甘佳偉，韓曉增，鄒文秀

(1.中國科學(xué)院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，哈爾濱 150081；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

0 引 言

叢枝菌根真菌(Arbuscularmycorrhizalfungi，AMF)是一類在自然界中廣泛分布的能夠與大部分高等植物根系共生的土壤微生物[1]。研究表明，AMF能與80%以上的陸地植物根系形成叢枝菌根(AM)共生體[2-3]。AM共生體由根系、菌絲、囊泡、真菌的叢枝以及孢子等一系列結(jié)構(gòu)組成，在這種共生體中由AMF提供植物生長所需的養(yǎng)分和水分，而植物則將光合作用產(chǎn)生的碳水化合物提供給真菌[4]?；Y料和分子進化數(shù)據(jù)表明，AMF在3.5～4.5億年前[5]就與古老的植物形成了菌根共生體，AMF與植物經(jīng)過長期的相互作用以及共同進化使得AM共生體在自然生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用[6]。Jeffries等[7]研究表明，AM共生體的形成可以明顯地改善宿主植物對礦質(zhì)營養(yǎng)的吸收能力(特別是磷元素)，還能增強宿主植物抗病、抗干旱以及抗鹽害等諸多抗逆能力。同時，AMF具有功能的多樣性[8]，這種多樣性除了促進土壤團聚體的形成和有機碳的固定，還可以改善植物吸收營養(yǎng)的能力與植物抗逆能力。由于AMF的離體純培養(yǎng)仍然是一個難題，多數(shù)學(xué)者研究關(guān)注的是AMF的菌根分泌物。1996年，Wright等[9]從美國亞特蘭大市中部地區(qū)未受擾動的酸性土壤中提取了一種特殊的蛋白質(zhì)。這種蛋白質(zhì)是在121 ℃高溫下用20 mmol·L-1的檸檬酸鈉溶液提取出來的，這種方法在下文簡稱Wright經(jīng)典法。初步判斷，這種蛋白是由AMF產(chǎn)生的并被命名為球囊霉素(Glomalin)。隨著研究的深入以及對球囊霉素檢測方法的不斷改進，將這種特殊的蛋白命名為球囊霉素有一些片面。因為，在最初的提取中認(rèn)為這種蛋白全部是AMF分泌的基因蛋白，而忽略了蛋白中是否含有其他非來源于AMF的成分，因此Rosier和Rillig等[10]認(rèn)為用“球囊霉素相關(guān)土壤蛋白”(Glomalin related soil protein，GRSP)代替球囊霉素更為合適。而且，許多的研究者贊同Rillig等人的觀點。但Wright等[11]認(rèn)為，可以繼續(xù)將“glomalin”用來表示從土壤中浸提出球囊霉素這種蛋白質(zhì)和土壤其他蛋白質(zhì)的總稱，而用“Glomalin”專指球囊霉素蛋白自身。至今，研究者們對球囊霉素的命名尚無定論，科學(xué)家們根據(jù)自己的研究需要采取相應(yīng)的命名方式。在大多數(shù)的研究中，人們并沒有把AMF的基因產(chǎn)物球囊霉素(glomalin)與用Wright法提取出的產(chǎn)物GRSP進行嚴(yán)格的區(qū)分，一般情況下二者是通用的，表達的是一個概念。本文將用Wright經(jīng)典法提取出來的產(chǎn)物稱為“GRSP”(球囊霉素相關(guān)土壤蛋白)，而AMF分泌的基因產(chǎn)物稱為球囊霉素(Glomalin)以便于區(qū)分。筆者在Web of Science所有數(shù)據(jù)庫中以Glomalin為主題，以2011-2020這10年為時間區(qū)間進行檢索，從發(fā)文量和被引用頻次分析發(fā)現(xiàn)(圖1與圖2)，球囊霉素的研究熱度在逐年上升，可能是因為其在生態(tài)系統(tǒng)中的作用較為廣泛而逐漸被關(guān)注，將成為未來的研究熱點。

圖1 土壤中球囊霉素近十年的發(fā)文量Fig.1 The number of publications on glomalin field in soil in the last decade

圖2 土壤中球囊霉素近十年的被引頻次Fig.2 Citation frequencies of glomalin in soil in the last decade

根據(jù)對GRSP結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的研究，因其高的含碳量以及好的熱穩(wěn)定性使得GRSP在土壤團聚體、土壤有機碳以及對植物的抗逆方面有著重要的意義。本文對GRSP的發(fā)現(xiàn)、分類、性質(zhì)以及GRSP在土壤生態(tài)系統(tǒng)中的作用進行簡要綜述，為深入了解GRSP以及對GRSP的生態(tài)學(xué)功能提供參考。

