王 茜 吳佳海 陳 瑩 王小利,*

(1 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所，貴州 貴陽 550006；2 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，貴州 貴陽 550006)

開花是植物由營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵過程，在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[1-2]。針對模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)的研究發(fā)現(xiàn)，存在5條遺傳調(diào)控途徑，其能夠通過整合內(nèi)外部的信號，最終調(diào)節(jié)擬南芥的成花轉(zhuǎn)變，其中，光周期途徑作為該五大重要途徑之一而備受關(guān)注[3-5]。在光周期途徑中，植物通過感受光照刺激產(chǎn)生規(guī)律的自我調(diào)節(jié)，被稱為生物鐘。生物鐘在調(diào)控真核生物生理過程方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[6]。此外，生物鐘還可以作為真核生物內(nèi)在的時間調(diào)節(jié)器，指導(dǎo)有機體不斷地自我調(diào)節(jié)，以達到最終適應(yīng)外界環(huán)境變化的目的[7-8]。大多數(shù)有機體都有保守的產(chǎn)生生物鐘節(jié)律的機制，即由中央振蕩器產(chǎn)生的基于轉(zhuǎn)錄水平的負反饋調(diào)節(jié)作用[9]。已有研究結(jié)果表明，MYB類蛋白基因LHY(late elongated hypocotyll)和CCA1 (circadian clock assoiated1)，以及偽反應(yīng)調(diào)節(jié)因子TOC1 (timing of CAB expression 1)三者構(gòu)成了中央振蕩器的核心組分[10-11]。

TOC1和LHY/CCA1之間的反饋調(diào)節(jié)構(gòu)成了擬南芥生物鐘中央振蕩器的基本框架[12]。CCA1和LHY的mRNA表達水平通常在清晨達到高峰，其編碼的蛋白結(jié)合在TOC1啟動子的夜晚元件上發(fā)揮負調(diào)控作用，使得TOC1的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào); 下調(diào)后的TOC1編碼的蛋白正向調(diào)控CCA1和LHY的表達水平，致使CCA1和LHY的表達水平隨之下調(diào)，最終在接近黃昏時，CCA1和LHY的表達再次通過負反饋調(diào)節(jié)，使TOC1的mRNA和其編碼的蛋白水平均達到峰值[12-14]。其中TOC1主要負責(zé)穩(wěn)定中央振蕩器的調(diào)節(jié)作用，Huang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，中央振蕩器的性能在擬南芥TOC1超表達和突變體中均發(fā)生了極大的變化。TOC1作為APRRs家族(Arabidopsispseudo-response regulators)的重要成員，又名APRR1或PRR1，該家族還包括APRR3、APRR5、APRR7和APRR9等4個成員[16]。Matsushika等[10]研究指出，擬南芥中5個APRR基因呈現(xiàn)晝夜規(guī)律和時間表達順序模式，APRR9首先在黎明時開始表達，隨著時間的推移，APRR7、APRR5、APRR3依次相繼表達，直到夜間TOC1表達；Makino等[17]研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)光照條件下，APRR9、APRR7、APRR5和APRR3均因TOC1的超量表達而不同程度地失去了節(jié)律性表達模式; Sato等[18]發(fā)現(xiàn)過量表達APRR5，致使APRR9和APRR7的表達水平急劇下降，APRR3和TOC1的表達水平則上調(diào)并達到峰值。Farré等[19]研究發(fā)現(xiàn)，CCA1通過結(jié)合APRR7和APRR9基因啟動子的CBS (CCA1-binding site)結(jié)構(gòu)域調(diào)控上述基因的表達。由此可見，APRRs家族成員的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均表現(xiàn)出晝夜節(jié)律變化，并在中央振蕩器中發(fā)揮一定的作用。此外，從APRR9到TOC1的這種調(diào)控提供了一種可變的輸出機制，導(dǎo)致從黎明到傍晚的任何時刻，都可以對相關(guān)基因進行調(diào)控，最終調(diào)節(jié)TOC1的表達水平[20]。

