邱益彬 馬艷琴 沙媛媛 朱逸凡 蘇二正 雷鵬 李莎 徐虹

（1. 南京林業(yè)大學(xué)輕工與食品學(xué)院，南京 210037；2. 南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院，南京 211816；3. 揚(yáng)州日興生物科技股份有限公司，揚(yáng)州 225601）

隨著合成生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，越來(lái)越多的底盤(pán)微生物細(xì)胞被開(kāi)發(fā)用于生物再制造中。作為一種重要的微生物細(xì)胞工廠，解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），又名瓦雷茲芽孢桿菌，在多種工業(yè)酶（如蛋白酶、α-淀粉酶、β-葡聚糖酶和纖溶酶等）及化學(xué)品（如核苷酸、氨基酸和生物聚合物等）的生物制造中都具有廣泛的用途［1］。因其高效的胞外蛋白分泌能力，B. amyloliquefaciens在作為高效蛋白重組表達(dá)宿主菌方面展現(xiàn)出了巨大的發(fā)展?jié)摿Γ▓D1）。在近幾十年來(lái)，對(duì)該菌的研究主要集中在應(yīng)用領(lǐng)域開(kāi)發(fā)和生物發(fā)酵工藝過(guò)程控制等方面。隨著基因測(cè)序和精準(zhǔn)遺傳操作技術(shù)的快速發(fā)展，在分子層面對(duì)B. amyloliquefaciens進(jìn)行定向設(shè)計(jì)與改造越來(lái)越趨于成熟化。而本文通過(guò)介紹B. amyloliquefaciens的分子遺傳操作包括遺傳轉(zhuǎn)化、遺傳操作工具開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，將為未來(lái)構(gòu)建B. amyloliquefaciens微生物細(xì)胞工廠用于高附加值產(chǎn)品的合成提供有效借鑒。

圖1 利用解淀粉芽孢桿菌微生物細(xì)胞工廠合成不同生物基產(chǎn)品示意圖Fig. 1 Schematic diagram of different bio-based products synthesized by B. amyloliquefaciens cell factory

1 B. amyloliquefaciens遺傳操作工具研究進(jìn)展

1.1 B. amyloliquefaciens中的質(zhì)粒工具介紹

作為重要的微生物遺傳操作工具，枯草芽孢桿菌模式菌株的常用質(zhì)粒如穿梭質(zhì)粒pHY300PLK（復(fù)制蛋白R(shí)epB）、組成型表達(dá)載體pMA5（復(fù)制蛋白R(shí)epB）、誘導(dǎo)型表達(dá)載體pHT01和pHT43（復(fù)制蛋白R(shí)epA）、溫度敏感型質(zhì)粒pDR（復(fù)制蛋白R(shí)epF）均可在B. amyloliquefaciens中使用（如表1所示），極大簡(jiǎn)化了對(duì)該菌株的遺傳操作。表1對(duì)B.amyloliquefaciens菌株中所使用的常規(guī)質(zhì)粒工具進(jìn)行了匯總。除此之外，越來(lái)越多具有獨(dú)特功能的內(nèi)源質(zhì)粒在B. amyloliquefaciens中陸續(xù)地被發(fā)現(xiàn)，這為B. amyloliquefaciens的研究提供了新的分子生物學(xué)遺傳研究工具［3，10］。為克服質(zhì)粒不穩(wěn)定而實(shí)現(xiàn)外源基因的穩(wěn)定表達(dá)，筆者利用內(nèi)源質(zhì)粒p2Sip的天然復(fù)制子和復(fù)制蛋白構(gòu)建了適用于B. amyloliquefaciens的新型質(zhì)粒pNX01，連續(xù)傳代100次后，質(zhì)粒的損耗率僅為4%。這一結(jié)果表明攜帶有內(nèi)源性復(fù)制子的pNX01具有很好的穩(wěn)定性，并且它適合外源蛋白在B.amyloliquefaciens中穩(wěn)定表達(dá)［4］。

