王慧俐 鄭曉冬

(1浙江特殊教育職業(yè)學(xué)院藝術(shù)系，浙江 杭州 310023； 2浙江大學(xué)食品生物科學(xué)技術(shù)研究所，浙江 杭州 310058)

櫻桃番茄(LycopersiconesculentumMill.)起源于南美洲，其果實(shí)色澤鮮亮，酸甜可口，富含谷胱甘肽、番茄紅素、類(lèi)黃酮和蘆丁等活性物質(zhì)[1-4]，具有抗氧化、抗癌和防治心血管疾病等作用[5-6]，深受消費(fèi)者喜愛(ài)。但因其果實(shí)皮薄汁多，采后呼吸作用旺盛，在貯運(yùn)過(guò)程中易因機(jī)械損傷和病原菌侵染而引起腐爛變質(zhì)，從而影響商品價(jià)值。目前，櫻桃番茄采后保鮮方法主要有冷藏、氣調(diào)貯藏、保鮮劑處理、精油處理及生物拮抗劑處理等[7-10]，同時(shí)已有研究表明影響果實(shí)采后耐貯性最關(guān)鍵的因素是果實(shí)采收時(shí)的品質(zhì)[11-12]。因此，研究采前技術(shù)措施以提高櫻桃番茄果實(shí)品質(zhì)、延長(zhǎng)貯藏期及提高果實(shí)采后抗性具有非常重要的意義。

印度梨形孢(Piriformosporaindica)是從印度塔爾沙漠中分離到的一種內(nèi)生真菌。它能定殖于多種植物的根部，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，改善品質(zhì)，并能誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性，增強(qiáng)植物抗逆性[13-18]。印度梨形孢和番茄互惠共生，能促進(jìn)番茄植株的生長(zhǎng)，提高番茄對(duì)早疫病、黃萎病和番茄黃化曲葉病毒(tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)等的抗性[19-22]。但目前鮮見(jiàn)接種印度梨形孢對(duì)櫻桃番茄采后抗性影響的報(bào)道。本試驗(yàn)研究櫻桃番茄苗期植株根部接種印度梨形孢對(duì)櫻桃番茄產(chǎn)量、品質(zhì)及采后抗性的影響，以期為其在櫻桃番茄生產(chǎn)上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試櫻桃番茄品種為杭雜5號(hào)，由杭州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蔬菜所提供。印度梨形孢來(lái)自德國(guó)耶拿大學(xué)Ralfoelmuller教授實(shí)驗(yàn)室。病原菌灰葡萄孢(Botrytiscinerea)及鏈格孢(Alternariaalternata)均為浙江大學(xué)食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 印度梨形孢菌培養(yǎng) 印度梨形孢在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)平板上25℃培養(yǎng)一周后用直徑0.5 cm的無(wú)菌打孔器打孔，接種5個(gè)菌塊到含馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(potato dextrose broth，PDB)的錐形瓶(50 mL/250 mL)中，培養(yǎng)一周(25℃，150 r·min-1)取出，4 000 r·min-1離心10 min，再用無(wú)菌水離心水洗3次收集菌絲體，將菌絲低速渦旋打碎2 min，備用。

1.2.2 櫻桃番茄育苗與接種 選取飽滿(mǎn)的櫻桃番茄種子播種在裝有育苗基質(zhì)的32孔穴盤(pán)中，每孔1粒，苗床用電熱線(xiàn)加溫，置于溫室大棚內(nèi)常規(guī)管理。育苗期間白天平均溫度約13℃，夜晚平均溫度約6℃，日照4 h·d-1。栽培基質(zhì)為加拿大發(fā)發(fā)得泥炭∶蛭石=3∶1(v∶v)混合調(diào)配，并用高壓滅菌鍋滅菌2 h。處理組栽培基質(zhì)按1%(m∶v)加入印度梨形孢菌絲體和孢子的混合物，攪拌均勻，對(duì)照組不接菌，然后將兩組栽培基質(zhì)裝入塑料盆(7 L)中，每盆約裝3.5 L。選取株高及長(zhǎng)勢(shì)一致的4～5片真葉期秧苗60株，洗凈根系后栽種于處理組和對(duì)照組塑料盆中，每盆2株苗，每組各15盆，將栽種好的塑料盆置于溫室大棚內(nèi)，兩周后每盆各間去一株苗，整個(gè)生長(zhǎng)期不使用任何殺蟲(chóng)或殺菌劑，其他按常規(guī)管理。

