鄒獅，嚴(yán)君，陳旭，陸欣春，高瑞敏，2

(1.中國科學(xué)院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，黑龍江 哈爾濱 150081；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

0 引 言

土壤微生物在土壤生態(tài)系統(tǒng)中承擔(dān)著重要角色，參與養(yǎng)分循環(huán)、轉(zhuǎn)化和有機(jī)質(zhì)分解等過程，對生態(tài)系統(tǒng)功能起著至關(guān)重要的作用[1-2]。土壤微生物群落功能多樣性可以反映其對環(huán)境的響應(yīng)和適應(yīng)，并且能夠反映出土壤中微生物群落生態(tài)系統(tǒng)功能的演化和土壤肥力的變化[3]。因此，研究土壤微生物的群落功能多樣性對評估不同生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性非常必要[4]。

土壤微生物功能多樣性是土壤中整體微生物多樣性的一個方面，主要通過土壤微生物對碳源利用的情況對其進(jìn)行衡量和評價[5]，Biolog微平板法是目前評估土壤微生物功能多樣性的一種簡單有效的方法[6]。雖然國內(nèi)外在利用Biolog方法研究土壤微生物對碳代謝上存在分歧，但它已被證明是區(qū)分不同環(huán)境土壤微生物功能多樣性和群落干擾的有效方法[7-8]。土壤微生物群落功能多樣性，受環(huán)境(非生物和生物)因素和人為管理措施的影響[9-10]。文東新等[11]對喬木、灌木和草本植被條件下土壤微生物群落功能多樣性的研究表明土壤有機(jī)碳是影響土壤微生物代謝活性及功能多樣性的重要因素[12]。Bertuni等[13]通過對人為擾動程度不同的南洋杉森林土壤微生物功能多樣性的研究表明，與擾動和重新造林的南洋杉森林土壤微生物群落相比，原生南洋杉森林對土壤微生物群落的組成和功能影響更大。苜蓿和玉米種植條件下土壤微生物對糖類和氨基酸類碳源的利用能力顯著不同[14]。此外，植被的多樣性[15]、凋落物的數(shù)量[16]及種植密度[17]等因素亦會對土壤微生物的功能多樣性產(chǎn)生影響?，F(xiàn)有的研究大多是0～20 cm土層土壤微生物群落功能多樣性的變化，而亞表層土壤中仍有大量的土壤微生物存在，可能含有一些特殊的針對其環(huán)境的微生物，從根本上區(qū)別于表層土壤微生物群落[18]，推測其土壤微生物功能多樣性亦與表層存在差異。因此本研究選用黑土區(qū)母質(zhì)發(fā)育相同的土壤上長期無植被和有植被的(自然恢復(fù)、農(nóng)作物及人工林)處理，通過對表層0～15 cm和亞表層15～35 cm土層中土壤微生物對碳源的利用情況，探索不同植被類型對不同土層微生物群落功能多樣性的影響，揭示土壤微生物群落功能多樣性與植被類型、土層深度之間的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 研究地區(qū)概況

研究區(qū)設(shè)置在中國科學(xué)院海倫農(nóng)業(yè)生態(tài)試驗站(47°26′N，126°38′E)，該區(qū)位于黑土區(qū)中部的海倫市，平均海拔234 m，年均氣溫1.5 ℃，無霜期120～130 d，年均有效積溫2 400 ℃，土壤為第四紀(jì)黃土狀亞黏土發(fā)育而成的中厚黑土。

1.2 試驗設(shè)計及樣品采集

試驗區(qū)大小為500 m×150 m，土地平坦，土壤基礎(chǔ)肥力相對均勻。1985年在試驗區(qū)設(shè)立4種不同植被類型處理，分別為：(1)自然恢復(fù)為草原化草甸植被(GL)，植被類型豐富，有羊草(Leymuschinensis(Trin.)Tzvel.)、苔草(Carexspp.)、木賊(EquisetumhyemaleL.)和狗尾草(Setariaviridis(L.)Beauv.)等植被分布，面積104 m×16 m，無任何肥料投入，無耕作；(2)農(nóng)作物(AL)：當(dāng)季作物為大豆，一年一熟小麥-玉米-大豆輪作種植，不施用肥料采用傳統(tǒng)耕作方式，在作物生長季耙松4～6次，秋季作物收割后，移除作物地上部分，面積120 m×5.6 m；(3)人工落葉松林(FL)：林分密度為2 100株·hm-2，株高約4.5 m，面積485 m×57 m；(4)無植被(BL)：每年定期將地上部分鏟除，始終保持無植被，面積30 m×16 m。由于每個樣區(qū)的面積夠大，所以將每個處理平均劃分成三個小區(qū)作為重復(fù)。