1.2 B. amyloliquefaciens中重要的合成生物學(xué)基因元件介紹

除了質(zhì)粒工具外，近年來(lái)對(duì)B. amyloliquefaciens研究過(guò)程中同樣積累了一批啟動(dòng)子、SD序列、終止子等作為合成生物學(xué)重要的基因元件（表1）。根據(jù)作用方式及功能可分為兩類：組成型啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。Liao等［11］通過(guò)RNA-seq數(shù)據(jù)分析對(duì)B. amyloliquefaciensXH7中的強(qiáng)啟動(dòng)子進(jìn)行了篩選，以半乳糖苷酶bgaB基因作為報(bào)告基因，篩選出了sigW基因的啟動(dòng)子Pr2能夠有效的啟動(dòng)外源基因的表達(dá)。黃酮素的ykuN基因的啟動(dòng)子P41是通過(guò)構(gòu)建啟動(dòng)子探針載體從B. amyloliquefaciens基因組中篩選獲得的，該啟動(dòng)子因具有較強(qiáng)的啟動(dòng)活性，可作為高效特異性啟動(dòng)子用于代謝途徑改造和異源蛋白表達(dá)中［12］。筆者以果聚糖酶為報(bào)告基因分別在B. amyloliquefaciensNB中 測(cè) 試 了PhpaⅡ、Pamy、PsrfA、PgsiB、Psig和Pvgb等組成型啟動(dòng)子。結(jié)果表明PhpaⅡ具有較強(qiáng)表達(dá)強(qiáng)度，Pamy屬于中等強(qiáng)度啟動(dòng)子，而PsrfA和PgsiB的活性較弱［13］。除此以外，P43啟動(dòng)子在B. amyloliquefaciens中也被證實(shí)是一種特征明顯的強(qiáng)組成啟動(dòng)子，被廣泛用于酶過(guò)表達(dá)和代謝工程［5］。在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子中，Pgrac（IPTG誘導(dǎo)型）、PxylA（木糖誘導(dǎo)型）和PsacB（蔗糖誘導(dǎo)型）已報(bào)道成功實(shí)現(xiàn)蛋白在B. amyloliquefaciens中高水平表達(dá)［9］。除了啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)錄水平能影響蛋白表達(dá)之外，核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）能夠提高翻譯起始率并最終影響蛋白質(zhì)表達(dá)水平的關(guān)鍵基因元件。其中B. amyloliquefaciens中的α-淀粉酶的SD序列研究的較多［14］。Liao等［12］利用RBS Calculator v1.1對(duì)P41啟動(dòng)子的RBS序列進(jìn)行設(shè)計(jì)并優(yōu)化后，最終實(shí)現(xiàn)了半乳糖苷酶活性提高了約200%，表明在翻譯水平上通過(guò)優(yōu)化RBS序列能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)蛋白表達(dá)強(qiáng)度的調(diào)控。轉(zhuǎn)錄終止子作為基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)步驟，能夠提高mRNA的穩(wěn)定性和酶的表達(dá)同樣被應(yīng)用于解淀粉芽孢桿菌系統(tǒng)中，目前研究報(bào)道最多的主要是α-淀粉酶的終止子Tamy、Tfd等［4］。在B.amyloliquefaciens中進(jìn)行外源基因表達(dá)時(shí)，對(duì)終止子在轉(zhuǎn)錄過(guò)程發(fā)揮的作用研究的較少，而后續(xù)更多合成生物學(xué)元件挖掘?qū)⒇S富和完善B. amyloliquefaciens這一操作平臺(tái)的運(yùn)用。

表1 B. amyloliquefaciens中所使用的合成生物學(xué)基因元件Table 1 Synthetic biological genetic elements used in B.amyloliquefaciens

1.3 無(wú)痕基因組操作工具在B. amyloliquefaciens中的建立

隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，高效的細(xì)胞工廠成為研究人員的迫切需求，建立快速、高效改造的分子生物學(xué)的操作也成為B. amyloliquefaciens研究的熱點(diǎn)。利用同源重組方法是B. amyloliquefaciens突變菌株的構(gòu)建的主要研究方法。由于轉(zhuǎn)化方法不成熟，轉(zhuǎn)化率低使得基于PCR片段或不復(fù)制的整合型質(zhì)粒介導(dǎo)的同源重組方式很難在該菌株中廣泛的運(yùn)用［3］。為了不使用抗生素基因作為篩選標(biāo)記，2010年，Zakataeva等［15］將溫度敏感型質(zhì)粒首次運(yùn)用到B. amyloliquefaciens中，與整合型質(zhì)粒相比，借助溫敏型質(zhì)?？稍诘蜏叵逻M(jìn)行復(fù)制而提高溫度造成質(zhì)粒丟失，極大地提高了同源重組成功率，依靠PCR篩選，建立了B. amyloliquefaciens的無(wú)標(biāo)記基因敲除新方法?；谝陨戏椒?，楊慧林等［16］利用溫敏型質(zhì)粒pKS1成功敲除了ptsG和ptsHI基因，考察了磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（PTS）移除對(duì)菌株長(zhǎng)特性及鳥(niǎo)苷產(chǎn)率的影響。而采用雙交換時(shí)借助第二次同源重組過(guò)程將質(zhì)粒從染色體上移除的過(guò)程概率非常低，這使得利用溫敏型質(zhì)粒敲除依靠PCR篩選雙交換轉(zhuǎn)化子的工作量大且十分的低效。而反向篩選標(biāo)記（counterselectable marker，CSM）的發(fā)現(xiàn)很好的解決了上述的問(wèn)題。位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)Cre/loxP是通過(guò)催化兩個(gè)loxP位點(diǎn)之間發(fā)生特異性重組，可以在敲除后通過(guò)重組消除抗生素標(biāo)記。但這兩個(gè)loxP位點(diǎn)進(jìn)行同組后仍會(huì)在基因組留下一段疤痕［17］。在B.amyloliquefaciens中含有嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶upp基因的菌株在5-FU底物上可引起宿主細(xì)胞死亡，而失去upp標(biāo)記的突變菌株則可存活并易于篩選出來(lái)。Zhang等［18］以u(píng)pp基因作為反向篩選標(biāo)記，并結(jié)合溫敏型質(zhì)粒pKSV7在B. amyloliquefaciensLL3中成功去除47 Kb的bae基因簇。利用該方法能夠在B.amyloliquefaciens中實(shí)現(xiàn)連續(xù)多基因無(wú)痕敲除，且極大提高重組菌的雙交換篩選效率。然而在使用upp作為反向篩選標(biāo)記時(shí)，需要首先刪除宿主的upp基因，而開(kāi)發(fā)不依賴于宿主基因型的CSM更容易進(jìn)行無(wú)標(biāo)記操作。PheS蛋白的A294G突變體可以在翻譯過(guò)程中將苯丙氨酸類似物（如p-Cl-Phe）錯(cuò)誤地結(jié)合到細(xì)胞蛋白中，從而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。Zhou等［19］構(gòu)建了反向選擇標(biāo)記pheS*，該標(biāo)記通過(guò)點(diǎn)突變的枯草芽孢桿菌168來(lái)源的苯丙氨酸t(yī)RNA合成酶α亞單位基因pheS，攜帶該突變體基因pheS*的B. amyloliquefaciens細(xì)胞能夠在5 mmol/L對(duì)氯苯丙氨酸存在下出現(xiàn)100%的死亡率?；谠摲聪蚝Y選標(biāo)記，Zhou等［19］成功在B. amyloliquefaciensSQR9中刪除了37 Kbbmy基因簇。筆者利用構(gòu)建的pheS*反向篩選標(biāo)記系統(tǒng)，成功將γ-PGA調(diào)控信號(hào)pgsR表達(dá)元件無(wú)痕整合到B. amyloliquefaciens基因組中，獲得的重組菌γ-PGA產(chǎn)量提升了8%［3］。借助這些反向篩選標(biāo)記，已極大加快了在B. amyloliquefaciens中無(wú)痕基因組操作的進(jìn)程。具體操作流程如圖2-B所示，采用溫度敏感型敲除質(zhì)粒雖能夠顯著提高B. amyloliquefaciens中同源重組的效率，整個(gè)操作周期需要經(jīng)歷單、雙交換兩輪篩選過(guò)程導(dǎo)致了操作周期較長(zhǎng)（5 d以上）。

