姚 銳 馬鑫磊 顧鵬鵬 林小虎 高 慧

(河北科技師范學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院/河北省作物逆境生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 秦皇島 066004)

在天然產(chǎn)物的生物合成中，碳-碳鍵的形成極為重要，這一步驟依賴于硫解酶家族催化的克萊森酯縮合反應(yīng)[1]。硫解酶家族隸屬?；o酶A代謝超家族，在原核生物和真核生物中廣泛存在。依據(jù)催化底物和功能的不同，硫解酶被分為兩類：I型硫解酶(3-酮酯酰-輔酶A硫解酶，3-Ketoacyl-CoA Thiolase；KAT; EC 2.3.1.16)和II型硫解酶(乙酰乙酰輔酶A硫解酶，Acetoacetyl-CoA Thiolase；ACAT；EC 2.3.1.9)[2]。I型硫解酶能催化乙酰乙酰輔酶A及脂肪酸碳鏈的分解，因此也被稱為分解硫解酶[3]。II型硫解酶是類戊二烯化合物生物合成中甲羥戊酸途徑(mevalonate pathway，MVA)的第一個(gè)關(guān)鍵酶，催化2個(gè)分子的乙酰 CoA 縮合為乙酰乙酰輔酶A，從而延長碳鏈，因此也被稱為合成硫解酶[4-5]。原核生物中硫解酶功能未分化，能夠可逆地催化合成和分解反應(yīng)[6]；但在真核生物中硫解酶分化成合成型和分解型，在催化底物和聚合狀態(tài)上存在差別[7]。I型硫解酶(EC 2.3.1.16)以二聚體形式(定位于過氧化物酶體)或四聚體形式(定位于線粒體)存在，可催化4～22個(gè)碳的?；?，具有廣泛的底物特異性[8]。II型硫解酶(EC 2.3.1.9)以四聚體形式存在，僅對4個(gè)碳的底物有特異性。每個(gè)單體由N端中心結(jié)構(gòu)域、C端中心結(jié)構(gòu)域以及起連接作用的中間結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，N端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相同：2層α螺旋結(jié)構(gòu)夾著5股β折疊結(jié)構(gòu)[9]。兩類硫解酶有著顯著相似的序列和肽鏈折疊方式，均以活性中心的半胱氨酸為催化位點(diǎn)[10-11]。

目前，在多種植物中，都有硫解酶的相關(guān)報(bào)道。對低等植物球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度偏離最適溫度(25℃)時(shí)，IgKAT能被低溫和高溫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)從而引起油脂積累量下降[12]。在擬南芥(Arabidopsisthalica)中，經(jīng)外源脫落酸(abscisic acid, ABA)處理后AtKAT2上調(diào)表達(dá)，脂肪酸降解速率增加[13]；AtKAT2突變后，擬南芥種子的萌發(fā)和萌發(fā)后生長活動(dòng)均減緩；ABA處理后的kat2突變體對ABA的敏感性降低，葉片氣孔呈現(xiàn)出關(guān)閉進(jìn)程減緩、開放進(jìn)程加快的特點(diǎn)[14-15]。在黑暗誘導(dǎo)衰老和自然衰老的擬南芥葉片中，均檢測到AtKAT2顯著上調(diào)表達(dá)，證實(shí)了AtKAT2是合成茉莉酸的關(guān)鍵基因[16]。除了KAT2，擬南芥KAT亞家族還有2個(gè)同源蛋白KAT1和KAT5，KAT5蛋白發(fā)揮著與KAT2相似的功能，但AtKAT2在整個(gè)生命周期的表達(dá)水平顯著高于另外2個(gè)基因，也有著更廣泛的底物特異性，是擬南芥KAT亞家族中最為關(guān)鍵的蛋白[15,17]。在矮牽牛(Petuniahybrida)中，PhKAT被沉默后，苯甲酸和苯類化合物大量減少，表明KAT在苯類化合物生物合成中不可或缺[18]。擬南芥基因組存在兩個(gè)ACAT編碼基因，AtACAT1主要在維管系統(tǒng)表達(dá)，AtACAT2在根尖、幼葉、頂莖和花藥中高表達(dá)，AtACAT2主要發(fā)揮胚胎發(fā)育和正常雄配子傳遞的功能，AtACAT1功能缺失不會(huì)引起相應(yīng)的表型變化[19]。在丹參[20]、雷公藤[21]、白木香[22]、魚腥草[23]、獨(dú)行菜[24]、杜仲[25]、冬凌草[26]等多種藥用植物中均鑒定出單個(gè)乙酰乙酰輔酶A硫解酶(ACAT)編碼基因，且被證實(shí)通過甲羥戊酸途徑參與萜類活性成分的合成。在重要的牧草紫花苜蓿(MedicagosativaL.)中，MsACAT1能夠提升寒冷、高鹽脅迫下植株的耐受性[27]。可知硫解酶的2種亞型對于植物的生長發(fā)育極為重要，并且都具有一定抵抗非生物脅迫、維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的功能。