1 GRSP的發(fā)現(xiàn)

1996年，美國馬里蘭大學(xué)的Wright等[9]在AMF菌絲的表面提取出了一種未知蛋白，這種未知蛋白是在121 ℃高溫下用20 mmol·L-1的檸檬酸鈉溶液從AMF菌絲表面提取得到的，能和單克隆抗體(MAb32B11)發(fā)生免疫性熒光反應(yīng)，并且發(fā)現(xiàn)這種未知蛋白非常穩(wěn)定，不溶于水，只能用中性至堿性的檸檬酸鈉溶液才能提取出來。初步認(rèn)為，這種未知蛋白是由AMF分泌的專性蛋白，并將其稱為球囊霉素。研究發(fā)現(xiàn)，球囊霉素是由球囊霉屬AMF分泌的糖蛋白[12]，球囊霉素產(chǎn)生于AM共生體的根內(nèi)菌絲或者是根外菌絲的表面，并且當(dāng)菌絲死亡后球囊霉素可以從菌絲表面脫落進入到根際土壤中[13]。為了將這種從AMF菌絲表面提取的蛋白與從根際土壤中提取的蛋白進行比對，1998年，Wright等[14]進行了進一步的實驗，取亞特蘭大市中部的土壤用pH為8.0、濃度為50 mmol·L-1的檸檬酸鈉溶液在121 ℃、高壓條件下提取出球囊霉素。將球囊霉素與從AMF菌絲提取的蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)比較分析,發(fā)現(xiàn)他們的條帶基本一致。因此認(rèn)為，這種在高溫高壓下用中性至堿性的檸檬酸鈉溶液從土壤中提取球囊霉素的方法是可行的，并且初步認(rèn)定球囊霉素是由AMF產(chǎn)生的。

到目前為止，球囊霉素是被發(fā)現(xiàn)的唯一一種由AMF分泌進入土壤中的蛋白[15]，因AMF在土壤中廣泛存在[16]，當(dāng)AMF死亡裂解后其分泌物也將大量進入和沉積到土壤中。目前研究者們對AMF在生態(tài)系統(tǒng)中的物質(zhì)代謝和能量循環(huán)中的作用和扮演的角色已經(jīng)作了非常多的研究[17]，而對于AMF分泌物(如球囊霉素)的研究不如對AMF本身在生態(tài)系統(tǒng)中的功能的研究那樣深入和廣泛。例如，對球囊霉素的具體結(jié)構(gòu)尚不清楚，限制了對球囊霉素功能的研究[15]。但近年來隨著分子色譜、質(zhì)譜和電鏡技術(shù)的發(fā)展，人們對球囊霉素的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)有了初步的認(rèn)識。Gadkar和Rillig等[18]在2006年通過對AMF進行離體培養(yǎng)，然后利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析方法獲得了球囊霉素的基因序列，并對此基因序列進行原始的推測描述，初步假定球囊霉素是熱激蛋白60(heat shock protein 60,HSP60)的同系物。他們的研究為今后球囊霉素結(jié)構(gòu)的描述和性質(zhì)的推測奠定了基礎(chǔ)，未來研究學(xué)者還可以通過更為精密、更為先進的手段來觀測球囊霉素的結(jié)構(gòu)。

2 GRSP的分類

因球囊霉素的結(jié)構(gòu)未知并且提取方法有限，目前并不能從土壤中提取出高純度球囊霉素[9,13,15]。最初測定球囊霉素方法的步驟為，先用檸檬酸鈉從土壤中提取出球囊霉素浸提液，然后采用考馬斯亮藍法(Bradford)測定提取液中的球囊霉素含量，或者應(yīng)用AMF單克隆抗體MAb32B11進行酶聯(lián)免疫(ELISA)反應(yīng)測定[9]。依據(jù)球囊霉素提取的難易程度和與單克隆抗體MAb32B11的反應(yīng)結(jié)果，把球囊霉素分為2組4類。分別為：(1)總球囊霉素(Total glomalin，TG)；(2)易提取球囊霉素(Easily extractable glomalin,EEG)；(3)免疫反應(yīng)球囊霉素(Immunoreactive total glomalin，IRTG)；(4)免疫反應(yīng)易提取球囊霉素(Immunoreactive easily extractable glomalin,IREEG)[9,12,14]。這種在高溫條件下用檸檬酸鈉從土壤中提取球囊霉素的方法并沒有考慮土壤中除球囊霉素外的其它物質(zhì)是否被破壞(如腐殖酸，土壤細菌產(chǎn)生的熱穩(wěn)態(tài)蛋白)[19]，由該方法提取的球囊霉素尚不能確定為真正意義上的球囊霉素。因此，Rillig等[20]建議用球囊霉素相關(guān)土壤蛋白(glomalin-related soil protein,GRSP)代替球囊霉素(“Glomalin”)，表示從土壤中浸提出并用Bradford法和ELASA法所檢測到的蛋白質(zhì)，這樣將更好的與土壤中的其它物質(zhì)進行區(qū)分。并將用Bradford法測定的總球囊霉素(TG)更改為考馬斯亮藍法檢測的土壤蛋白質(zhì)(Bradford-reactive soil protein,BRSP)、易提取球囊霉素(EEG)更名為易提取的考馬斯亮藍法檢測的土壤蛋白質(zhì)(Easily extractable BRSP,EE-BRSP)，而用ELASA法測定的免疫反應(yīng)球囊霉素(IRTG)更名為免疫反應(yīng)土壤蛋白 (Immunoreactive soil protein,IRSP)、免疫反應(yīng)易提取球囊霉素(IREEG)更改為免疫反應(yīng)易提取性土壤蛋白 (Easily extracted immunoreactive soil protein,EE-IRSP)[10]。本文將依舊采取Wright[11]改進后的命名以T-GRSP代替TG，EE-GRSP代替EEG進行論述。

