復性，但通常造價昂貴，制備工藝較復雜。

目前，SERS納米基底的研究已逐漸從傳統(tǒng)的基于剛性基板的SERS轉移到了新興的柔性SERS技術上[6]，柔性的SERS固體活性基底采用物理氣相沉積法[7]等制備，但此類基底制備復雜操作繁瑣，不適合在實際檢測中的應用。紙基作為最常見的柔性SERS活性基底[8]，其表面具有分級多孔交錯排列的3D結構，金屬納米粒子可附著在表面，保持基底有足夠的“熱點”，從而形成SERS活性基底[9]。紙基SERS活性基底制備過程簡單，易操作，有良好的柔韌性可剪裁成各種形狀進行檢測，并且紙基的成本低廉，可大批量制備。常見的制備方法包括浸泡法[10,14]、噴墨打印法和絲網印刷法[11-13]等。He[13]等利用靜電紡絲技術在鏈狀排列的聚乙烯醇納米纖維中組裝高SERS活性的銀二聚體或定向聚集體，成功設計并合成了一種獨立的柔性SERS基底，從而顯著提高了SERS對4-巰基苯甲酸(4-MBA)分子的高敏感性，其增強因子高達109。Dalla[14]等用浸涂法將Au和Ag附著在濾紙上，探索一系列參數(膠體溶液濃度、濾紙孔隙度、聚合劑存在)的改變對紙基SERS活性基底性能的影響結果。Wang[15]等在聚乙烯醇吡咯烷酮(PVP)的作用和輔助下，利用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)對AgNO3的還原，制備了銳邊為20 nm的三角形Ag納米顆粒，然后將Ag納米三角形附著到濾紙上，獲得了具有良好活性和重復性的柔性SERS基底，實現了對10-8mol·L-1濃度的對氨基噻吩酚(PATP)的超痕量檢測。但上述方法耗時長，對原輔料的加工有嚴格的要求把控，并且對于實際應用的操作也較為復雜及繁瑣。Nylon柔性膜與紙類似，其表面也具有分層、多孔結構，Nylon柔性膜具有性質穩(wěn)定，可長期儲存等優(yōu)點，納米顆?？梢粤己玫馗街贜ylon柔性膜表面，另外Nylon柔性膜的親水性、大通量、流速快等性能，使得在制備過程中操作簡單并且流暢；在SERS活性基底的檢測過程中，Nylon柔性膜中溶劑殘留少和蛋白吸附力低的特點，可減少其他物質對實驗的影響。本研究以 Nylon柔性膜作為柔性材料，利用固相萃取過濾裝置，將金納米顆粒均勻地附著在Nylon柔性膜上，制備Au-Nylon柔性膜基底。同時，以結晶紫CV作為探針分子，研究了Au-Nylon柔性膜基底的SERS活性、均勻性及檢測限，并對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)進行SERS檢測，驗證其在生物樣品SERS檢測的適用性，為SERS活性基底的研究提供新穎的思路與方法。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

便攜式激光拉曼光譜儀(RamTracer-200，歐普圖斯光學納米科技有限公司)，激發(fā)波長785 nm，激發(fā)功率250 mW；紫外-可見-近紅外分光光度計(UH4150，日本日立公司)；場發(fā)射掃描電子顯微鏡(F50，日本電子公司)；恒溫震蕩培養(yǎng)箱(NB-205V，韓國 N-BIOTEK公司)；集熱式恒溫加熱攪拌器(DF-101S，上海邦西儀器科技有限公司)。

氯金酸(HAuCl4·4H2O)、硝酸(HNO3)均購自國藥集團化學試劑有限公司；檸檬酸三鈉(C6H5Na3O7)購自美國Alfa Aesar公司；鹽酸(HCl)購自北京化工廠；Nylon柔性膜來自艾杰爾公司；S.aureus購買自中國普通微生物菌種保藏管理中心；胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(tryptone soy broth,TSB)和營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(nutrient broth,NB)購自北京陸橋技術股份有限公司；結晶紫(crystal violet,CV)和羅丹明(R6G)購自Amresco公司；實驗用水均為Millipore (Direct-Q 8UV-R)所制超純水(18.2 mΩ)。

1.2 金溶膠的制備

采用Lee和Meisel[16]的合成方法，以檸檬酸鈉為還原劑制備金溶膠溶液于100 mL三口圓底燒瓶中。首先吸取50.00 mL質量分數為0.01%的氯金酸溶液中加熱攪拌至微沸20 min，然后再加入0.20 mL質量分數為1%的檸檬酸鈉溶液，繼續(xù)攪拌并保持微沸30 min，當溶液變?yōu)榫萍t色時，停止加熱，自然冷卻至室溫，避光儲存于4 ℃冰箱保存，備用。