2020年7月17日按5點法取樣，在每個處理的樣區(qū)內(nèi)隨機(jī)選取5個點分別采集0～15 cm和15～35 cm土壤樣品，均勻混合后，收集在無菌自封袋中并帶回實驗室，去除肉眼可見的動植物殘體和礫石，用2 mm篩子過篩后冷藏在4 ℃冰箱內(nèi)備用，7 d內(nèi)完成所指標(biāo)的測定。

1.3 測定項目及方法

采用Biolog-Eco板，每個板內(nèi)含96個小孔，設(shè)3次重復(fù)，每重復(fù)含1個空白對照和31種碳源。參照Qian[19]方法培養(yǎng)，具體步驟如下：稱取相當(dāng)于5 g烘干土的鮮土加入到裝有45 mL滅菌的生理鹽水(0.85%)的100 mL三角瓶中，在搖床上振蕩約30 min，轉(zhuǎn)速180 r·min-1，靜置片刻。吸取一定量的上清液，將0.85%的滅菌生理鹽水稀釋至10-3倍，用八通道移液器吸取150 μL稀釋后的上清液加入Biolog-Eco微孔板中，放在恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃恒溫避光培養(yǎng)至168 h。每隔24 h用Biolog MicrostationTM酶標(biāo)儀測定590 nm和750 nm處的吸光值。土壤微生物功能多樣性各項指數(shù)參照Classen等[20]方法計算。

AWCD=∑(Ci-R)/n

式中：Ci為第i孔在590 nm和750 nm下的吸光值之差；R為對照孔的吸光值；n為Biolog-Eco微平板的碳源種類數(shù)(n=31)。利用各樣品培養(yǎng)96 h的數(shù)據(jù)，計算其微生物功能多樣性指數(shù)：

Shannon物種豐富度指數(shù)(H)：H=-∑Pi/lnPi

Richness指數(shù)(S)：S=碳源代謝孔的總數(shù)目(微孔的光密度值≥0.25，則認(rèn)為該孔碳源被利用，即為碳源代謝孔)。

式中：Pi為第i孔的相對吸光度值與整個平板相對吸光度值總和的比率；ni為第i孔的相對吸光度值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，對不同植被類型不同土層土壤微生物群落平均顏色變化率、功能多樣性指數(shù)及碳源利用特征進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan多重比較法在0.05水平上進(jìn)行顯著性差異檢驗。使用CANOCO 5.0軟件對培養(yǎng)96 h 的土壤微生物進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植被類型對不同土層土壤微生物群落平均顏色變化率(AWCD)的影響

不同植被類型下不同土層土壤微生物群落的AWCD有差異(圖1)，隨著培養(yǎng)時間的延長均呈逐漸增長趨勢。不同處理表層0～15 cm土壤微生物在培養(yǎng)的第120 h時趨于穩(wěn)定，而15～35 cm土層在第168 h趨于穩(wěn)定，且表層0～15 cm的AWCD值均顯著高于對應(yīng)處理15～35 cm土層。在整個培養(yǎng)時間內(nèi)兩個土層的AWCD值變化均表現(xiàn)為GL>AL>FL>BL。在培養(yǎng)的第96 h時，GL處理在0～15 cm土層的AWCD值比AL、FL和BL處理分別增加了4.2%、8.3%和131%，在15～35 cm土層中比AL、FL和BL分別增加了8.2%、15.2%和216%。對于同一處理，不同土層的AWCD值差異也很明顯。96 h時，GL、AL、FL和BL處理在0～15 cm土層的AWCD值比對應(yīng)處理15～35 cm土層分別增加了15.5%、19.9%、22.9%和57.7%。