在大多數(shù)植物體內(nèi)光周期基因都是相對保守的，然而隨著進化的推移及生活環(huán)境的不斷變化，植物體內(nèi)基因(甚至是同源基因)的生物學(xué)功能會表現(xiàn)出不同程度的差異性[20]。雖然TOC1已被公認為是重要的開花調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，但其在生物鐘維持方面的具體作用仍存在眾多爭議，且目前針對其功能的研究主要集中于雙子葉植物，特別是模式植物擬南芥[21-22]。高羊茅(Festucaelata)作為單子葉植物，其發(fā)育性狀與雙子葉植物存在很大差異。高羊茅是一種重要的冷季型牧草及草坪草，具有很強的抗逆性，被廣泛應(yīng)用于水土保持、運動場建植、城市綠化和環(huán)境保護等方面，已成為我國使用量增長最快的草種。然而，目前我國高羊茅草坪草品種基本依賴于歐美進口，亟待選育適應(yīng)我國氣候環(huán)境，特別是適應(yīng)南方典型短日照地區(qū)(如貴州省)條件的新品種?；诖?，本研究克隆獲得高羊茅TOC1基因的cDNA全長，將其命名為高羊茅FeTOC1，并對其進行生物信息學(xué)分析；隨后，利用熒光蛋白對FeTOC1進行亞細胞定位；最后，利用實時熒光定量PCR (quantitative real-time PCR, qRT-PCR)對高羊茅葉片中FeTOC1在3種不同光周期模式下(長/短日照、連續(xù)光照/黑暗和晝夜顛倒)的表達水平進行分析，旨在從分子調(diào)控層面揭示FeTOC1在維持高羊茅生物鐘方面發(fā)揮的作用，為培育適應(yīng)短日照地區(qū)牧草新品種提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

植物材料為高羊茅(FestucaelataKeng ex E. Alexeev)獵狗五號(百綠草種公司，貴陽)。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料培養(yǎng) 挑選籽粒飽滿的高羊茅獵狗五號種子播種于泥炭土和蛭石混合(1∶1)基質(zhì)中，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。澆灌Hoagland營養(yǎng)液，每4 d更換一次。培養(yǎng)箱晝/夜溫度為(22±2℃)/(20±2℃)，光強約230～300 μmol·m-2·s-1，相對空氣濕度為60%～70%。

1.2.2 材料處理與取樣 將高羊茅進行以下3種不同光周期模式處理(表1)。處理結(jié)束后，每4 h收集各處理下高羊茅葉片于液氮中速凍，連續(xù)取樣48 h，保存于-80℃冰箱中，用于檢測FeTOC1基因在不同光周期模式下的表達水平。

表1 不同光周期模式處理Table 1 Treatments of diverse photoperiod patterns

1.2.3 高羊茅FeTOC1基因全長的cDNA克隆 選擇NCBI網(wǎng)站上已公布的其他植物TOC1核苷酸序列進行同源性比對，根據(jù)同源性高簡并性低的原則，使用DNAMAN和Primer 5.0軟件設(shè)計引物用于擴增高羊茅TOC1基因片段，再結(jié)合3′和5′ RACE試劑盒(Inivtrogen，美國)的引物進行套式PCR擴增 (引物見表2)。

表2 高羊茅FeTOC1基因克隆及qRT-PCR引物序列Table 2 Sequences of primers used for cloning and qRT-PCR amplification of FeTOC1

參照TRIZOLTMKit(上海生工)RNA法提取高羊茅葉片RNA，詳細流程參見文獻[23]。使用Fermentas公司(加拿大)的Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA第一鏈。利用設(shè)計的簡并性引物TOC1F2和TOC1F2進行目的片段的PCR擴增：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，56℃退火50 s，72℃延伸90 s，35個循環(huán)；72℃終延伸10 min，保存于4℃冰箱中。目的片段按照UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒說明進行回收和純化，再將篩選獲得的陽性克隆進行測序(寶生物工程，大連)。該結(jié)果經(jīng)比對確定為TOC1基因后，采用RACE技術(shù)獲得TOC1基因的5′和3′端。將克隆獲得的中間片段、5′RACE和3′RACE結(jié)果在DNAMAN軟件中進行拼接，最終獲得高羊茅TOC1基因的全長cDNA序列。

1.2.4 生物信息學(xué)分析FeTOC1的BLAST搜索在NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) 網(wǎng)站上完成；等電點、分子質(zhì)量及穩(wěn)定系數(shù)分析在ProtParam (http://us.expasy.org/tools/protparam.html)網(wǎng)站上完成；使用MEGA 5.0軟件構(gòu)建FeTOC1的系統(tǒng)進化樹，并對其氨基酸序的同源性進行分析。