1.3 Au-Nylon柔性膜基底的制備

將注射器連接裝有單位面積1 cm2的Nylon柔性膜的過濾頭，另一端連接在固相萃取裝置，注射器中加入金溶膠，抽濾，控制流速為1 mL·min-1，然后將Nylon柔性膜取出，置于冷凍干燥機中，冷凍干燥1 h，取出備用(圖1)。依據上述操作，按表1處理1～2次，制備不同條件的Au-Nylon柔性膜基底。

表1 Au-Nylon柔性膜基底的制備條件Table 1 Preparation conditions of Au-Nylon flexible film substrate

圖1 Au-Nylon柔性膜基底的制備流程Fig.1 Preparation process of Au-Nylon flexible film substrate

1.4 樣品

S.aureus菌液樣品制備：將S.aureus接種于TSB培養(yǎng)基中，37 ℃，110 r·min-1震蕩培養(yǎng)約4 h，使用紫外-可見-近紅外分光光度計測定OD(600 nm)為1時，停止培養(yǎng)，備用，此時細菌數量約為109。

結晶紫溶液的制備：準確稱取0.02 g結晶紫(CV)，用去離子水配制成濃度為1×103mol·L-1的儲備液，再逐級稀釋到濃度為1×10-3，2.5×10-5，1×10-5，1×10-6，5×10-7及1×10-7mol·L-1的CV使用液，備用。

羅丹明溶液的制備：準確稱取0.02 g羅丹明(R6G)，用去離子水配制成濃度為1×103mol·L-1的儲備液，再將濃度稀釋到1×10-6的羅丹明使用液，備用。

2 結果與討論

2.1 Au-Nylon柔性膜基底的表征

利用掃描電子顯微鏡對按表1中不同條件制備的Au-Nylon柔性膜基底進行表征，探究金納米顆粒在Nylon柔性膜上的分布情況。不同金納米顆粒的附著量和與膜結合次數對金納米顆粒在Nylon柔性膜分布呈規(guī)律性的變化，由圖2(a)所示?？瞻譔ylon柔性膜是多孔交錯排列的結構，其表面沒有球形顆粒物，而Cond A—D的SEM圖可以看出Nylon表面均有附著不同數量的金納米顆粒，Nylon附著金顆粒的量隨著金溶膠過濾量增加而增加(見Cond A和Cond B)，其較均勻地分布在纖維上。從Cond A與Cond C之間、Cond B與Cond D之間的SEM圖可以看出，Cond C和Cond D表面有大量的金納米顆粒，隨著與膜結合次數的增加Nylon表面的金顆粒明顯增多，通過SEM觀察出大量的金納米顆粒覆蓋在Nylon柔性膜的表面，并且Cond C表面的金納米顆粒比Cond D分布更均勻，Cond D表面的金納米顆粒出現較為明顯的團聚現象。同時，研究還發(fā)現當金溶膠總量一定時，與膜結合次數增加，附著在Nylon柔性膜表面的金納米顆粒也明顯增加(Cond B和Cond C)。由此可見，前一次處理后的Nylon纖維和其表面附著的金納米顆粒形成了新的活性截留層，能使再次結合的溶膠中金顆粒更好地附著在表面。由于SERS檢測主要針對表面進行，所以在Nylon柔性膜表面附著更多的金顆粒更有利于待測物的SERS檢測。

圖2 Au-Nylon柔性膜基底的SEM(a)、EDS(b)及紫外-可見-近紅外光譜圖(c)Fig.2 SEM (a),EDS (b)and UV-Vis-NIR (c)spectra of Au-Nylon flexible film substrate

為驗證Au-Nylon柔性膜基底主要成分和含量，選擇金納米顆粒附著較為均勻的Cond C樣品進行光電子能譜(EDS)測試，如圖2(b)可知，Au-Nylon柔性膜基底表面覆蓋了大量金納米顆粒，Au的相對含量為75.41%，其他O，N和C元素相對含量低。

圖2(c)是金溶膠溶液及Au-Nylon柔性膜基底的紫外-可見-近紅外光譜圖，從圖中可以看出金溶液的等離子共振吸收峰在535 nm，而Au-Nylon柔性膜基底的最強等離子共振吸收峰發(fā)生了藍移，出現在512 nm。這可能是由于金納米顆粒所處的環(huán)境發(fā)生變化，金納米顆粒與Nylon柔性膜發(fā)生了耦合反應，金納米顆粒受到一定的束縛造成的。Au-Nylon柔性膜基底的最大吸收高于金溶膠，這是主要由于在Au-Nylon柔性膜基底的金納米顆粒的含量高于金溶膠，單位面積的金納米顆粒數增大，可能會提高金納米顆粒與被測物的碰撞幾率，更有利于SERS信號的增強。