3 GRSP的性質(zhì)以及提取測定方法

3.1 GRSP的物理化學(xué)性質(zhì)

GRSP通常狀態(tài)下不溶于水[9]，不易被蛋白酶水解，具有一定的熱穩(wěn)定性，因此在土壤中的性質(zhì)極為穩(wěn)定。早期研究者們用Wright經(jīng)典法提取GRSP時，認(rèn)為所提取出的蛋白均為AMF分泌的球囊霉素，但經(jīng)過后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)，提取出的蛋白中含有來源于非AMF的組分，并且對于球囊霉素和GRSP的結(jié)構(gòu)也不清楚。Wright等[14]最先對GRSP進行了分析，通過聚丙烯凝膠電泳(SDS-PAGE)對來自AMF菌絲的蛋白和來自土壤的GRSP進行了比較，結(jié)果表明二者在電泳圖中條帶基本一致，因此，Wright認(rèn)為GRSP是一種由N連接的糖蛋白。之后，Nichols的研究表明，GRSP主要由蛋白質(zhì)和碳水化合物組成[21]，根據(jù)土壤性質(zhì)的不同GRSP中還有含有Fe3+、Ca2+等陽離子[22-23]。為了揭示GRSP的結(jié)構(gòu)，Gadkar和Rilling[18]采用液相色譜—質(zhì)譜法對一條來自根內(nèi)球囊菌與單克隆抗體Mab32B11發(fā)生免疫反應(yīng)的蛋白條帶進行部分測序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該蛋白與熱激蛋白60(heat shock protein 60,HSP60)的17個氨基酸序列相似。然后采取退化性PCR,從根內(nèi)球囊菌的cDNA文庫中分離出一種全長1 773 bp能夠編碼HSP60的cDNA,這種蛋白的N端含有3個糖基化位點，C端有一串氨基酸殘，由此認(rèn)為GRSP是一種糖蛋白，并且為揭示GRSP的結(jié)構(gòu)第一次提供了直接性的證據(jù)。接著Schindler等[24]對不同礦質(zhì)土壤和有機土壤進行核磁共振和紅外光譜分析，其中GRSP分別占礦質(zhì)土壤和有機土壤總碳量的25%和52%，分析發(fā)現(xiàn)GRSP中含有芳香烴(42%～49%)、羧基(24%～30%)、碳水化合物(4%～16%)和低脂肪族和碳(4%～11%)。這些結(jié)果表明，GRSP不是典型的糖蛋白而更像是一種腐殖酸。但是因為提取腐殖酸的方法和提取GRSP的方法類似，所以在提取GRSP時腐殖酸也同時提取了出來，GRSP的核磁共振譜與腐殖酸的核磁共振譜相似很有可能是以上的原因所造成的，因此，Schindler的結(jié)論有待商榷。

3.2 GRSP的提取測定方法

想要對GRSP進行研究和分析，GRSP的提取和測定方法是關(guān)鍵。目前的測定方法一般分為兩個步驟，第一步是先將GRSP從土壤中提取出來，第二步用不同的測定方法進行分析。目前經(jīng)常采用的方法為考馬斯亮藍法(Bradford法)與AMF單克隆抗體(Mab32B11)酶聯(lián)免疫(ELISA)反應(yīng)法[20]。由此可見，在對GRSP進行測定時，提取GRSP是關(guān)鍵步驟，將會對后續(xù)測定產(chǎn)生顯著的影響結(jié)果。GRSP的提取步驟為：稱取0.25 g土壤，加入2 ml pH為8.0濃度50 mmol·L-1的檸檬酸鈉溶液在121℃下浸提90 min，然后立即將浸提液在10 000 r·min-1下離心6 min后移走上清液，再加入等體積的浸提液，相同溫度下提取60 min，同樣條件下離心并移走上清液，連續(xù)浸提直至上清液無色或淡黃色為止，合并上清液而后以備測定[9]。在此過程中，加入的浸提液的體積、pH值、高溫滅菌時間和離心時間均會對浸提產(chǎn)生影響，進而影響GRSP的測定結(jié)果。Janos等[25]建議在GRSP的提取過程中應(yīng)保持加入浸提液的體積相同，高壓滅菌的時間相同以確保實驗的準(zhǔn)確性。