1.2.3 病原菌的培養(yǎng)與孢子懸浮液制備 在SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)上分別挑取適量的供試病原菌灰葡萄孢及鏈格孢到PDA斜面，置于28℃ LRH-250生化培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)中培養(yǎng)7～14 d，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｊ褂们?，取出保存的病原菌斜面，于超凈工作臺(tái)上用無(wú)菌接種環(huán)刮取適量孢子，轉(zhuǎn)移至裝有無(wú)菌水的小試管中，在Olympus光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯有限公司)下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用無(wú)菌水將病原菌孢子濃度調(diào)配為1×104spores·mL-1，待用。

1.2.4 櫻桃番茄產(chǎn)量及品質(zhì)測(cè)定 待處理組和對(duì)照組果實(shí)商業(yè)成熟期開(kāi)始測(cè)產(chǎn)，總產(chǎn)量為第一穗果始收至最后一穗果終收(7月初)的所有果實(shí)的累計(jì)重量，5株累計(jì)測(cè)產(chǎn)，3次重復(fù)。將每次測(cè)得的產(chǎn)量除以果實(shí)個(gè)數(shù)即得單果重。每組分別取8～10個(gè)櫻桃番茄測(cè)定果實(shí)品質(zhì)，3次重復(fù)，測(cè)定環(huán)境溫度為20℃。

1.2.5 果實(shí)采后自然腐爛試驗(yàn) 印度梨形孢處理組和對(duì)照組果實(shí)分別采自苗期植株接種印度梨形孢和未接種印度梨形孢的對(duì)照植株，各取60個(gè)商業(yè)成熟且形狀、大小、色澤一致、無(wú)損傷及無(wú)病蟲(chóng)害的果實(shí)，不進(jìn)行清洗消毒，分別置于3個(gè)塑料筐中，每框20個(gè)果實(shí)，用保鮮膜封口，并貯藏在恒溫恒濕的貯藏室(溫度25℃，相對(duì)濕度95%，下同)內(nèi)。貯藏過(guò)程中觀(guān)察果實(shí)的腐爛情況，果實(shí)開(kāi)始發(fā)病并有破損即記為腐爛。21 d后記錄果實(shí)的腐爛率。

1.2.6 貯藏期果實(shí)品質(zhì)及酶活性檢測(cè) 各取處理組和對(duì)照組果實(shí)30個(gè)，用0.1%次氯酸鈉溶液浸泡1 min，再用自來(lái)水沖洗干凈并晾干，然后分別置于2個(gè)塑料筐中，用保鮮膜封口后置于恒溫恒濕貯藏室內(nèi),每隔5 d檢測(cè)果實(shí)品質(zhì)(包括可溶性蛋白含量、硬度、維生素C)和過(guò)氧化物酶(peroxidase，POD)及多酚氧化酶(polyphenol oxidase activity，PPO)的活性。