2.2 復合膜的SERS表征

不同方法制備的Au-Nylon柔性膜基底，其表面的金納米顆粒分布有很大的差異。為了研究這些差異是否對Au-Nylon基底的SERS活性產生影響，實驗以10-5mol·L-1的CV溶液作為探針分子，進行Au-Nylon的SERS活性檢測，結果如圖3(a)所示。從圖中可以看出，Cond B的SERS信號明顯強于Cond A，隨著金溶膠體積的增加，Nylon柔性膜附著的金顆粒的增多，使得Au-Nylon對CV的SERS活性更好。同時，兩次處理后的Au-Nylon(Cond C和Cond D)的SERS活性明顯好于單次處理的Au-Nylon(Cond A和Cond B)。值得注意的是，金溶膠總體積一致時，Cond C(1 mL·次-1，2次)的SERS信號比Cond A(2 mL·次-1，1次)有明顯增強，分析認為兩次處理后的金納米顆粒主要附著在Nylon柔性膜表面[見圖3(a)]，說明Au-Nylon表面的金納米顆粒對SERS信號的增強起主導作用。附著在Nylon柔性膜表面上的金納米顆粒會形成一些SERS“熱點”，這些SERS“熱點”的形成是由于金納米顆粒之間的聚集，納米顆粒間形成納米間隙，導致顆粒之間的耦合作用增強，從而提供的“熱點”逐漸增多；但當金納米顆粒過飽和時，影響了“熱點”的分布，金納米顆粒之間的納米間隙發(fā)生改變，使得SERS信號減弱[17]。因此，盡管Cond D的Au-Nylon表面的金納米顆粒多于Cond C的Au-Nylon基底，但是由于表面金納米顆粒過多而發(fā)生聚集，影響“熱點”的形成，使得Cond D的SERS活性反而弱于Cond C的SERS活性。

圖3 不同制備條件的Au-Nylon柔性膜基底對CV探針分子的SERS檢測(a)及 Nylon柔性膜和Au-Nylon柔性膜基底對CV探針分子和R6G探針分子的SERS譜圖(b)Fig.3 SERS spectra of Au-Nylon flexible membrane substrate at different conditions on CV probe molecules (a)and SERS spectra of Au-Nylon flexible membrane substrate and Nylon flexible membrane on CV probe molecules and R6G probe molecules (b)

2.3 Au-Nylon柔性膜基底的SERS的檢測限及增強因子

為測試Au-Nylon柔性膜基底的SERS檢測限，實驗將濃度為2.5×10-5，1×10-5，1×10-6，5×10-7及1×10-7mol·L-1的CV探針分子溶液滴加在Au-Nylon柔性膜基底上，然后進行SERS檢測，結果如圖4(a,b)所示。結果表明，隨著CV探針分子溶液濃度的降低，CV探針分子在Au-Nylon柔性膜基底上的SERS信號強度逐漸降低，當CV溶液的濃度低至1×10-7mol·L-1時，CV探針分子的特征SERS信號幾乎檢測不到，說明Au-Nylon柔性膜基底可以檢測到5×10-7mol·L-1的CV探針分子，不同濃度CV的1 171 cm-1處的拉曼峰強與濃度之間呈現正相關關系，相關系數達到0.916。

圖4 Au-Nylon柔性膜基底對CV溶液定量分析(a)和1 171 cm-1處峰強與濃度線性關系(b)的SERS檢測極限圖譜Fig.4 Quantitative analysis of CV solution with Au-Nylon flexible membrane substrate (a)and linear relationship between peak strength and concentration at 1 171 cm-1 (b)

對Au-Nylon柔性膜基底的增強因子(enhancement factor,EF)進行計算[19]，見式(1)

EF=(ISERS/cSERS)/(Iref/cref)

(1)

式(1)中，ISERS和cSERS分別表示吸附在基底上的CV探針分子的SERS信號強度和濃度。Iref和cref分別表示吸附在錫紙基底上的CV探針分子的非SERS的散射強度和濃度。以本基底檢測CV溶液濃度1.0×10-6mol·L-1作為cSERS，以非SERS散射檢測CV溶液的最低濃度103mol·L-1作為cref。選用1 171 cm-1處的拉曼峰的強度來計算EF。經計算Au-Nylon柔性膜基底的SERS增強因子為1×104。

