邱盈盈，廖延智*，黃丹玲，2，林南熙，2，楊溢，2，陳成群

（1.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510030；2.廣東第二師范學(xué)院，廣東 廣州 510303）

隨著人們生活水平的提高，高質(zhì)量的健康食品是大眾的追求與要求，食品質(zhì)量安全備受人們關(guān)注。我國(guó)現(xiàn)已全面對(duì)抗生素的使用進(jìn)行了限制，這對(duì)傳統(tǒng)畜牧行業(yè)產(chǎn)生了較大的影響，研究表明，利用益生菌制劑調(diào)整動(dòng)物腸道菌群平衡可大大減少抗生素的使用［1-3］。目前用于飼用益生菌制劑的菌種主要有：芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌、放線菌等幾大類［3-5］，把其加工成飼料添加劑的形式進(jìn)行使用是經(jīng)濟(jì)效益較高的方式。受菌劑的制粒、制粉等加工工藝以及儲(chǔ)存條件的影響，菌體活性會(huì)有一定的下降，且菌體在經(jīng)過胃的消化會(huì)有一定數(shù)量的損失，因此“益生菌活著到達(dá)腸道”是需要解決的一大課題［3-5］。凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans），在分類學(xué)上屬于芽孢桿菌屬，能分解糖類產(chǎn)生乳酸，具有一般乳酸菌的益生特性，又因其能產(chǎn)芽孢從而具有強(qiáng)抗逆性、耐胃酸、耐高溫等特點(diǎn)，可應(yīng)用于醫(yī)療、食品、畜牧和水產(chǎn)等行業(yè)［6-9］。本試驗(yàn)以飼料為原料篩選一株凝結(jié)芽孢桿菌，對(duì)其進(jìn)行高密度發(fā)酵展開探究，為其應(yīng)用于飼用微生物菌劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株篩選原料

魚飼料、雞飼料、豬飼料。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈉10 g/L，pH 7.0。

篩選平板培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母粉 5 g/L、氯化鈉10 g/L、葡萄糖20 g/L、碳酸鈣20 g/L、瓊脂粉20 g/L，pH 7.0。

復(fù)篩培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈉10 g/L、葡萄糖50 g/L，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離及初篩

稱取25 g飼料，于225 mL無菌水中均質(zhì)做成110的稀釋樣液，繼續(xù)進(jìn)行十倍梯度稀釋，接種0.1 mL稀釋樣液涂布于篩選平板，于47℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，測(cè)定菌落直徑（C）和透明圈直徑（H），將H/C值較大的菌株進(jìn)行菌種保藏。

1.2.2 菌株復(fù)篩

將待測(cè)菌株分別接種于50 mL的LB培養(yǎng)基，置于47℃搖床中150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，制備成種子液。以5%的接種量將種子液轉(zhuǎn)接至 100 mL復(fù)篩培養(yǎng)基中，置于47℃搖床中150 r/min 振蕩培養(yǎng)28 h，測(cè)定發(fā)酵液中的乳酸含量以篩選產(chǎn)酸量強(qiáng)的菌株［10］。

1.2.3 菌株分子鑒定

取1 mL待測(cè)菌株的菌懸液，離心去上清并用去離子水重懸，取1 μL用作DNA模板，用高保真DNA聚合酶（PrimeSTAR HS DNA Polymerase，寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行PCR擴(kuò)增菌株的16S rDNA保守序列片段（使用通用引物27F和1492R）［10］。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，32個(gè)循環(huán)；72℃終延伸5 min。PCR擴(kuò)增DNA片段送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，并進(jìn)行菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。

1.2.4 菌株發(fā)酵特性探究

本研究以LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，探討了培養(yǎng)基碳源、氮源、有機(jī)物浸出液、培養(yǎng)基初始pH值，培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間等對(duì)菌株高密度發(fā)酵的影響，具體見表1。

表1 菌株發(fā)酵特性探究因素表

將菌種接種于50 mL的LB培養(yǎng)基，47℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h制備成種子液。以5%的接種量將種子液接種于100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，于搖床中200 r/min振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵液中的活菌數(shù)及芽孢數(shù)。

1.2.5 正交試驗(yàn)

用對(duì)菌株高密度發(fā)酵影響最大的四個(gè)因子設(shè)計(jì)4因素3水平正交試驗(yàn)。

1.2.6 菌株發(fā)酵液中活菌計(jì)數(shù)

取適量發(fā)酵液進(jìn)行十倍梯度稀釋，分別選擇10-7、10-8、10-9稀釋度的樣液接種計(jì)數(shù)平板進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)［11］。

