林銀花 馮冉冉 馮琳琳 孫勇 王蕾

262100 山東省安丘市人民醫(yī)院兒科1，山東濰坊

272000 濟寧市第一人民院新生兒科2，山東濟寧

271000 泰安市中心醫(yī)院兒科3，山東泰安

266000 青島西海岸新區(qū)人民醫(yī)院4，山東青島

癲癇是一種神經(jīng)系統(tǒng)類疾病，極其具有破壞性，嬰幼兒、兒童是高發(fā)人群。相關(guān)醫(yī)學(xué)統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示[1]，癲癇的終身患病率為1%，兒童、中老年人是高發(fā)人群，現(xiàn)階段，在全球范圍內(nèi)，診斷有癲癇存在的病例數(shù)達到了240萬人左右。1 d以上發(fā)生至少3次無端發(fā)作病史、10年內(nèi)有60%以上并發(fā)可能性存在是臨床診斷癲癇過程中采用的傳統(tǒng)依據(jù)[2]。本研究分析了兒童癲癇患兒血清外泌體中miR-155 的表達及臨床意義，現(xiàn)報告如下。

資料與方法

選取2020年2月-2021年2月癲癇患兒50例，作為癲癇組，另選取同期健康體檢兒童50 例，作為健康組。癲癇組女23例(46.00%)，男27例(54.00%)；年齡2～14 歲，平均(8.32±1.42)歲。健康組女22 例(44.00%)，男28 例(56.00%)；年齡3～15 歲，平均(8.62±1.62)歲。兩組患兒一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)過倫理委員會批準(zhǔn)，且患兒家屬均簽署知情同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)核磁共振成像(MRI)、頭部電子計算機斷層掃描(CT)等影像學(xué)檢查確診為原發(fā)性癲癇[3]；②距離最近一次發(fā)作時間均在1 周以內(nèi)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①有腦梗死、腦發(fā)育畸形等器質(zhì)性病變；②有癲癇家族史；③近期有腦外傷。

方法：①血清標(biāo)本收集：清晨將兩組兒童的5 mL靜脈血采集下來，放置在室溫下，3 h內(nèi)離心10 min，速率3 000 r/min，將上清液吸取出來，在EP 管中放置，并保存在-80℃的冰箱中。②血清外泌體提?。簭?80℃冰箱中拿出血清，在冰上放置溶解，充分溶解血清后用無RAN酶槍頭將800 μL從每份血清中吸取出來，向1.5 mL EP管(無RNA 酶)中轉(zhuǎn)移。在4℃的溫度下以300 r/min的速率離心10 min，將分離的細胞除去。將上清液收集起來，用0.22 μ m Merck Millipore濾膜過濾，將污染的細胞碎片、微囊小泡、凋亡體除去。用Optima TM L-80XP Ultracentrifuge，Beckman Coulter 離心機分離澄清的上清液，在4℃的溫度下以100 000 g/min 的速率離心1.5 h。制作外泌體為小球。小心除去上清液，合并包含外泌體的小球并在1 mL的冰PBS中重懸，然后進行第二次超速離心，在4℃的溫度下以100 000 g/min的速率離心1.5 min，旋轉(zhuǎn)體類型同上，在500 μL PBS中重懸產(chǎn)生的外泌體小球。③外泌體miR-155表達測定：運用qRT-PCR法，首先提取外泌體miRNA，依據(jù)血清miRNA 提取試劑盒說明書將血清外泌體miRNA 提取出來，用Nanodrop 對miRNA 濃度進行測定。然后進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄miRNA為cDNA，程序為在37℃、85℃的溫度下分別逆轉(zhuǎn)錄1 h、5 min，在42℃溫度下5 min結(jié)束逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后第一時間取出cDNA 產(chǎn)物，以較快的速度在冰上放置冷卻，在冰上進行所有后續(xù)步驟，不能隨便從冰上移走cDNA。最后運用探針法制備定量PCR 反應(yīng)mix。10倍稀釋上述步驟產(chǎn)生的cDNA，在專用PCR 管中放置，將10μL 2×real-time PCR Master Mix+0.4μL Gene specific Primer set+0.2μL Gene specific Probe+0.2 μL Taq DNA polymerase(5 U/μL)+2.0μL RT product+7.2 μL ddH2o (RNase-free)組成的反應(yīng)體系配制出來。qRT-PCR反應(yīng)程度為在95℃、95℃、62℃的溫度下分別預(yù)變性、變性、退火延伸3 min、12 s、12 s，退火延伸過程中將熒光信號采集下來。將內(nèi)參設(shè)定為U6，將三個復(fù)孔在每個樣品中設(shè)立出來，目標(biāo)基因的相對表達量用2-△△Ct表示。