谷子(SetariaitalicaL.)是禾本科作物中重要的生物能源作物，在亞洲、非洲干旱地區(qū)廣泛種植，具有很強(qiáng)的耐旱性[28-30]。在禾本科作物水稻(OryzasativaL.)中，硫解酶家族的OsKAT1經(jīng)干旱處理后上調(diào)表達(dá)，是潛在的抗旱基因[31]。而在谷子中，硫解酶家族是否存在響應(yīng)干旱脅迫的成員尚不清楚。本研究基于已測序的谷子基因組，對硫解酶編碼基因家族成員進(jìn)行鑒定和分析，并測定干旱脅迫下硫解酶家族成員的表達(dá)情況，以期為進(jìn)一步研究硫解酶基因的功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試谷子品種為豫谷1號(hào)，由育種單位河南農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，種植于智能人工氣候箱，28℃ 16 h光照/21℃ 8 h黑暗，濕度65%。自然生長組正常澆水保持土壤濕潤，自然干旱組于四至五葉期停止?jié)菜寥篮实陀?0%時(shí)取材，液氮速凍后于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 谷子硫解酶基因家族鑒定

為系統(tǒng)全面地鑒定谷子硫解酶基因家族成員，采用以下兩種方進(jìn)行篩選：從Pfam(http://pfam.xfam.org/)網(wǎng)站下載“硫解酶N端”保守結(jié)構(gòu)域的隱馬爾可夫模型文件(PF00108)，從植物基因組數(shù)據(jù)庫Phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#)下載谷子蛋白庫文件，利用HMMER軟件包中的Hmmsearch程序從谷子全基因組蛋白序列中篩選得到候選的硫解酶蛋白序列，將去除重復(fù)后的候選蛋白序列提交到SMART(http://smart.embl.de/smart/set_mode.cgi?GENOMIC=1)、Pfam和NCBI-CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)數(shù)據(jù)庫，驗(yàn)證這些序列是否具有 “硫解酶N端”和“硫解酶C端(PF02803)”保守結(jié)構(gòu)域；以“Thiolase”作為關(guān)鍵詞在植物基因組數(shù)據(jù)庫Phytozome中的谷子數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索。使用在線網(wǎng)站ExPASy(https://web.expasy.org/protparam/)對確定的谷子硫解酶蛋白序列進(jìn)行氨基酸數(shù)目、分子量、等電點(diǎn)、親疏水性等參數(shù)分析。