1.2.5 亞細胞定位 將目的蛋白與綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)融合表達載體進行轉(zhuǎn)化，選擇陽性轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌GV3101菌液注射入本氏煙草(Nicotianaattenuata)葉片，其中空載體為對照，共同在黑暗條件下培養(yǎng)48 h，隨后在共聚焦顯微鏡下檢測熒光信號。

1.2.6 不同光周期處理下高羊茅FeTOC1基因表達模式分析 按照1.2.3的方法獲得cDNA，并稀釋20倍作為qRT-PCR的模板。使用DNAMAN和Primer 5.0軟件設(shè)計特異性表達引物，用于擴增高羊茅FeTOC1基因片段，GAPDH作為內(nèi)參基因(引物見表2)，反應(yīng)條件同1.2.3。每個樣品3個生物學(xué)重復(fù)，每個生物重復(fù)3個技術(shù)重復(fù)。采用2-ΔΔCt法[24]計算FeTOC1基因在各處理下的相對表達水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 高羊茅FeTOC1基因全長cDNA序列分析

將引物TOC1F2和TOC1R2擴增獲得的核心片段、5′ RACE和3′ RACE結(jié)果在DNAMAN軟件中進行拼接，最終獲得高羊茅FeTOC1基因的全長cDNA序列為1 557 bp，編碼517個氨基酸(圖1、2)。在NCBI上進行BLAST搜索，比較結(jié)果顯示該基因與小麥(Triticumaestivum)、大麥(Hordeumvulgare)、水稻(Oryzasativa)、山羊草(Aegilopstauschii)等禾本科單子葉植物的TOC1基因具有較高的同源性，同源性程度依次為99%、94%、99%、99%，與擬南芥、玉米(Zeamays)、馬甲竹(Bambusatulda)、高粱(Sorghumbicolor)等雙子葉植物的TOC1基因亦具有較高的同源性，均為93%以上。

圖1 半定量RT-PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of semi-quantitative reverse transcription-PCR products

圖2 高羊茅FeTOC1核苷酸序列及推測的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequence of FeTOC1 from Festuca elata

2.2 高羊茅FeTOC1基因生物信息學(xué)分析

將獲得的FeTOC1基因全序列通過在線軟件ProtParam進行預(yù)測，F(xiàn)eTOC1基因編碼517個氨基酸，其分子式為C2506H3921N729O794S24，分子質(zhì)量為57.735 55 kDa。 編碼的蛋白質(zhì)等電點為6.12，親水性為-0.635，不穩(wěn)定系數(shù)為46.55。隨后，將高羊茅FeTOC1氨基酸序列與山羊草、小麥、大麥、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)和擬南芥氨基酸序列進行多重比對，結(jié)果顯示，與其他植物同源基因一致，保守區(qū)PR (peudoreceiver domain)和CCT結(jié)構(gòu)域[CONSTANS (CO), CO-like, TOC1]分別位于高羊茅FeTOC1氨基酸序列的N、C兩端，并且C端呈酸性(圖3)。

注：紅色和綠色下劃線區(qū)域分別代表保守區(qū)PR和CCT結(jié)構(gòu)域。Note: The red and green underlined regions represent the conserved PR and CCT domains, respectively.圖3 高羊茅FeTOC1與其他植物TOC1的氨基酸序列比對Fig.3 Amino acid sequence alignment of FeTOC1 from Festuca elata with others from hight plants

2.3 高羊茅FeTOC1系統(tǒng)進化樹分析

利用Mega 5.0軟件制作21種植物TOC1蛋白質(zhì)序列的系統(tǒng)進化樹，結(jié)果如圖4所示。相比雙子葉植物擬南芥、煙草、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)等，高羊茅FeTOC1蛋白質(zhì)與禾本科植物更為相近，其中與大麥、小麥及粗山羊草親緣關(guān)系最近，均達到99%。

圖4 高羊茅FeTOC1蛋白質(zhì)序列與其他植物TOC1蛋白質(zhì)序列的系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of FeTOC1 from Festuca elata and those from other plants

2.4 高羊茅FeTOC1的亞細胞定位分析

構(gòu)建目的蛋白與GFP融合表達載體，結(jié)果如圖5所示。從左到右依次為目的基因/空載體的綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)、葉綠體自發(fā)熒光(chloroplast auto-fluorescence, CHI)、明場(bright field, DIC)和三通道疊加場(Merge)。對照組在細胞核、細胞質(zhì)和細胞膜均檢測到熒光信號，試驗組僅在細胞核中檢測到熒光信號。經(jīng)亞細胞定位分析可知，F(xiàn)eTOC1位于細胞核。