上述為提取GRSP的經(jīng)典方法為總量球囊霉素土壤相關(guān)蛋白(T-GRSP)的提取方法，T-GRSP一般反映土壤中GRSP的積累水平。如果需要測定土壤中新生成的球囊霉素含量，易提取球囊霉素相關(guān)土壤蛋白(EE-GRSP)反映了土壤中新生成的GRSP含量。提取方法與T-GRSP略有不同，具體為：稱取土樣0.25 g，加入2 ml pH7.0、濃度20 mmol·L-1的檸檬酸鈉溶液，121 ℃下浸提30 min，然后立即將浸提液4 000 rpm離心10 min，而后將上清液轉(zhuǎn)移出來以備測定。無論是T-GRSP，還是EE-GRSP的測定都是采用的考馬斯亮藍法，考馬斯亮藍法的測定前提是在提取過程中除了AMF產(chǎn)物之外的土壤中的其他蛋白或者大部分蛋白都被破壞。但Rosier等[10]研究發(fā)現(xiàn)，考馬斯亮藍法無法區(qū)分土壤中的其他非來源于AMF的物質(zhì)(如丹寧)，因此，在對T-GRSP和EE-GRSP測定時會產(chǎn)生一定的偏差。

4 GRSP在土壤生態(tài)系統(tǒng)中的作用

4.1 對土壤團聚體的作用

土壤團聚體是土壤結(jié)構(gòu)的基本單元，良好的土壤結(jié)構(gòu)對于植物生長有著重要的作用[26]。土壤團聚體的數(shù)量和穩(wěn)定性是衡量土壤質(zhì)量的重要指標(biāo)，提高土壤團聚體的數(shù)量和穩(wěn)定性有利于維持良好的土壤結(jié)構(gòu)。土壤團聚體的形成是一個復(fù)雜的過程涉及到物理-化學(xué)和生物的因素[27]。物理-化學(xué)過程是黏粒的絮凝和吸附性陽離子的作用。在物理-化學(xué)過程中土壤團聚體的形成可以概述為：(1)微小的土塊或絮狀物與土壤中的有機聚合物在靜電引力的作用下或者在多價金屬陽離子的作用下形成有機無機聚合物；(2)這些有機無機聚合物通過多價陽離子與腐殖酸的絮凝形成微團聚體(<0.25 mm)[28]。生物過程是通過土壤動物的活動、植物根系和土壤中菌絲對土壤顆粒的纏繞作用以及微生物產(chǎn)生的有機膠結(jié)物質(zhì)進而促進團聚體形成的過程。在生物過程中土壤團聚體的形成可以概述為：微團聚體在微生物殘體以及菌絲和植物根系的作用下形成(>0.25 mm)的大團聚體[27]。在土壤團聚體形成的過程中，菌根共生體起到了重要的作用[29]。AM共生體中的植物根系以及AMF在土壤中形成的巨大外生菌絲網(wǎng)絡(luò)可以膠聯(lián)土壤顆粒，通過植物根系與菌絲的分泌物將這些土壤顆粒聚集在一起，促進土壤團聚體的形成。其中，土壤團聚體的形成過程中土壤團聚體的穩(wěn)定性與膠結(jié)物質(zhì)緊密相關(guān)[30]，膠結(jié)物質(zhì)包括無機膠結(jié)物質(zhì)和有機膠結(jié)物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，GRSP是一種持久性的有機膠結(jié)物質(zhì)[9]，具有較強的膠結(jié)作用，比其他的土壤化合物膠結(jié)土壤顆粒的能力強3～10倍。因GRSP是一種性質(zhì)非常穩(wěn)定的蛋白[31]，并且對微生物的分解有強烈的抵抗作用，所以這類蛋白可以保護其他蛋白不被破壞，保護土粒和團聚體結(jié)構(gòu)不被破壞，從而減緩團聚體中不穩(wěn)定的碳被分解的速率。GRSP中還有一些金屬離子[23]，使得土壤顆粒在這些陽離子的橋鍵作用下固定到菌絲表面從而形成較為穩(wěn)定的土壤大團聚體，還可以增加土壤團聚體表面的疏水性從而提高土壤團聚體的水穩(wěn)性[32]，因此，GRSP對土壤團聚體的形成過程和維持團聚體的穩(wěn)定性特別是對于大團聚體(>0.25 mm)起著重要的作用。研究表明，GRSP在自然生態(tài)系統(tǒng)中廣泛存在[33]，包括森林生態(tài)系統(tǒng)，農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)和草地生態(tài)系統(tǒng)等，GRSP在不同生態(tài)系統(tǒng)中的含量和對生態(tài)系統(tǒng)的貢獻也不同。