2.2 不同植被類型對不同土層土壤微生物功能多樣性的影響

利用培養(yǎng)第96小時的AWCD值(圖1)，計算土壤微生物的Shannon指數(shù)、Simpson′s指數(shù)、McIntosh指數(shù)和Richness指數(shù)，以反映土壤微生物碳源代謝功能多樣性差異。不同植被類型對不同土層微生物群落的Shannon指數(shù)、Simpson′s指數(shù)、McIntosh指數(shù)和Richness指數(shù)的影響不同(表1)。GL處理在0～15 cm和15～35 cm土層4個多樣性指數(shù)均最高，且0～15 cm土層土壤微生物群落的4個指數(shù)均高于15～35 cm土層，其中McIntosh指數(shù)和Richness指數(shù)之間差異顯著(P<0.05)，而Shannon指數(shù)和Simpson′s指數(shù)之間差異不顯著。BL處理在0～15 cm和15～35 cm土層4個指數(shù)均最低，且BL處理0～15 cm的4個指數(shù)顯著高于15～35 cm(P<0.05)。15～35 cm土層中AL處理的4個指數(shù)稍高于FL處理對應(yīng)的指數(shù)，但無顯著差異。

注：BL：無植被；AL：農(nóng)作物；GL：自然恢復(fù)；FL：人工林。下同。Note:BL means no vegetation cover;AL means crops;GL means natural restoration of grass;FL means forests.The same is as below.圖1 不同植被類型在0～15 cm(A)和15～35 cm(B)土層中土壤微生物群落平均顏色變化率(AWCD)Fig.1 Average Well Color Development (AWCD)in soil layers of 0～15 cm (A)and 15～35 cm (B)under different vegetation types

表1 不同植被類型在0～15 cm和15～35 cm土層中土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)的變化(96 h)Table 1 Variation of functional diversity index of soil microbial community in 0～15 cm and 15～35 cm soil layers of different vegetation types(96 h)

2.3 不同植被類型對不同土層土壤微生物群落對碳源的利用特征

不同植被類型土壤微生物群落對碳源總的利用能力表現(xiàn)為GL>AL>FL>BL，且對六種碳源的利用亦存在差異(圖2)。在表層0～15 cm土層BL處理土壤微生物對氨基酸類碳源的利用高于對羧酸類、糖類及其它碳源，而AL和FL處理對羧酸類碳源利用最高，GL處理對氨基酸類利用最高。在15～35 cm土層不同植被類型土壤微生物對六類碳源總的利用能力整體低于0～15 cm土層對應(yīng)的處理，且對碳源的利用種類與表層存在差異。BL處理對酚酸類利用最高，且顯著高于該處理0～15 cm對酚酸類碳源的利用。AL和FL處理對氨基酸類利用最高，GL處理對羧酸類利用的最高。不同植被類型在不同土層碳源的利用能力存在差異，同時在同一土層中不同植被類型土壤微生物對六種碳源的利用也存在差異。

圖2 不同植被類型下不同土層土壤微生物對六類碳源的利用情況Fig.2 Utilization of six kinds of carbon sources by soil microorganisms in different soil layers of different vegetation types

2.4 不同植被類型對不同土層土壤微生物對碳源的主成分對比分析

利用培養(yǎng)96 h標(biāo)準(zhǔn)化后的OD值，對BL、GL、AL和FL處理下土壤微生物對碳源的利用進(jìn)行主成分分析，提取2個主成分，累計貢獻(xiàn)率達(dá)到72.30%，其中第一主成分(PCA1)方差貢獻(xiàn)率為59.22%，第二主成分(PCA2)方差貢獻(xiàn)率為13.08%(圖3)。不同植被類型土壤微生物對碳源的利用在PC軸上出現(xiàn)了明顯的分布差異。表層0～15 cm中GL、AL和FL處理分布距離較近，土壤微生物利用的碳源相似，而BL處理與之顯著不同。在15～35 cm土層不同植被類型聚成三組，GL和AL處理聚在一起，BL、FL單獨聚類，表明GL和AL的土壤微生物利用的碳源相似，且與BL、FL顯著不同。此外BL和FL處理0～15 cm和15～35 cm土層分布在不同區(qū)域，表明BL和FL處理不同土層土壤微生物群落代謝顯著不同。