圖5 高羊茅FeTOC1的亞細胞定位Fig.5 Subcellular localization of FeTOC1

2.5 高羊茅FeTOC1基因在不同光周期下表達模式分析

2.5.1FeTOC1基因在長日照和短日照條件下的晝夜表達模式分析 長日照條件下，F(xiàn)eTOC1基因表達展現(xiàn)出規(guī)則的晝夜振蕩節(jié)律，且周期為24 h。第一個光周期內(nèi)，F(xiàn)eTOC1基因表達的水平從光照處理時間(zetgeber time, ZT)凌晨4點后開始急劇增加，于中午12點達到峰值，隨后其表達水平急劇下降；第二個光周期內(nèi)，F(xiàn)eTOC1基因表達水平呈現(xiàn)同樣的變化趨勢，但其表達峰值提前了4 h，出現(xiàn)于早晨8點(圖6-A)。短日照條件下，F(xiàn)eTOC1基因表達的模式與長日照下相同(圖6-B)。由此表明，F(xiàn)eTOC1基因的表達水平受光周期的調(diào)控，與生物鐘控制的晝夜節(jié)律相關(guān)，但日照長短對該基因表達模式并無明顯影響。

注：橫坐標(biāo)下黑色條形代表黑暗處理；白色條形代表光照處理。下同。Note: The black bar on the horizontal axis represents the dark treatment. The white bars represent light treatment. The same as following.圖6 高羊茅葉片F(xiàn)eTOC1基因在長日照(A)和短日照(B)下的表達Fig.6 FeTOC1 gene expression level under long-(A) and short-days (B) in Festuca elata leaves

2.5.2FeTOC1基因在連續(xù)光照和連續(xù)黑暗條件下表達模式分析 長日照培養(yǎng)3周后，連續(xù)光照1周，F(xiàn)eTOC1基因表達水平在48 h內(nèi)呈現(xiàn)較弱的振蕩趨勢，但其在統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異(P< 0.05) (圖7-A)；而連續(xù)黑暗1周后，其表達水平呈現(xiàn)規(guī)則的震蕩節(jié)律且周期為24 h，F(xiàn)eTOC1基因表達峰值分別出現(xiàn)于第一個光周期的凌晨4點和第二個光周期的凌晨0點，相比于第一個光周期，第二個光周期的峰值提前了4 h (圖7-B)。短日照培養(yǎng)3周后，連續(xù)光照1周，F(xiàn)eTOC1基因表達水平呈現(xiàn)先上升后下降的振蕩規(guī)律，變化周期為24 h，其表達峰值分別出現(xiàn)于第一個光周期的中午2點和第二個光周期的早晨8點，同樣，第二個光周期的峰值比第一個光周期提前了4 h (圖7-C)；連續(xù)黑暗1周后，F(xiàn)eTOC1基因表達模式與連續(xù)光照相似，峰值分別出現(xiàn)于ZT4和ZT8，相比于第一個光周期，第二個光周期的峰值滯后了4 h (圖7-D)。綜上可知，外界光照條件的變化直接影響FeTOC1基因的表達水平。植株在接受連續(xù)光照或連續(xù)黑暗的處理后，F(xiàn)eTOC1基因的表達模式與正常光照處理一致，表現(xiàn)出一定的晝夜振蕩節(jié)律，其周期為24 h。可見FeTOC1基因在適應(yīng)外界環(huán)境變化時，其表達水平受到一定程度的影響，但能夠保持一定的穩(wěn)定節(jié)律，以保障植物正常開花生長。值得注意的是，相比于其他日照處理，長日照后持續(xù)光照極大地削弱了FeTOC1基因的振蕩節(jié)律，說明該基因的表達對黑暗的積累有一定程度的依賴。

圖7 高羊茅葉片F(xiàn)eTOC1基因在長日照(A和B)和短日照(C和D)后連續(xù)光照(A和C)和連續(xù)黑暗(B和D)下的表達Fig.7 FeTOC1 gene expression level under continual illumination (A and C) and continual darkness (B and D) in Festuca elata leaves after long-(A and B) and short-days (C and D)