1.2.7 菌株發(fā)酵液中芽孢率的測(cè)定

取適量發(fā)酵液裝于無菌試管中，置于85℃水浴鍋中保溫10 min，按1.2.6的方法測(cè)得芽孢數(shù)。芽孢率計(jì)算公式如式（1）所示：

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離初篩

經(jīng)過平板分離初篩，選出H/C值較大的菌株，結(jié)果如圖1所示。

圖1 各菌株在篩選平板上的H/C值圖

由圖1可知，在H/C值較大的15株菌中有6株菌大于3.5，分別是1號(hào)（3.6），3號(hào)（3.8），6號(hào)（3.9），8號(hào)（4.2），9號(hào)（3.7），11號(hào)（3.8），其它菌株的H/C值均小于3.5。為了進(jìn)一步確定性能優(yōu)良的菌株，以獲得的這6株菌為出發(fā)菌株進(jìn)行進(jìn)一步的篩選。

2.2 菌株復(fù)篩

為獲得一株遺傳穩(wěn)定性良好、產(chǎn)乳酸量高的菌株，對(duì)獲得的6株菌進(jìn)行5代傳代培養(yǎng)及發(fā)酵產(chǎn)乳酸性能測(cè)定，結(jié)果如圖2所示。

圖2 各菌株發(fā)酵液乳酸含量

從圖2可知，8號(hào)菌株產(chǎn)乳酸量最高（25.3 g/L）， 其它菌株的乳酸產(chǎn)量均小于25 g/L。經(jīng)過5次傳代轉(zhuǎn)接，且每一次轉(zhuǎn)接后均進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酸試驗(yàn)，8號(hào)菌株的產(chǎn)酸量均為最高。由此可見，8號(hào)菌株產(chǎn)乳酸量高、遺傳穩(wěn)定性良好，可作為本研究的出發(fā)菌進(jìn)行下一步研究，將此菌株命名為T-8。

2.3 菌種鑒定

對(duì)菌株T-8進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增其16S rDNA基因片段，經(jīng)過測(cè)序，其序列長(zhǎng)度為1469bp。在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行序列比對(duì)，在前100個(gè)相似性高的序列中，有97個(gè)為凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）菌株的16S rDNA基因片段，其它3個(gè)為凝結(jié)芽孢桿菌的基因組序列片段。

挑選序列相似度在95%以上的菌株的16S rDNA序列，用Mega 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。從圖3可看出，菌株T-8與Bacillus coagulans3986位于同一分支中，可認(rèn)定菌株T-8為凝結(jié)芽孢桿菌的一種。

圖3 菌株T-8的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 菌株高密度發(fā)酵特性探究

為探討菌株的高密度發(fā)酵特性，本研究以活菌數(shù)為指標(biāo)，在培養(yǎng)基碳源、氮源、有機(jī)物浸出液、培養(yǎng)基初始pH值、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間等方面展開研究。

2.4.1 碳源種類對(duì)菌株發(fā)酵特性的影響

為了探討培養(yǎng)基碳源種類對(duì)菌株T-8發(fā)酵特性的影響，本試驗(yàn)探討的碳源有：可溶性淀粉、玉米粉、玉米淀粉、果糖、葡萄糖、麥芽糖以及乳糖，結(jié)果如圖4所示。

從圖4可知，對(duì)照組LB培養(yǎng)基的生物量最低（活菌數(shù)為1.2×108CFU/mL），當(dāng)添加其他碳源時(shí)，菌株生物量均比對(duì)照組的高，其中生物量最高的是添加了玉米粉的培養(yǎng)基，活菌數(shù)達(dá)到4.8×108CFU/mL。生物量第二高的是麥芽糖，其活菌數(shù)為2.8×108CFU/mL。相比之下，玉米粉的活菌數(shù)比麥芽糖高出71.4%，比對(duì)照組高出300%。可知，碳源的種類對(duì)菌株T-8生物量的影響非常大，玉米粉是該菌株的最適合碳源。

圖4 碳源種類對(duì)菌株生物量的影響

2.4.2 最佳碳源玉米粉使用濃度對(duì)菌株發(fā)酵特性的影響

為了探究最佳碳源不同使用濃度對(duì)菌株生物量的影響，本試驗(yàn)探討玉米粉的使用濃度為：0～50 g/L，結(jié)果如圖5所示。

圖5 碳源玉米粉使用濃度對(duì)菌株生物量的影響

從圖5所知，添加低濃度的玉米粉即可大大提高菌株的密度，與對(duì)照組相比，添加2 g/L的玉米粉時(shí)，活菌數(shù)由1.2×108CFU/mL提升到3.6×108CFU/mL，增幅為200%。隨著玉米粉使用量的增加，菌株生物量逐步提高，在濃度為8 g/L時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到最高（5.7×108CFU/mL），繼續(xù)增加玉米粉的濃度反而導(dǎo)致菌密度的下降，可能是高濃度的玉米粉受熱糊化后使液體培養(yǎng)基變黏稠而影響菌株生長(zhǎng)。因此，后續(xù)試驗(yàn)中以玉米粉的使用量為8 g/L。