3 討論

土壤微生物群落的功能多樣性是衡量土壤微生物群落特征的一個重要指標(biāo)，它反映了群落的動態(tài)變化，對評估土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性具有重要的意義[21]。本研究中不同植被類型在0～15 cm和15～35 cm土層土壤微生物的AWCD值在整個培養(yǎng)期間均表現(xiàn)為自然恢復(fù)(GL)>農(nóng)作物(AL)>人工林(FL)>無植被覆蓋(BL)(圖1)。自然恢復(fù)處理的AWCD值最高，這是由于自然恢復(fù)處理植被種類豐富，有羊草(Leymuschinensis(Trin.)Tzvel.)、苔草(Carexspp.)、木賊(EquisetumhyemaleL.)和狗尾草(Setariaviridis(L.)Beauv.)等植被分布，其凋落物和根系分泌物的數(shù)量和種類較豐富，所以土壤微生物對碳源的利用能力相對于其它處理高[22]。人工林處理以人工種植落葉松為主，其AWCD值稍低于農(nóng)作物(圖1)，原因可能是相對于玉米和大豆等農(nóng)作物的的凋落物，針葉類樹種的凋落物中含有大量難分解的木質(zhì)素和單寧酸，降低了土壤微生物對碳源的利用能力[23]。然而劉倩[24]在通過對內(nèi)蒙古地區(qū)天然草地、水田、林地、開墾4年農(nóng)田和開墾30年農(nóng)田土壤微生物多樣性研究，結(jié)果表明土壤微生物的AWCD值的變化表現(xiàn)為：4年農(nóng)田>天然草地>林地>30年農(nóng)田，與本研究的結(jié)果不同，這可能與本研究是所處的氣候條件、土壤類型以及植被種植的年限不同造成的[25]。無植被覆蓋處理土壤微生物代謝活性最低，主要是由于長期無植被種植所以幾乎沒有碳源的輸入[26-27]?？梢娭脖粚ν寥牢⑸锾荚创x的影響與植被豐富度、根系分泌物及凋落物等來源的碳源輸入都有直接的關(guān)系。此外土壤深度和土壤有機(jī)質(zhì)含量也是影響土壤微生物代謝能力的重要因素[28]。郝翔翔等[29]的研究表明，草地、農(nóng)田、裸地和林地的土壤有機(jī)碳含量隨著土壤深度的增加呈下降的變化趨勢，而土壤有機(jī)碳含量與土壤微生物群落功能多樣性具有正相關(guān)關(guān)系，即土壤微生物功能多樣性隨著土壤深度的增加呈下降的變化趨勢[30]。本研究中不同植被類型下0～15 cm土層土壤微生物的AWCD值均高于15～35 cm土層，推測其產(chǎn)生原因是由于植被的存在使得土壤表層含有大量的凋落物促進(jìn)了土壤的有機(jī)碳的形成；種植植被可以減少土壤團(tuán)聚體的破碎，在一定程度上減少了土壤養(yǎng)分的分解[31]，促進(jìn)了土壤有機(jī)碳的積累和增加，而土壤有機(jī)碳含量高土壤微生物及其功能多樣性就越高[32]。此外表層土壤的透氣性一般較深層土壤更好，更有利于土壤微生物的繁殖和存活。陳超凡[31]等通過對4種闊葉人工林不同土層深度土壤微生物功能多樣性的研究表明，隨著土層深度的增加土壤微生物可利用的養(yǎng)分降低、根系分泌物量減少，導(dǎo)致微生物可利用的數(shù)量和種類下降，從而引起各林分土壤微生物對碳源的利用能力下降。健康良好的土壤環(huán)境可以促進(jìn)土壤微生物的繁殖與生長，有利于保持和提高土壤微生物的活性和功能多樣性，同時土壤微生物又會促進(jìn)土壤養(yǎng)分積累、轉(zhuǎn)化和土壤結(jié)構(gòu)的改善，進(jìn)而有利于土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定[11]。

注：空心代表0～15 cm土層，實心代表15～35 cm土層。Note:Hollow means 0～15 cm soil layer,solid means 15～35 cm soil layer.圖3 不同植被類型下不同土層土壤微生物對31種碳源代謝主成分圖Fig.3 Principal component analysis of 31 carbon sources metabolism by soil microorganisms in different soil layers of different vegetation types