近年來(lái)，CRISPR-Cas已發(fā)展成為生命科學(xué)領(lǐng)域備受關(guān)注的熱點(diǎn)研究方向，基于這種簡(jiǎn)單、靈活、高效的基因組編輯技術(shù)，人們可以按照意愿對(duì)工業(yè)微生物進(jìn)行快速設(shè)計(jì)與改造。CRISPR-Cas9系統(tǒng)主要包含Cas9蛋白和sgRNA兩個(gè)組成部分［20］。其作用的原理主要通過(guò)表達(dá)sgRNA，使靶序列與基因?qū)?yīng)的互補(bǔ)序列進(jìn)行配對(duì)，而sgRNA中的其他序列則形成能夠被Cas9識(shí)別的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，在PAM（protospacer-adjacent motif）序列上游2-3堿基間將靶基因的DNA單鏈切斷。但大多數(shù)原核生物的基因組被切開(kāi)后，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在人為增加同源修復(fù)序列作用下，斷鏈的DNA能通過(guò)HDR（homologydirected repair）途徑進(jìn)行準(zhǔn)確的基因組重組。因此，通過(guò)將同源重組技術(shù)和CRISPR-Cas9技術(shù)相結(jié)合，構(gòu)建含Cas9、sgRNA和同源修復(fù)序列HR在內(nèi)的表達(dá)載體，就能對(duì)原核基因進(jìn)行高效準(zhǔn)確編輯［13］。近期，筆者首次針對(duì)B. amyloliquefaciens，開(kāi)發(fā)了能夠快速對(duì)基因組多基因無(wú)痕修飾的CRISPR-Cas9 Nickase（CRISPR-Cas9n）雙質(zhì)粒系統(tǒng)（圖2）。該雙質(zhì)粒系統(tǒng)由IPTG誘導(dǎo)的Cas9n表達(dá)質(zhì)粒（pNXCas9n）和溫度敏感型質(zhì)粒介導(dǎo)到的sgRNA表達(dá)元件（pDR-gRNA）組成。通過(guò)選擇upp基因作為報(bào)告基因，在B. amyloliquefaciensNB中的敲除效率實(shí)現(xiàn)了100%［13］。與pheS*介導(dǎo)的同源重組敲除相比，該CRISPR/Cas9n系統(tǒng)包括質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、基因編輯和質(zhì)粒消除等整個(gè)操作過(guò)程均可在4 d內(nèi)完成（圖2-B）。除了更高的基因編輯效率外，CRISPR-Cas9n系統(tǒng)具有操作方便、可連續(xù)進(jìn)行基因敲除等優(yōu)點(diǎn)，可作為B. amyloliquefaciens基因組操作強(qiáng)有力的工具。為滿足在B. amyloliquefaciens中實(shí)現(xiàn)多個(gè)靶向基因的基因表達(dá)調(diào)控的需求，筆者進(jìn)一步開(kāi)發(fā)了基于dCas9的基因沉默技術(shù)CRISPRi系統(tǒng)，該系統(tǒng)的關(guān)鍵作用元件為dCas9蛋白以及靶基因的sgRNA以實(shí)現(xiàn)dCas9蛋白對(duì)靶基因在轉(zhuǎn)錄水平的穩(wěn)定的抑制。以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP基因?yàn)閳?bào)告基因，通過(guò)設(shè)計(jì)sgRNA靶向EGFP表達(dá)框的不同位置，EGFP的表達(dá)水平被調(diào)控到原來(lái)的28%-68.7%（圖3），該結(jié)果證實(shí)CRISPR-dCas9系統(tǒng)可以在B. amyloliquefaciens中實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)水平的可控調(diào)節(jié)［21］。綜上所述的工具建立將為完善和推動(dòng)B. amyloliquefaciens平臺(tái)用于生物制造提供重要保證。