1.3 谷子近緣植物硫解酶基因家族成員鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

擬南芥硫解酶基因家族成員基因號(hào)及蛋白序列從TAIR(https://www.arabidopsis.org/index.jsp)獲得；從Phytozome下載菠蘿、二穗短柄草、水稻、玉米、高粱的蛋白庫文件；從EnsemblPlants(http://plants.ensembl.org/index.html)下載小麥蛋白庫文件。采用與篩選谷子硫解酶成員相同的方法篩選6個(gè)近緣物種的硫解酶成員并進(jìn)行驗(yàn)證。通過MEGA7內(nèi)置的ClustalW對8個(gè)物種所有的硫解酶蛋白序列進(jìn)行多種序列比對，并采用鄰接(neighbor-joining，NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，抽樣參數(shù)Bootstrap值設(shè)置為1 000次，遺傳距離選擇泊松距離(poisson correction)。根據(jù)擬南芥硫解酶的分組劃分進(jìn)化樹的成員類別。

1.4 谷子硫解酶基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析

應(yīng)用本地perl語言從谷子基因組注釋信息GFF文件中獲得硫解酶基因家族成員的外顯子和內(nèi)含子信息，輸出為GSDS(http://gsds.gao-lab.org/)可讀GFF文件，并通過GSDS可視化。使用在線軟件MEME(http://meme-suite.org/)分析硫解酶蛋白保守基序并將序列得到的序列在Pfam比對，合并相同類別的基序。最終設(shè)定搜索motif值為2，結(jié)構(gòu)域?qū)挾茸钚?10，最大為260。通過Tbtools軟件將谷子硫解酶進(jìn)化樹、基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域拼接合并。

1.5 谷子硫解酶基因家族染色體位置分布

根據(jù)谷子硫解酶基因家族的基因號(hào)和谷子基因組注釋信息GFF文件，利用Tbtools繪制谷子硫解酶基因家族染色體位置圖。

1.6 谷子、擬南芥、水稻硫解酶蛋白序列比對和催化位點(diǎn)、PTS2位置預(yù)測

使用DNAMAN將篩選得到谷子、擬南芥、水稻成員的蛋白序列進(jìn)行多序列比對，所有蛋白高度保守的殘基被標(biāo)為深色背景。參考擬南芥硫解酶已知的活性催化位點(diǎn)和過氧化物酶體靶向序列(peroxisomal target signal 2, PTS2)，對谷子和水稻的序列進(jìn)行分析，并對活性催化位點(diǎn)和PTS2位置進(jìn)行預(yù)測標(biāo)記。

1.7 谷子硫解酶基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件分析

在Phytozome中下載谷子的全基因組序列和基因結(jié)構(gòu)注釋信息GFF3文件，通過Tbtools的Gtf/Gff3 Sequences Extractor功能提取所有基因編碼序列(coding sequence, CDS)序列上游2 000 bp的序列，再通過Fasta Extractor提取硫解酶基因家族成員的啟動(dòng)子區(qū)序列，提交至PlantCare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)網(wǎng)站進(jìn)行順式作用元件預(yù)測。將得到的預(yù)測信息分類匯總，并通過Tbtools的Simple Biosequence Viewer將結(jié)果可視化。

1.8 谷子硫解酶基因家族成員組織表達(dá)特異性分析

利用谷子基因組測序中獲得的RNA-Seq數(shù)據(jù)分析硫解酶基因家族成員的表達(dá)特征。該數(shù)據(jù)集包含谷子根、莖、葉、穗4個(gè)不同組織的表達(dá)情況，其登錄號(hào)分別為SRX128223、SRX128225、SRX128224和SRX128226。轉(zhuǎn)錄本豐度的單位以RPKM(reads per kilobases permillionreads)值表示。

1.9 自然干旱脅迫下谷子硫解酶編碼基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR(quanitative real time-PCR, qRT-PCR)