景航等[34]以黃土高原人工油松林為對象，對其皆伐后恢復(fù)的不同植被群落地(幼林地、灌木地、撂荒地)0～20 cm土層的團聚體穩(wěn)定性和GRSP的分布特征進行分析，結(jié)果表明，不同恢復(fù)措施下團聚體中EE-GRSP(易提取球囊霉素相關(guān)蛋白)分布趨勢與團聚體穩(wěn)定性一致，并且相比于其他粒徑團聚體，大團聚體(>0.25 mm)中T-GRSP(總量球囊霉素相關(guān)蛋白)可以更準(zhǔn)確的反映土壤碳庫的變化，并且大團聚體中GRSP對團聚體穩(wěn)定性作用更為明顯。肖玖軍等[35]采用盆栽試驗研究接種AMF摩西管柄囊霉(Funneliformismosseae)和根內(nèi)根生囊霉(Rhizophagusintraradices)對桑樹土壤周圍GRSP以及土壤團聚體和其穩(wěn)定性的影響研究發(fā)現(xiàn)，接種根內(nèi)根生囊霉顯著增加土壤大團聚體(>0.25 mm)的比例，使團聚體破壞率(Percentage of aggregate destruction，PAD)顯著降低，并提高了團聚體的平均質(zhì)量直徑(Mean weight diameter，MWD)和平均幾何直徑(Geometric mean diameter，GMD)。T-GRSP和EE-GRSP對團聚體組成表現(xiàn)均為正向顯著影響，并且對團聚體形成中起著主要作用的是EE-GRSP，而T-GRSP則是團聚體穩(wěn)定性的主要影響因素。鐘思遠等[36]對南亞熱帶森林中土壤團聚體組成和GRSP的含量進行分析表明，南亞熱帶森林中土壤大團聚體(WSA>0.25 mm)含量以及GRSP含量均隨著演替的進行而增加。相關(guān)性分析表明，在南亞熱帶森林，AMF生物量與其T-GRSP含量和EE-GRSP占比有顯著相關(guān)性；T-GRSP含量、EE-GRSP占比與大團聚體含量具有顯著相關(guān)性，體現(xiàn)了GRSP對土壤團聚體的重要作用。彭思利等[37]通過將不同AMF接種到中性紫色土中，定量的分析和比較了接種AMF后根際、菌根際和菌絲際土壤的結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果表明，在接種3種不同的AMF后，EE-GRSP與紫色土中WSA>0.25 mm、MWD和GMD呈顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.777，體現(xiàn)了EE-GRSP在團聚體形成中的貢獻。

然而，土壤中的細菌也會分泌一些熱穩(wěn)定的蛋白質(zhì)[38]，它們和土壤中其他有機質(zhì)以及礦物吸附劑(黏土礦物)也相互作用，也可能對維持土壤團聚體的穩(wěn)定性和生態(tài)系統(tǒng)的功能起著一定的作用。因為GRSP不是性質(zhì)均一的蛋白，包含AMF分泌的球囊霉素以及其他蛋白(比如細菌和植物根系分泌的蛋白)，所以這些非球囊霉素的蛋白有可能為土壤細菌所產(chǎn)生，也可能對土壤團聚體的形成和維持土壤團聚體的穩(wěn)定性起到重要的作用，但目前沒有這方面的研究來證實這項猜測。因此，可以對GRSP中非AMF的蛋白對土壤團聚體的作用進行探究，從而進一步證實AMF分泌的球囊霉素對土壤團聚體的作用，或者提出新的假說用來完善已有的結(jié)論。

4.2 對土壤有機碳庫的貢獻

土壤有機質(zhì)是一種分布在土壤中自然來源(非其它生物的組成部分)的有機物質(zhì)，是土壤中生物吸收養(yǎng)分的重要來源[39]。土壤有機碳作為土壤有機質(zhì)的重要組成部分，來源較為廣泛，包括植物來源和土壤食物網(wǎng)來源，包括土壤動物、真菌、原生生物和原核微生物[40]。菌根共生體即存在植物部分又存在真菌部分，其對土壤有機碳的貢獻不可忽視。在菌根共生體中，由于菌根真菌無法進行光合作用，需要從宿主植物獲取碳水化合物來滿足自身生長發(fā)育的需要。在這個過程中，菌根真菌不僅把宿主植物的碳源進行了固定，并且將碳源轉(zhuǎn)移到土壤中。雖然不同的菌根真菌從宿主植物獲得碳源量差異較大，從4%～26%[41-42]，但菌根真菌將碳源以生物量和分泌物的形式固定在了土壤生態(tài)系統(tǒng)中并起到了重要的碳匯功能[17]。菌根真菌的碳匯一般包括兩個部分：菌根真菌的生物量和菌根真菌在土壤中的分泌物。根據(jù)植物類群以及對菌根的形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)特征，將菌根真菌分為外生菌根、叢枝菌根等七類[43]。目前全世界發(fā)現(xiàn)了有7 750多種外生菌根真菌和200多種叢枝菌根真菌(AMF)[44]，并且對叢枝菌根真菌進行較多的研究。因此，下文將較多的以AMF為例來說明菌根真菌對土壤有機碳庫的貢獻。菌根真菌的生物量一般由孢子、子實體、菌絲體、叢枝、泡囊和菌根組成。在AM共生體中，AMF會在共生體內(nèi)產(chǎn)生內(nèi)生菌絲，在共生體外產(chǎn)生外生菌絲[45]。目前對AMF生物量的測算一般限于AM共生體外的外生菌絲的這些結(jié)構(gòu)，而對于AM共生體內(nèi)的內(nèi)生菌絲、叢枝和泡囊和在土壤中散落的孢子這部分生物量缺乏測算手段和研究。菌根真菌的生物量在不同的生態(tài)系統(tǒng)中差異較大，但其對土壤有機碳的貢獻不可忽視。