圖2 CRISPR-Cas9n基因編輯技術(shù)在B. amyloliquefaciens中的操作流程示意圖Fig. 2 A schematic diagram of operation while CRISPR-Cas9n gene editing technology in B. amyloliquefaciens

圖3 CRISPR-dCas9n基因沉默技術(shù)在B. amyloliquefaciens中的構(gòu)建Fig. 3 Construction of CRISPR-Cas9n gene silencing technology in B. amyloliquefaciens

2 解淀粉芽孢桿菌遺傳轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展

高效的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立通常是在微生物進(jìn)行分子生物學(xué)操作的基礎(chǔ)。而對(duì)野生型B.amyloliquefaciens菌株的遺傳操作時(shí)通常受限于轉(zhuǎn)化這一步驟。影響B(tài). amyloliquefaciens轉(zhuǎn)化的因素主要有3個(gè)：（1）大部分B. amyloliquefaciens無(wú)法自發(fā)形成感受態(tài)，這嚴(yán)重限制了該宿主進(jìn)行遺傳操作。（2）B. amyloliquefaciens往往具有分泌多糖或γ-聚谷氨酸等胞外聚合物的特性，這給感受態(tài)菌體的收集和外源質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化帶來(lái)嚴(yán)重的影響。而通過(guò)優(yōu)化轉(zhuǎn)化過(guò)程培養(yǎng)時(shí)間，將菌體OD600控制在0.2-0.6之間來(lái)進(jìn)行菌體的收集和感受態(tài)的制作，則很大程度上可以避免胞外聚合物對(duì)感受態(tài)制備產(chǎn)生的不利影響［3］。（3）B. amyloliquefaciens自身的限制性修飾系統(tǒng)也會(huì)影響外源質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率。筆者前期工作中發(fā)現(xiàn)，從E. coliDH5α（Dam和Dcm甲基化酶修飾）宿主中抽提的質(zhì)粒均無(wú)法實(shí)現(xiàn)B.amyloliquefaciens的轉(zhuǎn)化，而先轉(zhuǎn)到甲基化酶缺陷型E. coliGM2163菌株中對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行去甲基化處理則大大提高了B. amyloliquefaciens的轉(zhuǎn)化效率，這一操作同樣發(fā)也適用于其它芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化。目前關(guān)于B.amyloliquefaciens的轉(zhuǎn)化方法主要有化學(xué)法、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和電轉(zhuǎn)化法（表2）。

表2 不同方法轉(zhuǎn)化B. amyloliquefaciens轉(zhuǎn)化效率的研究Table 2 Study on the transformation efficiency of B. amyloliquefaciens by different methods

2.1 電轉(zhuǎn)化法

電轉(zhuǎn)化法因具有較高的轉(zhuǎn)化效率而被廣泛的使用芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化中。1999年，一種在以不同濃度的甘露醇和山梨醇作為滲透壓保護(hù)劑進(jìn)行改進(jìn)的電轉(zhuǎn)化方法使得枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化效率達(dá)到1.4×106轉(zhuǎn)化子/μg DNA，該轉(zhuǎn)化方法的建立成為了革蘭氏陽(yáng)性菌電轉(zhuǎn)化法的一個(gè)里程碑［24］。此后對(duì)B. amyloliquefaciens的轉(zhuǎn)化方法都是在此方法的基礎(chǔ)上改進(jìn)或通過(guò)添加不同的細(xì)胞壁弱化劑而建立的。2011年，Zhang等［22］通過(guò)在高滲培養(yǎng)基中添加弱化細(xì)胞壁的DL-蘇氨酸或甘氨酸，使得B. amyloliquefaciensTA208電轉(zhuǎn)化法的效率達(dá)到（8.94±0.77）×105CFU/μg。有研究報(bào)道，在B.amyloliquefaciens中主要存在著R.BamH I/M.BamH I系統(tǒng)，凡含有未經(jīng)甲基化修飾的GGATCC片段的DNA往往會(huì)受到自身的限制性修飾系統(tǒng)的降解而無(wú)法轉(zhuǎn)化到B. amyloliquefaciens中。筆者通過(guò)移除了B. amyloliquefaciens菌株中自身的BamH I限制酶系統(tǒng)后，使用溫度敏感型質(zhì)粒pDR和高拷貝質(zhì)粒pMA5進(jìn)行轉(zhuǎn)化效率測(cè)試，經(jīng)電轉(zhuǎn)條件優(yōu)化后改造NB菌株轉(zhuǎn)化效率分別提高了100倍和174倍，分別 達(dá) 到（4.94±0.42）×104和（6.15±0.19）×103CFU/μg DNA［3］。在B. amyloliquefaciens菌株的轉(zhuǎn)化中，電轉(zhuǎn)化因操作簡(jiǎn)便、轉(zhuǎn)化效率高等優(yōu)點(diǎn)已成為B.amyloliquefaciens菌株轉(zhuǎn)化最有效方法之一。而近年來(lái)針對(duì)高效電轉(zhuǎn)化條件探究為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)菌株的遺傳改造提供了有效保障。