1.2.7 果實(shí)采后病原菌抗性試驗(yàn) 印度梨形孢處理組和對(duì)照組分別選取60個(gè)果實(shí)，用0.1%次氯酸鈉溶液浸泡1 min，再用自來(lái)水沖洗干凈，于室溫晾干后置于3個(gè)塑料筐，每框20個(gè)果實(shí)。用直徑5 mm無(wú)菌打孔器在果實(shí)赤道部位制造一傷口。在每個(gè)傷口接入20 μL濃度為1×104spores·mL-1病原菌孢子懸浮液。果實(shí)自然晾干后，用保鮮膜封口置于恒溫恒濕貯藏室內(nèi)，5 d后觀(guān)察并記錄果實(shí)腐爛率，2次重復(fù)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 櫻桃番茄品質(zhì)測(cè)定 可溶性蛋白含量測(cè)定按 Bradford[23]的方法，采用牛血清蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，每處理 3 個(gè)平行，每平行取自 6 個(gè)果實(shí)。采用WYT-4型手持折光儀(泉州中友光學(xué)儀器有限公司)測(cè)定可溶性固形物含量，每個(gè)果實(shí)測(cè)2次；采用GY-1型硬度計(jì)(杭州托普儀器有限公司)測(cè)定果肉硬度，每個(gè)果實(shí)測(cè)2次[24]；采用2,6-二氯酚靛酚法測(cè)定維生素C含量[25]；采用酸堿中和滴定法測(cè)定可滴定酸含量[26]，用0.1 mol·L-1NaOH滴定，結(jié)果表示為含蘋(píng)果酸的百分?jǐn)?shù)(%)。

1.3.2 果實(shí)貯藏期酶活性測(cè)定 酶的提取和活性測(cè)定采用如下方法[26]：稱(chēng)取組織樣品0.3 g于研缽中，加入4.5 mL約4℃的50 mmol·L-1含1.33 mmol·L-1EDTA和1% 聚乙烯吡咯烷酮的 pH值7.8的磷酸緩沖鹽溶液緩沖液，加少量石英砂于冰浴中碾磨，于SIGMA 3K-15離心機(jī)(德國(guó)希格瑪公司)離心10 min(4℃、12 000 r·min-1)。 取上清液置于冰浴中用于測(cè)定酶活性和可溶性蛋白含量。POD活性采用愈創(chuàng)木酚法[27]測(cè)定，以每分鐘上升0.01為一個(gè)酶活性單位，用U·g-1FW表示。PPO活性采用鄰苯二酚法[28]測(cè)定，以每分鐘上升0.01為一個(gè)酶活性單位，以U·g-1FW表示。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用One-way ANOVA進(jìn)行顯著性分析(P<0.05)，采用Excel 2010進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 印度梨形孢對(duì)櫻桃番茄單果重和產(chǎn)量的影響

由圖1可知，在櫻桃番茄生長(zhǎng)前期，接種印度梨形孢植株上果實(shí)的單果重比對(duì)照增加了14.0%，達(dá)顯著水平；但在櫻桃番茄生長(zhǎng)后期，兩者無(wú)顯著差異。另外，由圖2可知，接種印度梨形孢植株上果實(shí)的產(chǎn)量與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)。

注：*表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。Note: * indicates significant difference among treatments at 0.05 level. The same as following.圖1 印度梨形孢對(duì)櫻桃番茄單果重的影響Fig.1 Effect of P.indica on the weight of single fruit

圖2 印度梨形孢對(duì)櫻桃番茄產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of P.indica on the yield of fruit

2.2 印度梨形孢對(duì)櫻桃番茄果實(shí)品質(zhì)的影響

由表1可知，苗期植株接種印度梨形孢的果實(shí)硬度、總可溶性固形物含量和可滴定酸含量均與對(duì)照組無(wú)顯著差異，但果實(shí)的可溶性蛋白含量和維生素C含量均顯著高于對(duì)照組，可見(jiàn)苗期接種印度梨形孢能顯著提高櫻桃番茄的果實(shí)品質(zhì)。

表1 印度梨形孢對(duì)櫻桃番茄品質(zhì)的影響Table 1 Effects of P. indica on the quality of cherry tomato