2.4.3 培養(yǎng)基氮源種類對(duì)菌株發(fā)酵特性的影響

為了探討培養(yǎng)基氮源種類對(duì)菌株T-8生物量的影響，以LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加使用的氮源有：豆粕粉、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、硫酸銨及尿素，結(jié)果如圖6所示。

圖6 氮源種類對(duì)菌株生物量的影響

從圖6可知，培養(yǎng)基中添加大分子復(fù)雜有機(jī)氮源（豆粕粉、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨）的菌株生物量均在6.0×108CFU/mL以上，添加小分子簡(jiǎn)單氮源（尿素、硫酸銨）的菌株生物量均小于2.0×108CFU/mL，因此大分子復(fù)雜有機(jī)氮源更有利于菌株T-8的生長(zhǎng)繁殖。在四種有機(jī)氮源中，豆粕粉的效果最佳，其活菌數(shù)為7.8× 108CFU/mL，比蛋白胨的高出8.3%，比酵母粉的高出14.7%，比牛肉膏的高出20%，因此，本試驗(yàn)選用豆粕粉為氮源。

2.4.4 最佳氮源豆粕粉使用濃度對(duì)菌株發(fā)酵特性的影響

為了探究最佳氮源的使用濃度對(duì)菌株生物量的影響，本試驗(yàn)探討豆粕粉使用濃度為：0～50 g/L， 結(jié)果如圖7所示。

從圖7所知，隨著豆粕粉使用濃度的增加，發(fā)酵液體中活菌數(shù)迅速上升，在15 g/L時(shí)達(dá)到最大值（8.2×108CFU/mL），與對(duì)照組相比，增幅為583.3%。當(dāng)豆粕粉使用濃度高于15 g/L時(shí)，活菌數(shù)呈下降趨勢(shì)，有可能是高濃度豆粕粉導(dǎo)致培養(yǎng)基變黏稠而影響菌株生長(zhǎng)。因此，后續(xù)試驗(yàn)中以豆粕粉的使用量為15 g/L。

圖7 氮源豆粕粉使用濃度對(duì)菌株生物量的影響

2.4.5 有機(jī)物浸出液對(duì)菌株發(fā)酵特性的影響

為了開拓農(nóng)副產(chǎn)品綜合利用的方向，本試驗(yàn)以小麥麩皮、米糠、玉米芯為原料制備浸出液，按一定比例添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，探討其對(duì)菌株T-8發(fā)酵特性的影響，結(jié)果如圖8所示。

圖8 有機(jī)物浸出液對(duì)菌株生物量的影響

從圖8所知，以LB培養(yǎng)基為對(duì)照，三種有機(jī)物浸出液對(duì)菌株高密度發(fā)酵的提升效果顯著，添加量為20%時(shí)，活菌數(shù)比對(duì)照組分別高出27倍（小麥麩皮）、24倍（玉米芯）、22倍（米糠），可能這些農(nóng)副產(chǎn)品含有適合菌株T-8生長(zhǎng)的成分，因此可大大提高其發(fā)酵密度。三種有機(jī)物浸出液中麩皮浸出液的效果最好，在相同的使用濃度下其發(fā)酵液活菌數(shù)均為最大，當(dāng)其使用量為80%時(shí)，發(fā)酵液中活菌數(shù)最多，達(dá)到2.8× 109CFU/mL。因此，在后續(xù)試驗(yàn)中培養(yǎng)基應(yīng)添加80%麩皮浸出液。

2.4.6 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)菌株發(fā)酵特性的影響

為了探究pH值對(duì)菌株T-8生物量的影響，本試驗(yàn)培養(yǎng)基初始pH值范圍為4.0～10.0，結(jié)果如圖9所示。

圖9 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)菌株生物量的影響

如圖9所示，介于微酸性與中性的環(huán)境有利于菌株T-8的生長(zhǎng)繁殖，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值在5.0～8.0之間時(shí)，發(fā)酵液活菌數(shù)在2.5×109 CFU/mL 以上，其中培養(yǎng)基初始pH為5.0時(shí)活菌數(shù)最高，達(dá)到3.3×109CFU/mL。當(dāng)pH低于4.0或高于9.0時(shí)，發(fā)酵液中菌密度均低于2.0×109CFU/mL，相對(duì)而言不適于菌株生長(zhǎng)繁殖。因此，后續(xù)試驗(yàn)中培養(yǎng)基的初始pH設(shè)定為5.0。