2.5.3FeTOC1基因在晝夜顛倒下的表達模式分析 圖8-A為試驗對照組，即植株自播種之日起，遵循外界晝夜規(guī)律長日照4周。長日照培養(yǎng)3周后，晝夜顛倒處理1周，F(xiàn)eTOC1基因表達水平呈現(xiàn)規(guī)則的振蕩節(jié)律，且周期為24 h，其表達峰值均出現(xiàn)在ZT0，且與對照組相比，其表達模式呈現(xiàn)相反的變化趨勢(圖8-B)。植株自播種之日起，顛倒晝夜培養(yǎng)4周后，F(xiàn)eTOC1基因表達水平依然呈現(xiàn)規(guī)則的振蕩節(jié)律且周期為24 h，其表達峰值均出現(xiàn)在ZT20，同樣與對照組相比，表達模式相反(圖8-C)。顛倒晝夜培養(yǎng)3周后，遵循外界晝夜規(guī)律長日照1周，F(xiàn)eTOC1基因表達模式與對照組一致(圖8-D)。由此可見，F(xiàn)eTOC1基因表達水平隨著外界環(huán)境晝夜節(jié)律的變化表現(xiàn)出規(guī)律的晝夜振蕩周期，且其周期為24 h。

圖8 高羊茅葉片F(xiàn)eTOC1基因在晝夜顛倒下的表達Fig.8 FeTOC1 gene expression level under day and night inversion in Festuca elata leaves

3 討論

自TOC1首次從擬南芥中分離獲得以來，其在植物生物鐘調(diào)節(jié)中的重要地位備受關(guān)注[12-13, 25]。TOC1屬于擬南芥APRR基因家族，與其他成員結(jié)構(gòu)類似，其編碼的蛋白質(zhì)N端存在大約120個氨基酸組成的非典型PR結(jié)構(gòu)域，C端則存在大約50個氨基酸構(gòu)成的CCT結(jié)構(gòu)域，但與其他成員不同的是TOC1不存在IR區(qū)域(intermediate region)[26-27]。本研究將高羊茅FeTOC1氨基酸序列與其他植物TOC1氨基酸序列進行多重比對發(fā)現(xiàn)，它們具有高度的相似性，在PR結(jié)構(gòu)域中心的周圍，均含有一個獨特的谷氨酸殘基(E) (圖3)，這是偽接收器的標(biāo)志性特征之一，真正的接受器在同樣的位置包含的是接受磷酸的天冬氨酸殘基(D)[28]。預(yù)測的高羊茅CCT結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列經(jīng)比對，與禾本科山羊草、大麥、小麥及二穗短柄草的CCT結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列具有高度一致性(圖3)。進一步通過系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)，高羊茅FeTOC1蛋白質(zhì)與禾本科大麥、小麥及粗山羊草TOC1蛋白質(zhì)親緣關(guān)系最近(圖4)。TOC1基因通常編碼含有非典型接受結(jié)構(gòu)域的定位于細胞核的蛋白[25, 29]。本研究亞細胞定位結(jié)果顯示，F(xiàn)eTOC1表達的蛋白定位在細胞核中(圖5)，表明TOC1可能參與功能重要的復(fù)合物合成，如轉(zhuǎn)錄體、剪接體或蛋白體[30]。

生物鐘通過整合外界環(huán)境和植物內(nèi)部信號調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的各種生理活動[31-32]。其中中央振蕩器通過輸入光信號產(chǎn)生節(jié)律，隨后向下游通路進行傳遞，使其識別晝夜信號，由此可知中央振蕩器是生物鐘不可或缺的組分[29]。Alabadí等[12]發(fā)現(xiàn)，TOC1在維持生物鐘穩(wěn)定調(diào)控中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。針對TOC1基因在植物不同組織中表達豐度的研究發(fā)現(xiàn)，在單子葉植物小麥中，以15 d小麥的莖尖、幼根、幼葉和90 d小麥的節(jié)、莖、葉鞘、老根、老葉、幼穗為測定對象，其中幼根、幼葉和老葉中TOC1的表達豐度最高，且其表達水平相當(dāng)[32]；在雙子葉植物玉米中，以花粉、雄蕊、穗軸、穗位葉、氣生根、莖、花絲、胚芽鞘、胚根、根和苞葉為測定對象，其中從胚根和穗位葉提取的TOC1表達豐度最高[29]?；诖?，本研究在高羊茅葉片中檢測TOC1基因的表達水平，結(jié)果表明在長日照(16L/8D)、短日照(8L/16D) 條件下，其表達均表現(xiàn)出一定的晝夜節(jié)律性(圖6)，與擬南芥TOC1、小麥TaTOC1和水稻OsTOC1的表達特性基本相似[25,33-35]。FeTOC1基因在長日照(圖6-A)和短日照(圖6-B)下表達量的高峰均在第一個振蕩周期出現(xiàn)在光照后4 h (中午12點ZT12)，第二個振蕩周期出現(xiàn)在開始給予光照(早晨8點ZT8)，這兩個點在長短日照的晝夜交替變化中都處于黎明時分，可見高羊茅FeTOC1基因的表達相位不受日照長度變化的影響，同時它還保持了晚間積累性表達的特點。