2.4 Au-Nylon柔性膜基底的均一性與重復性分析

金納米顆粒均勻的分布在SERS活性基底表面會產生更多的SERS“熱點”，因此Au-Nylon柔性膜基底的均一性對待測樣品的SERS檢測有著重要的實際意義[17]。為了研究所制備的Au-Nylon柔性膜基底的均勻性，實驗將5×10-7mol·L-1的CV溶液滴加在Au-Nylon柔性膜基底上，隨機選取15個不同的點進行SERS檢測，圖5(a)為15個點SERS譜圖，不同顏色表明Au-Nylon柔性膜基底的SERS強度。結果表明，隨機選取的15個點的CV探針分子SERS圖譜的峰形和特征峰的強度基本一致，不同拉曼峰均在相同峰強區(qū)域，特征峰1 171 cm-1處的SERS強度大部分處于藍色區(qū)域。進一步的對Au-Nylon柔性膜基底的均勻性進行研究，統(tǒng)計并分析特征峰1 171 cm-1處的SERS信號強度，結果如圖5(b)所示，15個不同點在1 171 cm-1處的SERS信號強度的RSD為11.8%，進一步說明研究中所制備的Au-Nylon柔性膜基底具有較好的均勻性。

圖5 15個不同點 的SERS圖譜(a);CV在1 171 cm-1處的柱狀體(b)Fig.5 SERS collected from 15 different points (a);Histogram of the peak of CV at 1 171 cm-1 (b)

批間重復性也是評價SERS基底的一個重要指標。本實驗制備5批Au-Nylon柔性膜基底，以10-5mol·L-1的CV作為探針分子，探索基底的不同批次的重復性，圖6展示了5批Au-Nylon柔性膜基底對CV進行SERS測試的拉曼光譜圖(其中每一批均為重復測定了10次后的平均譜圖)，表2為CV的特征峰(798，913，1 171和1 296 cm-1)的峰強RSD，結果顯示不同批次CV特征峰的相對標準偏差(RSD)約為15%，因此不同批次可擦拭柔性SERS基底有著良好的重現性。

圖6 Au-Nylon柔性膜基底(5批)對CV的SERS譜圖Fig.6 SERS diagram of Au-Nylon flexible membrane substrate (5 batches)for CV

表2 不同批次的Au-Nylon柔性膜基底對CV的RSD分析Table 2 RSD analysis of different batches of Au-Nylon flexible membrane substrates for CV

2.5 Au-Nylon柔性膜基底在細菌SERS檢測中的應用

Nylon柔性膜具有對蛋白吸附力低，在檢測細菌時減少了其他蛋白物質對SERS結果的影響。為了探究Au-Nylon柔性膜基底對細菌的SERS檢測能力，將金溶膠和Au-Nylon柔性膜基底對S.aureus的SERS檢測進行對比，結果見圖7。結果表明，空白Nylon柔性膜和Au-Nylon柔性膜基底的本底SERS信號較弱，對檢測無影響；Au-Nylon柔性膜基底對S.aureus的SERS信號有明顯的增強，且峰型清晰并高于液體金溶膠對S.aureus的增強作用。從圖7可以看出S.aureus的特征峰主要有734，962，1 031，1 235，1 314，1 350和1 460 cm-1，與Zheng等[20]的研究結果基本相吻合。由此可見，本方法所制備的SERS活性基底，可以很好地響應細菌的拉曼特征信息，具有微生物SERS檢測的應用前景。

圖7 金溶膠、Nylon柔性膜以及Au-Nylon柔性膜基底對S. aureus的SERS圖譜Fig.7 SERS spectra of S. aureus with gold colloid,Nylon film and Au-Nylon flexible film substrate

3 結 論

利用固相萃取過濾裝置，將金納米顆粒均勻的附著在Nylon柔性膜上，制備了Au-Nylon柔性膜基底。以掃描電子顯微鏡作為表征技術，以結晶紫CV為SERS探針分子，對Au-Nylon柔性膜基底的結構及SERS性能進行分析，發(fā)現Nylon纖維與其所附著的金納米顆粒形成新的活性截留層，將再次處理的金納米顆粒均勻地附著在柔性膜表面，形成SERS“熱點”，提高了Au-Nylon柔性膜基底的SERS活性，Au-Nylon柔性膜基底對CV的檢測極限達到5×10-7mol·L-1，增強因子達到1×104。同時，Au-Nylon柔性膜基底具有較好的均勻性，相對平均偏差為11.8%。此外，Au-Nylon柔性膜基底能對金黃色葡萄球菌(S.aureus)進行SERS檢測，且SERS性能高于液體金溶膠。綜上所述，Au-Nylon柔性膜基底具有良好的均一性和重復性，并具有較好的SERS活性，該方法具有簡單且易批量制備的優(yōu)點，無論在化合物檢測還是微生物檢測中都具有良好的實際應用價值。