觀察指標(biāo)：①兩組兒童血清外泌體miR-155表達水平；②兒童癲癇早期診斷中miR-155的價值。采用SPSS 軟件繪制ROC 曲線，敏感度、1-特異度分別為縱坐標(biāo)、橫坐標(biāo)。

統(tǒng)計學(xué)方法：數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析；計量資料用(±s)表示，比較采用t檢驗，重復(fù)測量的計量資料進行方差分析；計數(shù)資料以(%)表示，比較采用χ2檢驗；兒童癲癇早期診斷中miR-155 的價值評定用受試者工作特征曲線(ROC)及曲線下面積(AUC)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

兩組兒童血清外泌體miR-155表達水平比較：癲癇組血清外泌體miR-155表達水平為(2.25±0.32)nm，高于健康組的(1.14±0.30)nm，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

兒童癲癇早期診斷中miR-155 的價值分析：AUC=0.811，診斷臨界值為1.490 時，敏感度、特異度分別為83.30%、7.00%。見圖1。

圖1 miR的ROC曲線

討 論

癲癇屬于一種神經(jīng)系統(tǒng)性疾病，兒童是高發(fā)人群。世界衛(wèi)生組織資料顯示，國際上240 萬/年確診癲癇病例中，小兒癲癇占約70%[4]。在兒童癲癇的診斷中，雖然基因檢測、腦電圖、腦成像等技術(shù)具有輔助診斷價值，但是仍然具有偏高的誤診率[5]。在腦部疾病的診斷中，miRNA 是一種新型潛在生物標(biāo)志物，內(nèi)源性核糖核酸酶不會對其造成不良影響。相關(guān)醫(yī)學(xué)研究表明，血清miRNA 在癲癇患者中變化明顯[6]。外泌體是納米級囊泡，主要由脂類雙分子膜包裹形成，能夠?qū)?0～100 nm 直徑的各類細胞分泌出來，攜帶脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、miRNA 等物質(zhì)，將對廢物進行管理、細胞內(nèi)通訊、將各方面凝聚起來等作用發(fā)揮出來。

相關(guān)醫(yī)學(xué)學(xué)者以上述理論為指導(dǎo)，對小兒癲癇診斷中血清外泌體miR-155 的應(yīng)用價值進行了探討，發(fā)現(xiàn)血清外泌體miR-155 微囊泡直徑在30～100 nm，能夠?qū)⑿喊d癇患兒血清中成功將外泌體分離出來。同時，小兒癲癇組患兒的血清外泌體miR-155 水平顯著高于健康兒童。此外，去除外泌體后血清懸浮液中miR-155 含量也在極大程度上上調(diào)。實時定量PCR 方法證實，小兒癲癇患兒具有較高的血清外泌體miR-155 表達，能夠?qū)⒂辛σ罁?jù)提供給臨床診斷工作[7-8]。本研究結(jié)果表明，癲癇組患兒的血清外泌體miR-155 表達水平高于健康組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。采用SPSS軟件將ROC 曲線繪制出來，敏感度、1-特異度分別為縱坐標(biāo)、橫坐標(biāo)。AUC=0.811，診斷臨界值為1.490 時，敏感度、特異度分別為83.30% 、7.00%，和上述研究結(jié)果一致，說明在小兒癲癇診斷中，血清外泌體miR-155 分離鑒定與表達能夠?qū)⒂行б罁?jù)提供給臨床。

綜上所述，兒童癲癇患兒血清外泌體中miR-155表達升高，能夠為臨床早期診斷兒童癲癇提供有效依據(jù)，其可能在癲癇的發(fā)病中參與，在表達超過1.490時，提示可能發(fā)生癲癇。