生物鐘基因通常在沒有晝夜交替信號的刺激下，仍然能通過自身內(nèi)在的生物鐘節(jié)律維持一定時間的規(guī)律性表達[7-8]。本研究分別將長短日照培養(yǎng)3周的高羊茅轉(zhuǎn)移至持續(xù)光照或持續(xù)黑暗條件下適應(yīng)1周，F(xiàn)eTOC1基因的表達仍然具有不同程度的節(jié)律性，但是基因表達的整體水平與長短日照條件下相比，有明顯的削弱趨勢(圖7)，說明FeTOC1基因的表達強烈依賴外界晝夜交替的信號刺激。值得注意的是，F(xiàn)eTOC1基因在高羊茅長日照培養(yǎng)后移至持續(xù)光照48 h環(huán)境，雖然呈現(xiàn)出一定的振蕩節(jié)律，但其在統(tǒng)計學(xué)上差異不顯著(圖7-A)，這與小麥TaTOC1和水稻OsTOC1持續(xù)黑暗條件下的表現(xiàn)類似[33-35]。暗示即便同為單子葉植物，高羊茅FeTOC1基因表達的調(diào)控對于光照的需求弱于小麥和水稻。如圖7-B、D所示，無論長或短日照培養(yǎng)，持續(xù)黑暗48 h，F(xiàn)eTOC1基因依然維持其表達水平和晝夜節(jié)律性，這與擬南芥TOC1基因相似[24]。由此進一步說明黑暗可能是啟動并維持高羊茅FeTOC1基因節(jié)律性表達的重要因素。

Strayer等[25]研究擬南芥toc1-1突變體發(fā)現(xiàn)，TOC1功能的缺失導(dǎo)致植物體內(nèi)在的生物鐘節(jié)律縮短，從正常的24 h變?yōu)?1 h。基于此，本研究分析晝夜顛倒后FeTOC1的表達模式，以期了解TOC1如何響應(yīng)外界晝夜交替的信號刺激，結(jié)果顯示，無論是遵循外界晝夜規(guī)律，還是顛倒外界晝夜規(guī)律，F(xiàn)eTOC1基因的表達均表現(xiàn)出明顯的節(jié)律性振蕩，其振蕩周期為24 h；同時，F(xiàn)eTOC1基因的表達均在黑暗時開始積累，并在給予光照0～4 h后達到峰值(圖8)。由此可見，相比于遵循植物體內(nèi)穩(wěn)定的內(nèi)在生物鐘節(jié)律，F(xiàn)eTOC1基因的表達首先受外界晝夜交替信號的調(diào)節(jié)，說明TOC1在植物適應(yīng)外界環(huán)境變化中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

4 結(jié)論

本研究克隆獲得了高羊茅生物鐘基因FeTOC1，該基因編碼的蛋白質(zhì)FeTOC1包含APRR家族保守的PR結(jié)構(gòu)域和CCT結(jié)構(gòu)域，且主要定位在細胞核中。在長、短日照下，高羊茅葉片中FeTOC1表達具有一定的晝夜節(jié)律性，但表達相位不受日照長度變化的影響，保持了晚間積累性表達的特性；持續(xù)光照顯著抑制了FeTOC1表達的振蕩節(jié)律，而持續(xù)黑暗下FeTOC1基因依然維持其表達水平和晝夜節(jié)律性，揭示了黑暗可能是啟動并維持該基因節(jié)律性表達的重要因素；顛倒晝夜節(jié)律后，相比于植物內(nèi)在的生物鐘節(jié)律，F(xiàn)eTOC1基因優(yōu)先響應(yīng)外界晝夜交替信號。