將自然條件生長和干旱脅迫下的谷子幼苗植株取根和葉，提取RNA[中國寶生物工程(大連)有限公司TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit試劑盒]并反轉(zhuǎn)錄為cDNA(蘇州宇恒生物科技有限公司UEIris Ⅱ RT-PCR System for First-Strand Cdna Synthesis)-20℃ 保存?zhèn)溆谩α蚪饷富蚣易宓腟iKAT1、SiKAT2、SiACAT1、SiACAT2和SiACAT3編碼序列設(shè)計(jì)熒光定量引物(表1)，產(chǎn)物片段大小限定在80～200 bp之間。qRT-PCR使用BIO-RAD CFX connect TM定量PCR儀(伯樂，美國)進(jìn)行擴(kuò)增，以谷子EF-1a-2作為內(nèi)參。擴(kuò)增體系10 μL：cDNA 1 μL、正反向引物各0.3 μL、2× SYBR Green qPCR Master Mix(蘇州宇恒生物科技有限公司)5 μL、ddH2O 3.4 μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性15 min；95℃變性10 s，60℃退火25 s，共40個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)樣品重復(fù)3次，采用2-△△CT法分析各基因相對表達(dá)量。

表1 qRT-PCR所用引物Table 1 Primers used in qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子硫解酶基因家族鑒定及蛋白理化性質(zhì)分析

通過對基因組注釋信息檢索和基于Pfam號(hào)的Hmmersearch篩選，得到相同的5個(gè)候選硫解酶基因家族成員(表2)。經(jīng)分析，5個(gè)基因編碼的蛋白均含有硫解酶的保守結(jié)構(gòu)域，參考和擬南芥硫解酶的比對結(jié)果，將5個(gè)成員分別命名為SiKAT1、SiKAT2、SiACAT1、SiACAT2 和SiACAT3。硫解酶基因編碼的蛋白氨基酸殘基數(shù)目在401～461之間，Seita.1G366300(SiKAT1) 和Seita.9G233000(SiKAT2)所編碼蛋白的氨基酸殘基數(shù)目相同，均為461，Seita.7G280000(SiACAT3)氨基酸殘基數(shù)目最少；蛋白分子量在41 043.23～48 318.21 Da之間，KAT1蛋白分子量最大，ACAT3蛋白分子量最?。坏入婞c(diǎn)在6.02～8.44之間，其中僅Seita.5G308600 (SiACAT2)和SiACAT3所編碼的蛋白為酸性蛋白，Seita.5G074000(SiACAT1)、Seita.1G366300和Seita.9G233000所編碼的蛋白為堿性蛋白；不穩(wěn)定系數(shù)在26.13～36.27之間，均為穩(wěn)定蛋白；脂溶指數(shù)在87.01～99.73之間，均具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性。

表2 谷子硫解酶基因家族信息Table 2 Foxtail millet thiolase gene family information

圖1 谷子和近緣物種硫解酶系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of thiolase in foxtail millet and closely related species

2.2 硫解酶基因家族系統(tǒng)發(fā)育分析、基因結(jié)構(gòu)和保守基序

為闡明谷子硫解酶家族和近緣物種間的進(jìn)化關(guān)系、推測成員的功能，對除谷子外的禾本科植物中的二穗短柄草、小麥、水稻、玉米、高粱，單子葉植物菠蘿和雙子葉植物擬南芥的硫解酶基因家族成員進(jìn)行了鑒定和分類(圖1)。對8個(gè)物種考察發(fā)現(xiàn)，硫解酶是一類在植物中成員稀有的蛋白，除了玉米和普通小麥，成員均僅為4～5個(gè)；在玉米和普通小麥中，硫解酶的成員分別為9和14。參考已有的擬南芥兩類硫解酶成員的劃分，將系統(tǒng)發(fā)育樹中8個(gè)物種的51個(gè)硫解酶成員分為兩個(gè)亞型，I型硫解酶：3-酮酰基輔酶A硫解酶(KAT)和II型硫解酶：乙酰乙酰輔酶A硫解酶(ACAT)。8種植物中，KAT 亞家族有23個(gè)成員，其中小麥5個(gè)、玉米5個(gè)、擬南芥3個(gè)、高粱2個(gè)、谷子2個(gè)、水稻2個(gè)、二穗短柄草2個(gè)、菠蘿2個(gè)；ACAT亞家族有28個(gè)成員，其中小麥9個(gè)、玉米4個(gè)、菠蘿3個(gè)、高粱3個(gè)、谷子3個(gè)、水稻2個(gè)、二穗短柄草2個(gè)、擬南芥2個(gè)。谷子中的KAT1和KAT2蛋白盡管分為一類，但進(jìn)化距離較遠(yuǎn)。同屬于ACAT亞家族的3個(gè)谷子蛋白中，ACAT2和ACAT3的進(jìn)化距離近，而ACAT1和二者進(jìn)化距離較遠(yuǎn)。