不同植被類型下不同土層土壤微生物對碳源的利用有差異。本研究中自然恢復(fù)、農(nóng)作物、人工林及無植被覆蓋處理不同土層土壤微生物對碳源的利用存在偏好，農(nóng)作物處理0～15 cm土層對羧酸類利用最高，這與孟慶杰等[27]在黑土農(nóng)田上的研究結(jié)果相似。然而陸思旭等[33]研究表明，農(nóng)田黑土土壤微生物利用最高的碳源是糖類，此外種植柑橘的土壤微生物對于多聚物和羧酸類碳源的利用率最高[34]，產(chǎn)生差異的原因是由于植被、取樣時期及土壤類型等不同引起了土壤中的微生物群落組成發(fā)生變化，從而導(dǎo)致土壤微生物對碳源的利用能力不同[35]。在本研究中不同植被類型條件下0～15 cm土層土壤微生物總的碳源利用能力均顯著的高于對應(yīng)處理在15～35 cm土層的土壤微生物，BL處理0～15 cm主要利用的碳源是氨基酸類，而15～35 cm則是酚酸類利用的最高。有植被存在的條件下不同處理對氨基酸類和羧酸類碳源利用的較多，但其利用能力顯著高于無植被覆蓋處理。有研究表明水稻根際微生物對氨基酸的利用率較高，而非根際土壤對羧酸類、酚酸類和胺類的利用率較高[36]，可見植被的存在對土壤微生物群落功能多樣性的影響作用顯著，其內(nèi)在機(jī)理還需要做進(jìn)一步的深入研究。整體上有植被的自然恢復(fù)、農(nóng)作物和人工林處理的土壤微生物碳源代謝功能相似，這可能由于Biolog法培養(yǎng)的都是土壤中快速繁殖的優(yōu)勢菌群，而土壤中的優(yōu)勢菌門一般不會隨著植被和管理措施而發(fā)生顯著變化[37-38]。雖然Biolog法能夠通過碳源代謝能力反映土壤微生物群落的變化，但是仍然存在很多的不足，今后還需借助于高通量測序及磷脂脂肪酸PLFA等技術(shù)，結(jié)合合理的統(tǒng)計分析方法，從不同層面對土壤微生物功能多樣性展開研究[39]。

4 結(jié)論

采用Biolog-Eco微平板法研究了自然恢復(fù)(GL)、農(nóng)作物(AL)、人工林(FL)及無植被覆蓋(BL)處理下不同土層土壤微生物群落功能多樣性的變化，得到以下結(jié)論：

(1)不同處理在整個土層中AWCD值變化均表現(xiàn)為自然恢復(fù)>農(nóng)作物>人工林>無植被覆蓋，且表層0～15 cm的AWCD均顯著高于15～35 cm。

(2)Shannon指數(shù)、McIntosh指數(shù)、Simpson′s指數(shù)和Richness指數(shù)均表現(xiàn)為自然恢復(fù)、農(nóng)作物、人工林處理顯著高于無植被覆蓋處理，表層0～15 cm土壤微生物代謝活性和群落功能多樣性均高于15～35 cm。

(3)兩個土層中土壤微生物群落主要利用的碳源有氨基酸類、羧酸類、糖類和多聚物類。在0～15 cm土層BL處理土壤微生物對氨基酸類利用最高，而AL和FL處理對羧酸類碳源利用最高，自然恢復(fù)處理對氨基酸類利用最高；在15～35 cm土層無植被覆蓋處理對酚酸類利用最高，農(nóng)作物和人工林處理對氨基酸類利用最高，自然恢復(fù)處理對羧酸類利用的最高。

(4)主成分分析結(jié)果表明，自然恢復(fù)、農(nóng)作物和人工林處理在0～15 cm土層的土壤微生物的碳源代謝功能相似；自然恢復(fù)和農(nóng)作物處理在15～35 cm土層的土壤微生物的碳源利用方式相似，與無植被覆蓋、人工林處理均顯著不同。

總之不同植被類型下土壤微生物群落功能多樣性的差異是植被類型與土層深度共同作用的結(jié)果，其中以自然恢復(fù)處理對黑土土壤微生物群落功能多樣性影響最為顯著，更有利于黑土土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定。