2.2 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法

作為外源基因?qū)爰?xì)菌的常規(guī)方法，聚乙二醇（PEG）誘導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化同樣在B.amyloliquefaciens中有過(guò)研究報(bào)道。Akamatsu等［25］在B. amyloliquefaciens中首次嘗試了PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法，成功實(shí)現(xiàn)了克隆質(zhì)粒pTP4的轉(zhuǎn)化。為進(jìn)一步提高B. amyloliquefaciens原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率，通過(guò)原生質(zhì)體再生制備和PEG誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化，最終實(shí)現(xiàn)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率達(dá)到了（2-4）×105CFU/μg［23］。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化作為一種比較穩(wěn)定高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系，可能為某些轉(zhuǎn)化困難的野生型B. amyloliquefaciens菌株提供了新的研究手段。

2.3 化學(xué)轉(zhuǎn)化法

研究表明，在芽孢桿菌感受態(tài)形成過(guò)程中，ComK基因能夠促進(jìn)細(xì)菌對(duì)外源DNA的吸收、重組修復(fù)及細(xì)胞分裂等，是負(fù)責(zé)調(diào)控感受態(tài)形成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。而通過(guò)在野生型B. amyloliquefaciens菌株中表達(dá)ComK基因，使ComK達(dá)到一定的閾值，則有利于細(xì)胞形成感受態(tài)并實(shí)現(xiàn)外源質(zhì)粒在野生型B.amyloliquefaciens中的轉(zhuǎn)化［2］。在B. amyloliquefaciens中通過(guò)木糖誘導(dǎo)啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)枯草芽孢桿菌來(lái)源的ComK基因來(lái)人工誘導(dǎo)感受態(tài)形成，在最優(yōu)條件下質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化效率在［（129±20.6）-（1.7±0.1）］×105CFU/μg之間［2］。該工作建立的一種高效的B. amyloliquefaciens菌株化學(xué)轉(zhuǎn)化新方法，為后續(xù)的基因功能研究提供強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。

3 B. amyloliquefaciens微生物細(xì)胞工廠應(yīng)用的研究進(jìn)展

3.1 B. amyloliquefaciens用于外源蛋白重組表達(dá)的運(yùn)用

作為多種食品工業(yè)酶的生產(chǎn)菌株，B. amyloliquefaciens因擁有極強(qiáng)蛋白分泌能力常被作為外源蛋白表達(dá)的理想宿主。目前，已有多種淀粉酶、蛋白酶等已成功實(shí)現(xiàn)在B. amyloliquefaciens的異源重組合成。高溫球菌來(lái)源的α-淀粉酶（PFA）具有耐熱性、半衰期長(zhǎng)和在低pH條件下的最佳活性，在淀粉加工方面具有巨大的工業(yè)應(yīng)用潛力。在實(shí)驗(yàn)中通過(guò)對(duì)影響表達(dá)的因素包括基因密碼子偏好性優(yōu)化、啟動(dòng)子優(yōu)化、表達(dá)宿主菌株選擇等策略，最終在B. amyloliquefaciens進(jìn)行異源表達(dá)，PFA的產(chǎn)量達(dá)到2 714 U/mL，約為枯草桿菌和大腸桿菌的3 000倍和14倍［26］。孫娟娟等［27］在B. amyloliquefaciensBF7658中利用宿主自身的表達(dá)元件成功實(shí)現(xiàn)了Bacillus deramificans普魯蘭酶的分泌表達(dá)。除淀粉酶外，多種蛋白酶同樣在B. amyloliquefaciens中進(jìn)行表達(dá)。為構(gòu)建羽毛降解的工程菌，辛青龍等［28］以B. amyloliquefaciensTCCC111018為表達(dá)宿主，優(yōu)化了來(lái)源于地衣芽孢桿菌ATCC 16580的角蛋白酶基因kerA，最終獲得的重組菌株在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中36 h酶活力達(dá)到1 361.54 U/mL，12 h內(nèi)即可將羽毛全部降解。而在王慧等［29］的研究中，在高產(chǎn)中性蛋白酶和角蛋白酶的菌株B. amyloliquefaciensK11中以克勞氏芽孢桿菌堿性蛋白酶基因BcaprE為報(bào)告基因，對(duì)經(jīng)適配性優(yōu)化獲得的通用分泌表達(dá)盒PamyQSPaprE進(jìn)行隨機(jī)突變文庫(kù)，篩選出了20株表達(dá)分泌強(qiáng)度較野生型更佳的突變株，為B. amyloliquefaciens高效分泌表達(dá)平臺(tái)奠定了基礎(chǔ)。

與大部分芽孢桿菌類似，蛋白質(zhì)在解淀粉芽孢桿菌中的分泌主要依賴蛋白分泌的Sec途徑、Tat途徑和非經(jīng)典分泌途徑等［30］。這些途徑引導(dǎo)蛋白分泌的信號(hào)肽元件為解淀粉芽孢桿菌胞外分泌表達(dá)提供了研究手段。在B. amyloliquefaciensNK-ΔLP中通過(guò)考察7個(gè)不同信號(hào)肽（SPamyE、SPbgls、SPbpr、SPnprB、SPnprE、SPwapA和SPyncM）對(duì)于果聚糖蔗糖酶的胞外分泌效率，其中SPyncM信號(hào)肽對(duì)于果聚糖蔗糖酶的分泌效率最高，達(dá)到89.9%［9］。筆者在B.amyloliquefaciensNBC中優(yōu)化了SPamyQ、SPsacB、SPnpr、SPyncM和SPsacC等5個(gè)信號(hào)肽來(lái)強(qiáng)化果聚糖酶在B.amyloliquefaciens中的分泌表達(dá)，其中SPnpr信號(hào)肽具有較好的分泌效率［13］。鑒于不同信號(hào)肽對(duì)于外源蛋白的表達(dá)具有不同程度的影響，在實(shí)際使用時(shí)我們需要將異源表達(dá)蛋白和信號(hào)肽進(jìn)行人工組裝與優(yōu)化，以達(dá)到更高的宿主適配性。在未來(lái)針對(duì)B.amyloliquefaciens菌株開(kāi)發(fā)基于高分泌效率的信號(hào)肽通用表達(dá)體系將進(jìn)一步拓展該菌在蛋白胞外分泌表達(dá)方向的獨(dú)特運(yùn)用。