谷子的5個(gè)硫解酶編碼基因的基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析表明(圖2)，在基因結(jié)構(gòu)上，盡管谷子ACATs編碼基因都含有13個(gè)外顯子，但SiACAT1基因結(jié)構(gòu)與SiACAT2和SiACAT3有較大的區(qū)別。SiACAT1外顯子集中地分布于兩端，第7個(gè)內(nèi)含子位于基因序列的中部，占全長的30%。SiACAT2和SiACAT3外顯子和內(nèi)含子排布大體相同，SiACAT3比SiACAT2長0.7 kb。谷子KATs編碼基因都含有14個(gè)外顯子，外顯子和內(nèi)含子排布相似，長度均為2.8 kb。MEME在線軟件分析保守基序結(jié)果顯示，兩類硫解酶有且僅有“硫解酶N端”和“硫解酶C端”模體，表明谷子兩類硫解酶可能有相似的功能。

圖2 谷子硫解酶基因結(jié)構(gòu)和Motif分析Fig.2 Gene structure and Motif analysis in foxtail millet

2.3 谷子硫解酶編碼基因染色體定位和組內(nèi)、組間共線性分析

為了探究谷子硫解酶編碼基因的進(jìn)化歷史以及是否存在基因復(fù)制，基于基因組數(shù)據(jù)庫的注釋文件在染色體上定位了谷子硫解酶基因家族的5個(gè)成員(圖3)。結(jié)果表明，5個(gè)家族成員定位在谷子9條染色體的第1、第5、第7、第9號(hào)染色體上，其中SiACAT1和SiACAT2均位于第5號(hào)染色體上且分隔于染色體的6.4 cM和36.1 cM處，SiACAT3定位在第7號(hào)染色體的32.8 cM處；SiKAT1位于第1號(hào)染色體的41.4 cM處，SiKAT2位于第9號(hào)染色體的17.8 cM處。谷子基因組組內(nèi)同源性分析表明I型硫解酶的SiKAT1和SiKAT2同源。谷子、水稻和玉米的基因組組間共線性分析表明(圖4)，谷子II型硫解酶的SiACAT1和水稻的OsACAT1、玉米的ZmACAT1同源，表明谷子的ACAT1蛋白編碼基因與水稻、玉米的ACAT1編碼基因由同一個(gè)祖先基因進(jìn)化而來。相似的結(jié)論還存在于谷子SiKAT2和玉米ZmKAT1之間。

圖3 谷子硫解酶成員染色體分布Fig.3 Chromosome distribution map of thiolase gene family members in foxtail millet

2.4 谷子硫解酶多序列比對

前人研究認(rèn)為硫解酶是一類保守的蛋白，在原核、真核生物中普遍存在，并且具有特定的的催化功能[2,6,9]。為了明確谷子兩種亞型硫解酶蛋白序列的保守性和發(fā)揮催化功能的催化位點(diǎn)位置，將谷子、水稻、擬南芥的硫解酶蛋白序列一同進(jìn)行了多序列比對(圖5)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)谷子兩種亞型的硫解酶序列均較為保守，一致性為63.38%。參考擬南芥已知的硫解酶活性催化位點(diǎn)位置，在谷子、水稻硫解酶近N端95～137區(qū)間確定各自的硫解酶半胱氨酸催化位點(diǎn)，證實(shí)了谷子硫解酶催化功能的分子基礎(chǔ)。在擬南芥中，AtKATs被證實(shí)靶向過氧化物酶體且在N端含有過氧化物酶體靶向序列(peroxisomal target signal 2，PTS2)R-[I/L/Q]-X-X-X-X-X-H-L[3]。對谷子5個(gè)硫解酶蛋白序列比對發(fā)現(xiàn)，谷子KAT亞型的SiKAT1和SiKAT2蛋白序列在N端同樣含有PTS2序列。同樣的，水稻KAT亞型蛋白也含有PTS2序列。