2.3 印度梨形孢對(duì)櫻桃番茄果實(shí)自然腐爛率的影響

由圖3可知，在室溫貯藏21 d后，對(duì)照組果實(shí)的腐爛率為37.5%，苗期接種印度梨形孢的處理組果實(shí)的腐爛率為12.5%，處理組果實(shí)腐爛率比對(duì)照組降低了25.0個(gè)百分點(diǎn)，達(dá)顯著水平。

圖3 印度梨形孢對(duì)果實(shí)自然腐爛率的抑制效果Fig.3 Effect of P. indica on the fruit of natural decay rate

2.4 印度梨形孢對(duì)櫻桃番茄果實(shí)采后病原菌抗性的影響

由圖4可知，苗期接種印度梨形孢能夠誘導(dǎo)櫻桃番茄果實(shí)對(duì)鏈格孢(A.alternata)和灰葡萄孢(B.cinerea)的抗性，果實(shí)黑斑病和灰霉病的發(fā)病率分別比對(duì)照降低了20.0和17.5個(gè)百分點(diǎn)，均達(dá)顯著水平。

圖4 印度梨形孢對(duì)果實(shí)發(fā)病率的影響Fig.4 Effects of P. indica on disease incidence of fruit

2.5 印度梨形孢對(duì)櫻桃番茄貯藏期酶活性的影響

由圖5可知，在櫻桃番茄果實(shí)貯藏過(guò)程中，印度梨形孢處理組果實(shí)的POD和PPO活性在貯藏11 d時(shí)達(dá)到峰值，且顯著高于對(duì)照；對(duì)照的POD和PPO活性一直呈下降趨勢(shì)?？梢?jiàn)，印度梨形孢能誘導(dǎo)果實(shí)POD和PPO的活性。

2.6 印度梨形孢對(duì)櫻桃番茄貯藏期間果實(shí)品質(zhì)變化的影響

由圖6可知，在櫻桃番茄貯藏過(guò)程中，果實(shí)可溶性蛋白含量、維生素C含量和硬度均逐漸下降。在貯藏第1和第6天時(shí)，印度梨形孢處理組的果實(shí)可溶性蛋白含量和維生素C含量均顯著高于對(duì)照；在貯藏第6和第11天時(shí)，印度梨形孢處理組的果實(shí)硬度顯著高于對(duì)照。

圖5 印度梨形孢對(duì)果實(shí)貯藏期POD和PPO活性的影響Fig.5 Effect of P. indica on POD and PPO activities of fruit during storage

圖6 印度梨形孢對(duì)果實(shí)貯藏期品質(zhì)變化的影響Fig.6 Effect of P.indica on the change of fruit quality during storage

3 討論

王鳳讓等[29]研究表明，苗期接種印度梨形孢的番茄果實(shí)總重量顯著高于對(duì)照，其原因是接種印度梨形孢提高了番茄植株坐果率，但單果重未提高。本研究結(jié)果與之不同，接種印度梨形孢后櫻桃番茄果實(shí)總產(chǎn)量與對(duì)照無(wú)顯著差異，可能是由于本研究考察的是櫻桃番茄全生育期的產(chǎn)量，櫻桃番茄是長(zhǎng)季節(jié)作物，印度梨形孢于定殖前期在其根部進(jìn)行活體營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，能促進(jìn)根系生長(zhǎng)和植株的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，因而生長(zhǎng)前期單果重明顯提高，而生長(zhǎng)后期，印度梨形孢以寄主植株的根細(xì)胞進(jìn)行腐生，導(dǎo)致其根細(xì)胞程序性死亡[30-32]，致使生長(zhǎng)后期根的生長(zhǎng)不及對(duì)照，導(dǎo)致其整個(gè)生育期產(chǎn)量并未較對(duì)照顯著提高。Andrade-Linares等[32]研究也發(fā)現(xiàn)，印度梨形孢定殖前期番茄產(chǎn)量顯著提高，但10周后產(chǎn)量與對(duì)照無(wú)顯著差異。