3.2 工程改造B. amyloliquefaciens用于多種代謝產(chǎn)物的合成

3.2.1 γ-聚谷氨酸 γ-聚谷氨酸（γ-PGA）是一種以谷氨酸單體通過(guò)γ-酰胺鍵連接而成的生物高分子，基于其獨(dú)特的生物活性，γ-PGA在日化、食品、環(huán)保、農(nóng)業(yè)和飼料工業(yè)等領(lǐng)域均具有廣泛的應(yīng)用［31］。為建立低成本、高效率的γ-PGA微生物發(fā)酵工藝，筆者從菊芋塊莖根部土壤中分離篩選到一株直接利用菊芋菊糖一步法發(fā)酵合成γ-PGA的生產(chǎn)菌株B. amyloliquefaciensNX-2S，進(jìn)一步通過(guò)ARTP選育、發(fā)酵過(guò)程調(diào)控等研究建立了同步糖化發(fā)酵菊粉制備γ-PGA的新工藝［32-33］。鑒于該菌株能夠偏好性的利用菊粉粗提液作為碳源且無(wú)需添加谷氨酸，是γ-PGA合成與設(shè)計(jì)的理想工業(yè)化底盤(pán)微生物。通過(guò)進(jìn)一步對(duì)該菌株參與菊粉水解、還原糖代謝和γ-PGA降解等涉及γ-PGA合成的多個(gè)代謝模塊進(jìn)行系統(tǒng)改造，最終重組菌株的γ-PGA產(chǎn)量達(dá)到（32.14±0.38）g/L［13］。在此基礎(chǔ)上，筆者所在團(tuán)隊(duì)圍繞多元分子量γ-PGA可控合成為目標(biāo)，開(kāi)發(fā)了以降解酶為“開(kāi)關(guān)”調(diào)控產(chǎn)物分子量和濃度的新策略。設(shè)計(jì)的CRISPRi系統(tǒng)采用了多重sgRNA組合的策略來(lái)對(duì)γ-PGA降解酶pgdS進(jìn)行動(dòng)態(tài)調(diào)控，通過(guò)對(duì)降解酶的可控表達(dá)實(shí)現(xiàn)了多元分子量γ-PGA（高分子量：＞800 kD、中分子量：400-600 kD、低分子量：50-100 kD）的制備［21］。為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)超低分子量γ-PGA的調(diào)控合成，進(jìn)一步利用谷氨酸消旋酶基因racE和γ-PGA合成酶基因pgsA對(duì)γ-PGA的立體化學(xué)構(gòu)型進(jìn)行了調(diào)控，并通過(guò)耦合γ-PGA降解酶，成功實(shí)現(xiàn)了目前的工業(yè)化生產(chǎn)精度難以滿足超低分子量（＜10 kD）γ-PGA的合成［34］。該工作進(jìn)一步拓寬了γ-PGA下游運(yùn)用場(chǎng)景。