圖4 谷子、水稻、玉米硫解酶編碼基因組內(nèi)、組間共線性分析Fig.4 Collinearity analysis of thiolase gene family in foxtail millet, rice and maize

注：黑色三角形表示催化位點(diǎn)；黑色下劃線表示PTS2序列。Note: The catalytic site was marked as triangle. Peroxisomal targeting signals 2(PTS2) was underlined.圖5 谷子、水稻、擬南芥硫解酶蛋白序列比對Fig.5 Sequence alignment of thiolase proteins from foxtail millet, rice and Arabidopsis

2.5 谷子硫解酶組織表達(dá)特異性

基因表達(dá)的組織特異性往往與其功能緊密相關(guān)。依據(jù)谷子5個(gè)硫解酶編碼基因的RNA-Seq數(shù)據(jù)繪制的基因表達(dá)熱圖顯示(圖6)，在谷子的根、莖、葉、穗部位，5個(gè)硫解酶基因表達(dá)水平具有組織特異性。I型硫解酶中，SiKAT1和SiKAT2在根、莖、葉、穗部位均有高表達(dá)，SiKAT1在4個(gè)部位表達(dá)量趨近一致，SiKAT2在葉片部位表達(dá)量最高。II型硫解酶表達(dá)量普遍較I型低，SiACAT3相較于SiACAT1和SiACAT2表達(dá)量普遍偏高。相較于較其他部位，3個(gè)II型硫解酶編碼基因均在葉片部位的表達(dá)量最低；SiACAT1在所測定的4個(gè)部位表達(dá)量均較低，在根部位的表達(dá)量較莖、葉、穗略高；總體而言，SiACAT2的表達(dá)量在5個(gè)基因中最低，在葉片部位幾乎沒有表達(dá)。

注:顏色由淺至深表示基因表達(dá)量由低到高。Note: Color from light to dark represent gene expression level from low to high.圖6 谷子硫解酶編碼基因組織表達(dá)譜Fig.6 Tissue expression profile of thiolase in foxtail millet

2.6 谷子硫解酶編碼基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件鑒定和干旱脅迫下表達(dá)譜

對谷子硫解酶編碼基因啟動(dòng)子區(qū)(2 000 bp)進(jìn)行順式作用元件分析(圖7)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)谷子硫解酶編碼基因啟動(dòng)子區(qū)均存在大量的順式作用元件，大體可分為3類：激素應(yīng)答類元件、脅迫應(yīng)答類元件和光應(yīng)答類元件。光應(yīng)答類元件在5個(gè)硫解酶編碼基因啟動(dòng)子區(qū)均廣泛分布。每個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)都含有激素應(yīng)答類元件和脅迫應(yīng)答類元件。其中，SiKAT1啟動(dòng)子區(qū)含有茉莉酸甲酯應(yīng)答元件CGTCA-motif/TGACG-motif，生長素應(yīng)答元件TGA-element，脫落酸應(yīng)答元件ABRE，厭氧誘導(dǎo)元件ARE；SiKAT2啟動(dòng)子區(qū)含有水楊酸應(yīng)答元件TCA-element，茉莉酸甲酯應(yīng)答元件CGTCA-motif/TGACG-motif，脫落酸應(yīng)答元件ABRE，赤霉素應(yīng)答元件TATC-box，低溫誘導(dǎo)元件LTR；SiACAT1啟動(dòng)子區(qū)含有茉莉酸甲酯應(yīng)答元件CGTCA-motif/TGACG-motif，赤霉素應(yīng)答元件P-box和GARE-motif，脫落酸應(yīng)答元件ABRE，低溫誘導(dǎo)元件LTR，干旱誘導(dǎo)元件MBS；SiACAT2啟動(dòng)子區(qū)含有茉莉酸甲酯應(yīng)答元件CGTCA-motif/TGACG-motif，赤霉素應(yīng)答元件GARE-motif，脫落酸應(yīng)答元件ABRE，水楊酸應(yīng)答元件TCA-element，干旱誘導(dǎo)元件MBS，厭氧誘導(dǎo)元件ARE；SiACAT3啟動(dòng)子區(qū)含有茉莉酸甲酯應(yīng)答元件CGTCA-motif/TGACG-motif，赤霉素應(yīng)答元件P-box，脫落酸應(yīng)答元件ABRE，厭氧誘導(dǎo)元件ARE。