2.4.7 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株發(fā)酵特性的影響

為探究培養(yǎng)溫度對(duì)菌株T-8發(fā)酵特性的影響，本試驗(yàn)探討的溫度范圍為37～55℃，結(jié)果如圖10所示，溫度對(duì)菌株T-8的生長(zhǎng)尤為重要：當(dāng)溫度低于41℃時(shí)，菌株生長(zhǎng)緩慢；當(dāng)溫度高于41℃時(shí)，發(fā)酵液菌密度呈快速上升狀態(tài)，在47℃時(shí)達(dá)到最高（3.3×109CFU/mL）；隨后繼續(xù)提升培養(yǎng)溫度則呈快速下降趨勢(shì)，超過53℃時(shí)菌株生長(zhǎng)緩慢。從圖10所知，菌株的適合生長(zhǎng)溫度范圍為45～49℃，47℃的菌密度比45℃高出19.6%，比49℃高出11.9%，因此，菌株T-8的最適生長(zhǎng)繁殖溫度為47℃。

圖10 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株生物量的影響

2.4.8 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株發(fā)酵特性的影響

為探究時(shí)間對(duì)菌株T-8發(fā)酵特性的影響，本試驗(yàn)探討的培養(yǎng)時(shí)間范圍為12～48 h，結(jié)果如圖11所示。

圖11 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株生物量的影響

培養(yǎng)時(shí)間在12～20 h范圍時(shí)，菌株生物量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈快速上升趨勢(shì)，在24 h開始進(jìn)入穩(wěn)定期，在28 h時(shí)基本達(dá)到菌密度高峰（3.4×109CFU/mL），隨后繼續(xù)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間而菌密度維持相對(duì)恒定，說明菌株活力較好。因此，本試驗(yàn)的培養(yǎng)時(shí)間設(shè)為28 h。

2.5 菌株高密度發(fā)酵正交試驗(yàn)

為了更好地研究培養(yǎng)條件對(duì)菌株T-8發(fā)酵特性的影響，選擇單因素試驗(yàn)中影響較大的四個(gè)因子進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

如表2所示，根據(jù)極差R值可得出各因素對(duì)菌株T-8高密度發(fā)酵影響力依次為C>D>A>B，即小麥麩皮浸出液>培養(yǎng)溫度>玉米粉>豆粕粉，其中小麥麩皮浸出液的影響力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他三個(gè)因素。從各因素的k值可得出最優(yōu)化組合為A1B2C2D2，即菌株高密度發(fā)酵最適合培養(yǎng)基配方為：玉米粉6 g/L、豆粕粉15 g/L、小麥麩皮浸出液60%、酵母粉5 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化鈉10 g/L，pH 5.0。菌株T-8在此培養(yǎng)基中于47℃的搖床振蕩培養(yǎng)28 h，菌株活菌數(shù)高達(dá)4.8×109CFU/mL。經(jīng)過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，在此培養(yǎng)條件下，菌密度穩(wěn)定，芽孢率可達(dá)95.2%。

表2 菌株高密度發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以動(dòng)物飼料為材料，通過初篩、復(fù)篩和分子生物學(xué)鑒定，獲得一株既產(chǎn)乳酸又產(chǎn)芽孢的益生菌-凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）。凝結(jié)芽孢桿菌具有調(diào)控動(dòng)物腸道健康等多種生物學(xué)功能，主要體現(xiàn)在調(diào)節(jié)腸道功能紊亂、維持腸道菌群的微生態(tài)平衡、改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)、增強(qiáng)機(jī)體免疫能力、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收代謝以及提高生產(chǎn)性能等方面。我國(guó)于2016年將凝結(jié)芽孢桿菌列入《可用于食品的菌種名單》，目前也以添加劑的形式添加到動(dòng)物飼料中以提高動(dòng)物的長(zhǎng)速、改善肉類品質(zhì)、減少動(dòng)物抗生素的 使用。

本試驗(yàn)從培養(yǎng)基碳源、氮源、有機(jī)物浸出液、培養(yǎng)基pH、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間等方面展開研究以探索菌株T-8的發(fā)酵特性，結(jié)果顯示，最優(yōu)培養(yǎng)基配方為：玉米粉6 g/L、豆粕粉15 g/L、 小麥麩皮浸出液60%、酵母粉5 g/L、蛋白胨 10 g/L、氯化鈉10 g/L，pH 5.0。以5%的接種量將菌種轉(zhuǎn)接至此優(yōu)化培養(yǎng)基，在47℃的搖床中以200 r/min的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)28 h，菌株T-8的細(xì)胞密度達(dá)到4.8×109CFU/mL，芽孢率達(dá)到95.2%。本試驗(yàn)可為益生菌凝結(jié)芽孢桿菌應(yīng)用于飼用微生物菌劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。