AMF的分泌物對碳匯具有重要的貢獻，其中GRSP對土壤有機碳庫的貢獻不可忽視[23]。LoveLock等[46]對哥斯達黎加熱帶雨林的0～10 cm土壤中的GRSP含量進行估算，結(jié)果表明表層土壤中GRSP平均含量為3.94 mg·cm-3(1.45 Mg(C)·hm-2),占土壤總碳量的3.2%，總氮含量的5%。權(quán)常欣等[47]對廣東省164個代表性森林樣地土壤中GRSP的含量進行分析發(fā)現(xiàn)，森林0～10 cm土層中T-GRSP的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.26 g·kg-1，EE-GRSP質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.11 g·kg-1，GRSP與土壤有機碳含量、陽離子交換量呈顯著的正相關(guān)關(guān)系，并且GRSP對廣東省森林土壤的有機碳的絕對貢獻率為2.3%，這與LoveLock計算的結(jié)果相似。Wright等[9]的研究表明，土壤有機碳的含量與GRSP的含量有明顯的正相關(guān)。唐宏亮等[48]對4種土地利用方式(農(nóng)田、人工草地、果園、撂荒地)中GRSP在不同土層中分布的研究發(fā)現(xiàn)，在河北省中部潮土中T-GRSP的含量為1.41～3.18 mg·g-1，占土壤有機碳的6.98%～31.34%，除了撂荒地外GRSP的含量隨著土壤深度的增加表現(xiàn)出降低的趨勢，并且土壤中GRSP的含量與土壤有機碳的含量呈負(fù)相關(guān)。這個結(jié)果表明了GRSP為土壤中的重要碳庫，但GRSP與土壤有機碳的關(guān)系與Wright等[9]的結(jié)論相悖，可能是因為唐宏亮研究的4種利用方式的土壤都為同一土壤類型，不能代表GRSP在土壤中的普遍含量，而Wright等[9]的研究涉及了12種不同類型的土壤具有較廣泛的代表性。闕弘等[49]也做了類似的研究，通過對5種不同利用方式土壤中不同土層的GRSP含量的分析發(fā)現(xiàn)，土壤中T-GRSP的含量為1.96～3.12 mg·g-1，占土壤有機碳的12.5%～29.0%，并且T-GRSP的含量與土壤有機碳含量呈極顯著正相關(guān)。王誠煜等[50]對內(nèi)蒙古中北部的半干旱區(qū)土壤中的GRSP的分布進行研究發(fā)現(xiàn)，研究區(qū)域的T-GRSP的平均含量為1.44 mg·g-1，占有機碳平均值的12.86%，并且GRSP與有機碳呈顯著正相關(guān)。賀學(xué)禮等[51]對內(nèi)蒙古河北兩省的農(nóng)牧交錯帶沙棘集中分布區(qū)的3塊典型樣地0～50 cm土層中GRSP的空間分布以及與土壤因子的關(guān)系進行分析發(fā)現(xiàn)，3塊樣地T-GRSP占有機碳的比例分別為27.9%，15.0%和21.5%。綜上所述，GRSP作為土壤有機碳庫重要的組成部分并且在中不同生態(tài)系統(tǒng)土壤中含量存在差異，其含量與土壤類型、土地利用方式、植被類型以及AMF的長勢等因素密切相關(guān)。研究表明，GRSP在土壤中的周轉(zhuǎn)時間較長，可達6～42年[23],使得GRSP作為土壤中有機碳的重要來源的同時又保持了土壤有機碳庫的穩(wěn)定性。