3.2.2 胞外多糖 作為一類重要的活性物質(zhì)，B.amyloliquefaciens胞 外 多 糖（extracellular polysaccharide，EPS）近年來(lái)受到越來(lái)越多的關(guān)注。Zhao等［35］從B. amyloliquefaciensGSBa-1分離純化胞外多糖，純化后的EPS主要由葡萄糖單糖組成，通過(guò)核磁共振譜進(jìn)一步證實(shí)為由一個(gè)三糖重復(fù)單元組成的α-葡聚糖，可能存在兩個(gè)α-（1→3）和一個(gè)α-（1→6）葡萄糖鍵。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該EPS具有較強(qiáng)的清除DPPH和羥基自由基的活性，以及中等的超氧陰離子清除和金屬離子螯合活性。這是對(duì)解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生的具有強(qiáng)抗氧化活性的葡聚糖的首次表征。Han等［36］篩選得到一株產(chǎn)多糖的B. amyloliquefaciensLPL061，該胞外多糖具有免疫活性、乳化性、和熱穩(wěn)定性。Chen等［37］發(fā)現(xiàn)菌株B. amyloliquefaciensMD-b1所分秘的胞外多糖具有抑制胃癌細(xì)胞MC-4和SGC-7901的生長(zhǎng)活性。Yang等［38］從B. amyloliquefaciensC-1中分離得到兩種水溶性胞外多糖組分EPS-1和EPS-2，純化后的EPS-1中葡萄糖/甘露糖/半乳糖/阿拉伯糖的相對(duì)比例為15∶4∶2∶1，分子量為79.6 kD，EPS-2中葡萄糖和甘露糖的相對(duì)比例為3∶1，分子量為19.8 kD。結(jié)果表明EPS-1具有較強(qiáng)的還原能力和自由基、陰離子清除能力，而EPS-2沒(méi)有檢測(cè)到抗氧化活性。這些研究都表明B. amyloliquefaciens胞外多糖在食品和醫(yī)療領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景。除此之外，B. amyloliquefaciens還發(fā)現(xiàn)能夠合成胞外果聚糖。Cai等［39］從B. amyloliquefaciensJN4中分離純化出一種β-2，6鏈低聚果糖levan，它由果糖和葡萄糖組成，包含一個(gè)β-（2，6）連接的Fruf殘基主鏈，每6個(gè)殘基上有一個(gè)單獨(dú)的2-連接的Fruf分支。此外，B. amyloliquefaciens所產(chǎn)的這種果聚糖對(duì)ETEC具有較強(qiáng)的抗黏附活性，可作為一種預(yù)防腹瀉的抗黏附劑。為了提高B. amyloliquefaciensNKΔLP合成果聚糖的產(chǎn)量，F(xiàn)eng等［40］通過(guò)移除6個(gè)蛋白酶相關(guān)基因、生物膜基質(zhì)蛋白TasA和γ-PGA合成酶基因簇（PgsBCA），改造后的重組菌株的果聚糖產(chǎn)量提高了103%。果聚糖蔗糖酶SacB作為催化果聚糖合成的關(guān)鍵酶，研究表明Y237S的突變能明顯提高該酶催化合成果聚糖的效率［41］。通過(guò)在B. amyloliquefaciens中優(yōu)化果聚糖蔗糖酶SacB的表達(dá)，最終果聚糖產(chǎn)量達(dá)到102 g/L［9］。目前對(duì)于B.amyloliquefaciens胞外多糖的篩選和結(jié)構(gòu)鑒定相關(guān)工作研究的較多，未來(lái)對(duì)于這些多糖生理功能研究和運(yùn)用領(lǐng)域的拓展將進(jìn)一步提升B. amyloliquefaciens菌株在工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用潛力。

3.2.3 核苷酸類 目前市場(chǎng)上的核苷類產(chǎn)品，包括肌苷、鳥(niǎo)苷和腺苷等，大多數(shù)是通過(guò)芽孢桿菌屬進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)的。鳥(niǎo)苷（guanosine），又名鳥(niǎo)嘌呤核苷，在食品和醫(yī)藥工業(yè)中都具有重要的應(yīng)用。Wu等［42］通過(guò)誘變獲得了一株B. amyloliquefaciens突變菌株，鳥(niǎo)苷產(chǎn)量可達(dá)20.82 g/L。何逵夫等［43］考察了鳥(niǎo)苷生物合成途徑中的3個(gè)關(guān)鍵酶編碼基因（prs，purF，guaB）的過(guò)表達(dá)對(duì)B. amyloliquefaciens發(fā)酵生產(chǎn)鳥(niǎo)苷的影響，結(jié)果表明prs和purF基因協(xié)同表達(dá)后鳥(niǎo)苷產(chǎn)量提高14.4%，糖苷轉(zhuǎn)化率增加6.8%。Liao等［44］通過(guò)解除嘌呤生物合成途徑的嘌呤操縱子和優(yōu)化呼吸鏈的能量生成等手段，使得鳥(niǎo)苷產(chǎn)量提升了41%。除了鳥(niǎo)苷外，B. amyloliquefaciens同樣還是肌苷和腺苷等核苷酸類生產(chǎn)的重要生產(chǎn)菌株［45-46］，這為開(kāi)發(fā)合成更多核苷酸類產(chǎn)品提供指導(dǎo)作用。