對(duì)果實(shí)品質(zhì)進(jìn)行分析表明，印度梨形孢處理能提高果實(shí)的品質(zhì)，主要體現(xiàn)在果實(shí)中與抗性相關(guān)的可溶性蛋白含量和與抗氧化抗衰老相關(guān)的維生素C含量高于對(duì)照，這與在芹菜[33]上的研究結(jié)果相似。并且果實(shí)中可溶性蛋白和維生素C含量在貯藏前期顯著高于對(duì)照，說(shuō)明苗期植株接種印度梨形孢，可在一定程度上延緩采后果實(shí)的成熟衰老進(jìn)程；另外，果實(shí)硬度下降的速度也比對(duì)照緩慢，說(shuō)明苗期接種印度梨形孢能降低貯藏期果實(shí)的軟化速度。

果實(shí)的采后抗性主要表現(xiàn)為對(duì)常見(jiàn)病原菌的抗性，櫻桃番茄采后常見(jiàn)病原菌包括鏈格孢和灰葡萄孢。本研究結(jié)果表明，苗期櫻桃番茄植株接種印度梨形孢，能誘導(dǎo)果實(shí)對(duì)采后病原菌鏈格孢和灰葡萄孢的抗性，并顯著降低采后果實(shí)的自然腐爛率。印度梨形孢可提高煙草對(duì)根部黑脛病和青枯病的抗性[34-35]，顯著提高小麥對(duì)冠腐病[36]、玉米對(duì)根腐病[37]等根部病害的抗性，同時(shí)也能提高擬南芥葉部白粉病和番茄葉部黃萎病的抗性[18,38]。印度梨形孢可通過(guò)誘導(dǎo)與抗性相關(guān)基因的表達(dá)和激活抗性相關(guān)酶的活性，提高植物對(duì)病原物的抗性[16,18,24,36-37]。印度梨形孢誘導(dǎo)煙草對(duì)黑脛病和青枯病、擬南芥對(duì)葉部白粉病的抗性及感病番茄品種對(duì)TYLCV的抗性均與提高抗性相關(guān)基因的表達(dá)和誘導(dǎo)抗性相關(guān)酶的活性密切相關(guān)[22,34-35,38]。在櫻桃番茄果實(shí)室溫貯藏試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，貯藏第10天時(shí)，對(duì)照果實(shí)開(kāi)始發(fā)病腐爛，而處理組果實(shí)貯藏第16天才發(fā)病，且對(duì)照果實(shí)的腐爛率顯著高于處理果實(shí)，這一現(xiàn)象剛好與處理果實(shí)貯藏中期POD和PPO活性被激活相符。前期已有研究表明，印度梨形孢能夠誘導(dǎo)番茄葉部抗性相關(guān)基因的表達(dá)[22]，印度梨形孢是否能誘導(dǎo)采后果實(shí)抗性及成熟軟化相關(guān)基因的表達(dá)以及可能的信號(hào)通路將是下一步的研究任務(wù)。

4 結(jié)論

研究表明，苗期櫻桃番茄植株接種印度梨形孢對(duì)櫻桃番茄總產(chǎn)量無(wú)顯著影響，但能夠提高櫻桃番茄果實(shí)的品質(zhì)，延緩果實(shí)品質(zhì)下降的速度，降低果實(shí)自然貯藏條件下的腐爛率，并對(duì)采后病原菌鏈格孢和灰葡萄孢有較好的抑制作用。其可能的作用機(jī)制包括提高了果實(shí)的采后品質(zhì)，降低了果實(shí)軟化速度及延緩了果實(shí)成熟衰老的進(jìn)程，并激活了貯藏期間與抗性相關(guān)的酶包括POD和PPO的活性。綜上，苗期接種印度梨形孢能有效提高櫻桃番茄果實(shí)品質(zhì)和采后抗性。