4.3 對植物抗逆性的調(diào)控作用

干旱、鹽分脅迫和極端溫度等非生物脅迫導(dǎo)致了土壤退化，并對農(nóng)業(yè)造成嚴(yán)重威脅，非生物脅迫已經(jīng)成為全球作物產(chǎn)量損失的主要原因[52]。土壤中的一些有益微生物，特別是細菌和真菌，可以克服不利影響并改善不良環(huán)境脅迫下的植物的機能[53]。其中，AMF可以通過增強對礦質(zhì)鹽分的吸收和增加對生物和非生物脅迫的耐受性，來改善植物的生長和生理狀況[54-55]。從機制上來說，在AM共生體中，植物對P、Zn等礦質(zhì)營養(yǎng)的需求量較大，對N的需求量較少，這導(dǎo)致更多的有機C從植物體運移到了AMF中[56-58]，進而促進菌絲的發(fā)育和產(chǎn)生更多的GRSP。因環(huán)境脅迫產(chǎn)生的更多GRSP將會幫助土壤生態(tài)系統(tǒng)增強對不良環(huán)境的抵抗力。目前已有研究證明，植物對脅迫的響應(yīng)會伴隨著土壤中GRSP水平的增加而增強，這可能是因為增加了AMF豐度[59]。賀學(xué)禮等[60]研究在水分脅迫條件下，接種AMF提高了民勤絹蒿菌根侵染率和生物量，增加了植株中的全P含量。葉佳舒等[61]在研究AMF在干旱脅迫下對紫花苜蓿生長和土壤水穩(wěn)性團聚體影響時發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下AMF通過改善植物對礦質(zhì)營養(yǎng)(比如磷)的吸收，通過調(diào)節(jié)植物體內(nèi)滲透物質(zhì)(如脯氨酸的增多)等機制來增強植物的抗旱性，這與賀學(xué)禮等[60]、Clark和Zeto[54]的結(jié)論基本一致，說明了在植物受到不良的非生物脅迫時，AMF可以通過AM共生體中植物根系對土壤水分和礦質(zhì)營養(yǎng)的吸收，間接改善植物體內(nèi)物質(zhì)代謝增加可以抵御不良環(huán)境的物質(zhì)(如可溶性糖，氨基酸，可溶性蛋白質(zhì)等)以及產(chǎn)生GRSP來提高土壤抵抗力穩(wěn)定性。

4.4 對土壤重金屬污染修復(fù)的作用

隨著工業(yè)的快速發(fā)展，我國面臨著嚴(yán)重的環(huán)境污染問題，包括空氣污染、水污染和土壤污染。土壤污染近年來被逐漸的重視起來，其中，土壤重金屬污染因直接影響人類健康，成為日益嚴(yán)峻的環(huán)境問題，已經(jīng)成為學(xué)者關(guān)注的重點[62]。重金屬主要指汞、鉻、鉛、鎘、銅、鋅、砷和非金屬氟[63]。傳統(tǒng)的修復(fù)方法一般包括物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)和工程修復(fù)。但傳統(tǒng)的修復(fù)方法存在成本高、破壞土體和引入修復(fù)劑，而造成二次污染等一系列問題；生物修復(fù)作為一種比較溫和的修復(fù)土壤重金屬的方式，逐漸被人們研究和重視。生物修復(fù)包括植物修復(fù)和微生物修復(fù)，其中，植物修復(fù)研究雖然可以利用特定植物的超富集吸附重金屬，但這些特定植物一般生長緩慢、生物量低，從而導(dǎo)致修復(fù)時間長，修復(fù)緩慢[64]；微生物修復(fù)也存在上述的問題。植物與微生物聯(lián)合修復(fù)可能會提高修復(fù)效率，并且微生物的分泌物可以發(fā)揮改變重金屬離子價態(tài)和固定重金屬的作用，以達到保護植物和修復(fù)土壤的目標(biāo)。AM作為一種廣泛分布在植物-微生物中的共生體，具有調(diào)節(jié)植株對重金屬吸附和轉(zhuǎn)運的重要作用[65]，進而降低重金屬在土壤的含量，以達到土壤修復(fù)的目的。例如，AMF細胞壁的組成中含有游離的氨基、羧基和羥基等，是AM共生體中Cu2+的結(jié)合位點[66]。蛋白質(zhì)可以與Cu2+等金屬結(jié)合，作為細胞壁外結(jié)合金屬元素的主要成分[67]。因此，GRSP作為一種在土壤中提取的AMF相關(guān)蛋白，將在修復(fù)重金屬污染的土壤中起到重要作用。

研究表明，GRSP可以固定不同重金屬，降低它們在生態(tài)系統(tǒng)中對土壤生物和植物的毒害作用以及潛在毒性[40]。González-Chávez等[68]研究英國德文康索爾礦山受金屬污染土壤中GRSP時發(fā)現(xiàn)，在提取的T-GRSP、IRSP、EE-IRSP中，均檢測到了重金屬離子，并且每克GRSP中的重金屬的含量分別為1.6～4.3 mg Cu，0.02～0.08 mg Cd以及0.62～1.12 mg Pb。Cornejo等[69]通過對受冶銅廠影響的地中海生態(tài)系統(tǒng)中土壤的GRSP與Cu的關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)，在植物和根際區(qū)域中，GRSP的含量為6.6～36.8 mg·g-1，Cu的總量為62～831 mg·kg-1，GRSP結(jié)合銅的范圍為3.76～89.0 mg·g-1，占土壤總銅量的1.44%～27.5%。上述研究表明，GRSP與土壤中的重金屬離子發(fā)生螯合作用，可以對土壤中潛在的重金屬元素進行固定，為植物-微生物修復(fù)土壤技術(shù)提供了思路。

5 存在問題和挑戰(zhàn)