圖7 谷子硫解酶編碼基因啟動(dòng)子區(qū)順勢作用元件Fig.7 Distribution of cis-acting element in promoters of genes encoding thiolase in foxtail millet

為了確定谷子硫解酶成員對干旱脅迫是否存在響應(yīng)，測定了硫解酶基因家族5個(gè)成員在自然干旱脅迫下的表達(dá)模式(圖8)。干旱脅迫下，SiKAT1的表達(dá)水平在根和葉部位均顯著上調(diào)，葉片部位上調(diào)至3.5倍，根部位上調(diào)至3.8倍；SiKAT2的表達(dá)水平在根部位顯著上調(diào)；SiACAT1和SiACAT2在根部位表達(dá)水平分別顯著上調(diào)至4倍和3倍;SiACAT3在根和葉片部位表達(dá)水平均顯著上調(diào)，在葉片部位表達(dá)量上調(diào)至3倍。表明硫解酶基因家族5個(gè)成員表達(dá)水平對干旱均有不同程度的響應(yīng)。

注：*：P<0.05水平差異顯著；**：P<0.01水平差異顯著；***：P<0.001水平差異顯著；****：P<0.0001水平差異顯著。Note: *: Significant difference at 0.05 level. **: Significant difference at 0.01 level. ***: Significant difference at 0.001 level. ****: Significant difference at 0.0001 level. 圖8 干旱脅迫下谷子硫解酶編碼基因表達(dá)模式Fig.8 Expression patterns of genes encoding thiolase under drought stress in foxtail millet

3 討論

本研究從谷子基因組中鑒定得到了5個(gè)硫解酶成員，與擬南芥、水稻、高粱等植物的硫解酶數(shù)量相近。較少的家族成員說明硫解酶功能可能比較單一保守，底物特異性較為廣泛。而玉米(9個(gè))和小麥(15個(gè))有著較多的家族成員，可能是玉米基因組存在轉(zhuǎn)座子以及小麥在進(jìn)化上融合了3個(gè)祖先基因組導(dǎo)致的。硫解酶兩類亞家族中，KAT亞家族的SiKAT1和SiKAT2盡管在多物種同源進(jìn)化關(guān)系上距離較遠(yuǎn)，但其相似的基因結(jié)構(gòu)、蛋白性質(zhì)和組間共線性表明，SiKAT1和SiKAT2可能發(fā)揮相似的功能。ACAT亞型的SiACAT2和SiACAT3在基因結(jié)構(gòu)和同源進(jìn)化層面上相近，而SiACAT1與二者相距較遠(yuǎn)，暗示了ACAT2和ACAT3可能存在功能冗余，而ACAT1蛋白可能發(fā)揮著獨(dú)立功能。同時(shí)谷子SiACAT1與水稻OsACAT1、玉米ZmACAT1同源，因此推測谷子SiACAT2和SiACAT3是因?yàn)檫m應(yīng)性發(fā)育由SiACAT1分化得到。蛋白序列比對在谷子和水稻KAT亞型蛋白的N端均發(fā)現(xiàn)PTS2序列，說明水稻和谷子的KAT蛋白可能都靶向過氧化物酶體并發(fā)揮催化脂肪酸β氧化的功能。