3.2.4 抗菌脂肽類物質(zhì)B. amyloliquefaciens能夠生產(chǎn)多種次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有很強(qiáng)的抗病抑菌作用。而報(bào)道最多的就是合成一系列抗菌活性的代謝物，脂肽（lipopeptides），常見(jiàn)的脂肽包括枯草表面活性素（surfactin）、伊枯草菌素（iturin）和豐原素（fengycin），這些合成的基因簇在B. amyloliquefaciens基因組都已被發(fā)現(xiàn)。Surfactin是一種功能最強(qiáng)的生物表面活性劑，在農(nóng)業(yè)、食品和制藥等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。通過(guò)對(duì)B. amyloliquefaciensMD4-12菌株合成surfactin發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化優(yōu)化，surfactin產(chǎn)量達(dá)到1.25 g/L［47］。周澤宇等［48］在敲除了伊枯草菌素（iturin）和豐原素（fengycin）合成酶基因簇的菌株中，分別過(guò)表達(dá)了與Swarming相關(guān)的SwrC蛋白、可能的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白YbfB和4′-磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶Sfp，surfactin最高產(chǎn)量達(dá)50.17 mg/L。近期研究發(fā)現(xiàn)，納米鐵顆?？梢杂行г黾蛹?xì)胞膜的通透性來(lái)增強(qiáng)surfactin分泌，surfactin滴度由原來(lái)的4.93 g/L提高到7.15 g/L［49］。為提高iturin A抗生素環(huán)脂肽的積累，Dang等［50］在B.amyloliquefaciensLL3菌株中對(duì)iturin A生物合成基因進(jìn)行改造，通過(guò)在itu操縱子的上游插入一個(gè)強(qiáng)組成啟動(dòng)子C2up來(lái)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)，最終iturin A的產(chǎn)量達(dá)到37.35 mg/L。另外，Sang-Cheol等［51］從石油污染土壤中分離出一株生物表面活性劑產(chǎn)生菌B. amyloliquefaciensLSC04，經(jīng)鑒定該菌株主要合成的是fengycin脂肽類物質(zhì)。為進(jìn)一步提高野生型B.amyloliquefaciensES-2-4的豐原素（fengycin）產(chǎn)量，利用基因組重排技術(shù)，獲得了一株高產(chǎn)重組F2-72（FMB72）菌株，其豐霉素產(chǎn)量提高了8.30倍。采用熒光定量RT-PCR方法分析，F(xiàn)MB72菌株在轉(zhuǎn)錄水平上的豐霉素合成酶基因（fenA）表達(dá)量是ES-2-4野生型的12.77倍［52］。而通過(guò)建立兩個(gè)組成型啟動(dòng)子P59和PrepU替換pps操縱子的原生啟動(dòng)子同樣能夠提高解淀粉芽孢桿菌ES-2中豐霉素的產(chǎn)量［53］。為進(jìn)一步明確codY、comA、degU和spo0A這些基因?qū)τ谥念惿锖铣傻恼{(diào)控作用，分別敲除了B. amyloliquefaciensfmbJ菌株中的codY、comA、degU和spo0A基因，bacillomycin D的產(chǎn)量明顯降低，它們的缺失導(dǎo)致fmbJ代謝通路、群體感應(yīng)系統(tǒng)和物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄本水平發(fā)生巨大變化。此外，敲除codY基因和degU基因?qū)τ趕urfactin產(chǎn)率均顯著提高，而調(diào)節(jié)因子CodY對(duì)fengycin的合成無(wú)顯著影響［54］。隨著越來(lái)越多的脂酰結(jié)構(gòu)的被發(fā)現(xiàn)設(shè)計(jì)和技術(shù)平臺(tái)的完善，未來(lái)對(duì)于脂肽類新結(jié)構(gòu)化合物的開(kāi)發(fā)將成為新的關(guān)注點(diǎn)。

3.2.5 其它化學(xué)品B. amyloliquefaciens還能夠合成乙偶姻（acetoin）、2, 3-丁二醇（2, 3-butanediol）等這些生物基化學(xué)品。通過(guò)兩階段轉(zhuǎn)速調(diào)控在B.amyloliquefaciensFMME044菌株中獲得了51.2 g/L的乙偶姻［55］。Luo在采用適應(yīng)性進(jìn)化方法提高B.amyloliquefaciens菌株中乙酰丙酮的產(chǎn)量［56］。在王詩(shī)卉等［57］的研究者通過(guò)采用復(fù)合誘變篩選獲得最優(yōu)突變株B. amyloliquefaciensH-5，最終乙偶姻產(chǎn)量達(dá)85.2 g/L。B. amyloliquefaciens同樣是2, 3-丁二醇的合成菌株，Yang等［58］分離到一株能產(chǎn)2, 3-丁二醇的GRAS菌株B. amyloliquefaciensB10-127，該菌株發(fā)酵96 h時(shí)2, 3-丁二醇的最大濃度可達(dá)92.3 g/L，產(chǎn)率可達(dá)0.96 g/L/h。而進(jìn)一步過(guò)表達(dá)甘油醛-3-磷酸脫氫酶和2, 3-丁二醇脫氫酶提高B.amyloliquefaciens中2, 3-丁二醇的產(chǎn)量［59］。

4 結(jié)語(yǔ)

隨著現(xiàn)代科技的不斷進(jìn)步與成熟，合成生物學(xué)近年來(lái)得到了迅猛發(fā)展，是未來(lái)生物制造的重要趨勢(shì)，前景十分廣闊。在過(guò)去十幾年的發(fā)展中，合成生物學(xué)領(lǐng)域圍繞基因合成、基因編輯和基因組裝、生物元件挖掘及應(yīng)用、人工合成生物體系的建立和重構(gòu)等方面積累了一定的工作。B. amyloliquefaciens是一類能夠合成生物活性化合物包括蛋白、脂肽、氨基酸、核苷酸和胞外多糖等重要的平臺(tái)化微生物，在食品、農(nóng)業(yè)、日化和醫(yī)療領(lǐng)域都有較為廣泛的應(yīng)用（表3）。長(zhǎng)期以來(lái)，由于B. amyloliquefaciens的轉(zhuǎn)化體系不完善、操作平臺(tái)不成熟使得該菌株在代謝工程改造方面的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其他芽孢桿菌屬。近年來(lái)隨著合成生物學(xué)技術(shù)和CRISPR遺傳操作工具的迅速發(fā)展，解淀粉芽孢桿菌菌株用于合成生物學(xué)“智造”的潛力逐漸被挖掘。未來(lái)針對(duì)B.amyloliquefaciens開(kāi)展更多產(chǎn)物的人工合成通路設(shè)計(jì)和代謝網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)、底盤(pán)的適配性組裝與優(yōu)化等，將進(jìn)一步豐富該底盤(pán)菌株在生物工程領(lǐng)域中的運(yùn)用。

表3 基于B. amyloliquefaciens合成的生物基產(chǎn)品匯總Table 3 Summary of the synthesis of biobased products based on B. amyloliquefaciens species