早期對球囊霉素研究認(rèn)為用Wright等[9]經(jīng)典方法從土壤中浸提的產(chǎn)物在經(jīng)過考馬斯亮藍法和單克隆抗體酶聯(lián)免疫法兩重測定后的物質(zhì)應(yīng)該是球囊霉素，但用Wright經(jīng)典方法從土壤中提取出的物質(zhì)中仍有非AMF來源的物質(zhì)(如腐殖酸等)與上述的兩種測定方法均可發(fā)生反應(yīng)，從而干擾對球囊霉素的測定。因此，考馬斯亮藍法和單克隆抗體酶聯(lián)免疫法不是測定球囊霉素的專一性方法，而早期的研究者所進行的研究應(yīng)該為球囊霉素和土壤中的其他有機物所共同表現(xiàn)出來的功能，目前仍然沒有特定的方法在不受其他物質(zhì)干擾下來對球囊霉素進行定量分析，這就引起了現(xiàn)在對球囊霉素命名混亂的現(xiàn)象。最近有研究認(rèn)為，將球囊霉素改名為GRSP的描述也不準(zhǔn)確，提議將這種用Wright經(jīng)典法所提取出來的物質(zhì)應(yīng)該命名為檸檬酸鹽提取土壤蛋白[40]，但提取球囊霉素的過程中提取劑并非檸檬酸鈉一種，而且檸檬酸鈉也并不是提取率最高的試劑，這種命名方法并不恰當(dāng)。在目前開展的研究中，人們假定了GRSP與AMF之間的關(guān)系，認(rèn)為GRSP的產(chǎn)量與AMF的豐度相關(guān)，將檢測到的GRSP濃度歸因于AMF的菌絲長度或AMF孢子密度，但實際上有大量試驗表明，GRSP濃度與AMF豐度完全不相關(guān)[70-71]。這可能是GRSP中的非AMF來源的物質(zhì)所造成的影響，因為GRSP中AMF產(chǎn)物的比例與非AMF產(chǎn)物的比例并不清楚，二者對GRSP的貢獻也是未知，所以并不能說明GRSP濃度與AMF的豐度之間沒有顯著的相關(guān)關(guān)系[40]。已經(jīng)報道的GRSP在生態(tài)系統(tǒng)中的功能包括對土壤團聚作用、植物抗逆性和土壤污染修復(fù)等，其發(fā)揮的作用是否來源于GRSP中的非AMF來源的蛋白，目前還未證實。前文中提到，植物根系中會產(chǎn)生蛋白，并且土壤中一些細菌能分泌熱穩(wěn)定蛋白，那么GRSP在維持土壤團聚體和碳庫穩(wěn)定性中的作用是否與GRSP中非AMF來源的成份相關(guān)，目前并不確定。但Wright經(jīng)典法的提取條件很為嚴(yán)苛(高溫高壓下的連續(xù)提取)，不耐熱的蛋白會被破壞，因此，GRSP中非AMF的成分可能含量較少，所以這些細菌所分泌的熱穩(wěn)定蛋白可能是GRSP中非AMF來源的貢獻者，但作用可能不顯著。在對GRSP進行研究時，不應(yīng)將其視為性質(zhì)單一物質(zhì)，而應(yīng)該作為一種混合物。GRSP作為一種用提取方法命名的物質(zhì)，本身就存在一些不確定性。球囊霉素的具體產(chǎn)生過程是未知的，球囊霉素是AMF主動分泌進入土壤中還是AMF死亡后菌絲裂解釋放到土壤中，以及AMF是否會通過胞外酶的作用將球囊霉素在體外進一步轉(zhuǎn)化這些過程尚不清楚[40]，但AMF自身生長以及產(chǎn)生分泌物所需營養(yǎng)物質(zhì)(C、N等)來源于其宿主植物是確定的。綜上所述，關(guān)于球囊霉素與GRSP的研究存在許多不明確的地方，但是正因為存在這些問題，才值得我們對以上的各個方向進行深入的研究和探討。

6 展望

球囊霉素的提取技術(shù)仍然是限制發(fā)展的最大瓶頸，未來可以尋找更加合適的專一性測定方法。隨著計算機技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)代儀器以及分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展更新速度非常快，越來越多的高分辨率精密儀器和分子生物學(xué)技術(shù)被研制出來,精密儀器比如傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀(FI-ICR-MS)[72]、核磁共振(NMR)以及掃描電子顯微鏡(SEM)等[73],分子生物學(xué)技術(shù)比如單分子實時DNA測序技術(shù)，穩(wěn)定性同位素測序以及納米二次離子質(zhì)譜技術(shù)等[74]，可以通過這些技術(shù)手段來對AMF更加精準(zhǔn)的分類，對球囊霉素的微觀結(jié)構(gòu)進行觀測以及推測蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。如果可以對AMF進行離體純培養(yǎng)，排除土壤中其他物質(zhì)對球囊霉素的干擾，將會極大的降低對球囊霉素的研究難度，為球囊霉素在生態(tài)系統(tǒng)中的作用提供直接性的證據(jù)，從而為進一步促進將球囊霉素作為土壤有機質(zhì)中的常規(guī)分析指標(biāo)提供科學(xué)依據(jù)。