前人研究表明，KAT和ACAT均具有抵抗非生物脅迫的功能[14,31,27]。本研究發(fā)現(xiàn)谷子5個(gè)硫解酶成員均受到干旱誘導(dǎo)表達(dá)，且在啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)了脫落酸應(yīng)答元件ABRE以及干旱誘導(dǎo)元件MBS，說明谷子硫解酶成員對干旱的響應(yīng)可能通過ABA等途徑實(shí)現(xiàn)。同時(shí)，在啟動(dòng)子區(qū)還發(fā)現(xiàn)了生長素應(yīng)答元件、赤霉素應(yīng)答元件、低溫誘導(dǎo)元件、厭氧誘導(dǎo)元件、防御和應(yīng)答類元件等多種響應(yīng)類元件，說明谷子硫解酶還可能參與多種生物、非生物脅迫調(diào)節(jié)活動(dòng)。

硫解酶是一類在原核生物和真核生物中保守的蛋白酶，通過延長或分解碳鏈，產(chǎn)生乙酰輔酶A等代謝產(chǎn)物，影響多種生化反應(yīng)，進(jìn)而對生物體生長發(fā)育、抵抗外在脅迫產(chǎn)生作用。原核生物克氏梭菌有3個(gè)高度同源硫解酶編碼基因(thlA1、thlA2、thlA3)，能夠以乙醇和乙酸為碳源合成己酸和丁酸，為機(jī)體生長提供能量[32]。模式生物秀麗隱桿線蟲中的KAT被證實(shí)具有抗衰老的作用，是去乙?；窼irt2.1抗衰老的關(guān)鍵下游分子[33]。蜜蜂中的KAT被證實(shí)參與蜂王漿中主要活性物質(zhì)10-羥基-2葵烯酸(10-HDA)的生物合成[34]。在擬南芥中，過氧化物酶體β氧化的代謝產(chǎn)物乙酰輔酶A會(huì)影響組蛋白乙?；虳NA甲基化，而KAT蛋白作為β氧化的關(guān)鍵酶，可能通過調(diào)控乙酰輔酶A的生成影響植物的多種生理活動(dòng)[35]。本研究只對谷子硫解酶基因家族成員響應(yīng)干旱脅迫進(jìn)行了初步研究，對于酶活性以及家族成員功能驗(yàn)證尚未深入探究，下一步擬對硫解酶成員在多種非生物脅迫下的功能進(jìn)行驗(yàn)證，以期為谷子分子育種提供候選基因的參考依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究從谷子全基因組中鑒定得到5個(gè)硫解酶編碼成員，并依據(jù)功能劃分成了KAT亞型(2個(gè)成員)和ACAT亞型(3個(gè)成員)，5個(gè)基因成員分布在4條染色體上。5個(gè)成員都具有硫解酶的半胱氨酸活性催化位點(diǎn)且KAT亞型的蛋白具有靶向過氧化物酶體的PTS2序列。組織表達(dá)譜顯示，KAT亞型硫解酶在根、莖、葉、穗部位都有高表達(dá)，相較于KAT亞型的硫解酶，ACAT亞型硫解酶在根、莖、葉、穗部位表達(dá)量均相對較低。5個(gè)成員啟動(dòng)子區(qū)有多種光照、激素響應(yīng)、脅迫誘導(dǎo)元件，包括脫落酸應(yīng)答元件、茉莉酸甲酯應(yīng)答元件、干旱誘導(dǎo)元件、低溫誘導(dǎo)元件。自然干旱脅迫后5個(gè)成員的表達(dá)水平均有不同程度的上調(diào)。