張雪，邱麗娟，閻哲

(1.中國科學院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，吉林 長春 130102；2.中國科學院大學，北京 100049；3.中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所/國家農(nóng)作物基因資源與遺傳改良重大科學工程/農(nóng)業(yè)部種質資源利用重點實驗室，北京 100081)

0 引 言

氮是植物生長發(fā)育的必需元素。在自然界中，雖然大氣中富含氮氣(N2)，但土壤中的含氮量很有限。當土壤可利用氮素匱乏時，豆科植物可以與相匹配根瘤菌共生互作形成根瘤，并將氮氣轉化成植物可以吸收利用的氨。植物宿主為根瘤菌提供適宜的生存空間、必要養(yǎng)分和高效固氮環(huán)境，而根瘤菌通過自身固氮酶的作用，為宿主提供氮素[1-2]。目前，這種生物固氮方式已經(jīng)被許多國家應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，既提高了豆科作物品質和產(chǎn)量，又有效地減少了過量施用氮肥所導致的農(nóng)田生態(tài)環(huán)境破壞以及水體污染[3-6]。

在宿主植物缺乏氮素的情況下，豆科植物與根瘤菌形成共生體，通過共生固氮來獲取供植物生長發(fā)育的氮。但共生對于宿主植物也是個能量消耗的過程，宿主植物需要提供足夠的碳源來維持根瘤菌的生物活動，因此，過量結瘤同樣會對植物生長發(fā)育帶來不利影響。為此，豆科植物形成了結瘤自調控AON(Autoregulation of Nodulation)體系，用以維持最佳的結瘤數(shù)量，平衡個體生長發(fā)育的氮素需求和結瘤固氮能量消耗。本文對近年來AON分子機制相關研究結果進行了整理，重點對調控結瘤數(shù)量的關鍵基因以及AON中長距離運輸信號相關研究的進展進行總結，為后續(xù)的相關研究提供信息和參考。

1 根瘤形成過程及信號分子

豆科植物與根瘤菌的共生互作是分子信號交互的復雜過程。目前，對豆科植物與根瘤菌共生固氮的分子機制研究主要集中在百脈根(Lotusjaponicus)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)和大豆(GlycinemaxL.)等植物上[7-8]。豆科植物與根瘤菌共生過程大致可分為信號識別、根瘤菌侵染和根瘤發(fā)育三個階段。共生初始，宿主植物與相適根瘤菌通過分子信號交互識別，從而激活共生通路。隨后根毛形變，根瘤菌進入根毛，在根毛細胞內形成侵染線，根瘤菌通過侵染線進入根皮層。在根瘤菌侵染的同時根皮層細胞分化形成根瘤原基，根瘤菌通過侵染線定殖于根瘤原基中，根瘤菌特化形成類菌體，根瘤原基發(fā)育成為具有固氮功能的成熟根瘤[9]。

近20多年來，科學家通過分子生物學等手段，對結瘤固氮的分子機制有了比較深入的了解。在植物缺乏氮素的情況下，豆科植物根系會釋放出類黃酮等物質信號，該信號可以被根系附近的根瘤菌所識別，并激活根瘤菌釋放脂幾丁質寡糖類物質—結瘤因子(Nod factor，NF)[10]。豆科植物根表皮表達的結瘤因子受體激酶蛋白NFR1和NFR5(Nod factor receptor，NFR)感知結瘤因子信號，從而激活共生體信號通路(Common symbiotic signaling pathway)基因的表達[11-12]。根瘤菌接觸根表皮時，另一個受體激酶蛋白EPR3被誘導表達，通過識別根瘤菌的胞外多糖(EPS)進一步對匹配根瘤菌進行識別[13]。在根瘤菌激活宿主的共生信號通路中，NiCK4與NFR5結合互作，并在NFR1/NFR5信號調控下，從細胞膜轉移到細胞核，調控下游根瘤的形成與發(fā)育[14]。SYMRK受NFR1/NFR5信號調控，介導離子通道蛋白、核孔蛋白等[15]在根毛內產(chǎn)生鈣離子振蕩，從而促進侵染線的形成和根瘤菌的入侵[16]。鈣離子振蕩信號被鈣-鈣素依賴性蛋白激酶CCaMK所識別后，CCaMK結合并磷酸化CYCLOPS，進一步促進結瘤信號通道蛋白基因NSP1和NSP2的表達[17]。NSP1和NSP2蛋白互做形成復合體，進一步調控下游固氮結瘤關鍵基因如NIN的表達[18]。NIN是最早被發(fā)現(xiàn)參與結瘤調控的轉錄因子之一[19]，其調控一系列關鍵基因，如正向調控細胞分裂素受體蛋白CRE1[20]，同時限制EOND11的時空表達[21]，從而調控根瘤的發(fā)育。

2 豆科植物結瘤自調控(AON)通路中關鍵基因的功能

2.1 地上受體激酶在AON中的功能

豆科植物在共生固氮的過程中形成了一套精密的結瘤自我調節(jié)機制(AON)。通過AON信號通路，豆科植物可以針對環(huán)境有效氮素的多少做出相應調節(jié)，確保共生過程中結瘤固氮的充足，同時避免過多結瘤所導致的能量損耗。大豆的超結瘤突變體的嫁接實驗發(fā)現(xiàn)，雖然結瘤發(fā)生在地下的根部，但大豆結瘤數(shù)量受地上組織的調控[22]。通過對不同豆科植物的超結瘤突變體進行基因定位，證明地上調控結瘤數(shù)量的是一個編碼CLAVATA1(CLV1)受體激酶的基因。在非豆科植物擬南芥中，CLV1主要參與調控莖端分生組織的增殖與分化等重要的發(fā)育過程[23]，而在豆科植物中，CLV1受體激酶在葉片的韌皮部細胞特異性表達[24]，其突變體導致豆科植物根部形成超級結瘤的現(xiàn)象。目前已在不同豆科植物中鑒定出了編碼CLV1的同源基因，如百脈根的LjHAR1、豌豆的PsSYM29、苜蓿的MtSUNN、菜豆的PvNARK和大豆的GmNARK等基因[25-28]。Crook等[29]在sunn基因突變體植株中表達被標記的SUNN，結果顯示豆科植物CLV1受體激酶蛋白在細胞膜上表達。

地上組織除了CLV1參與AON通路之外，Oka-Kira等[30]分離出百脈根klavier(klv)突變體，該突變體導致超結瘤表型，同時對硝酸鹽耐受度顯著提高。研究顯示，KLV基因編碼一種受體激酶，可以形成同源復合物，或與CLV1受體激酶形成異源復合物，該復合物可能是AON根信號感知的必要條件[31]。

2.2 地下CLE短肽信號在AON中的功能研究

在擬南芥中，研究發(fā)現(xiàn)CLV1受體激酶蛋白可以和CLE短肽家族的CLV3直接結合，從而誘導下游的信號通路[32]。在百脈根中，研究人員對百脈根基因組序列進行分析，共鑒定到了39個CLE短肽基因，其中3個在根部表達的CLE短肽基因(LjCLE-RS1、LjCLE-RS2及LjCLE3)受根瘤菌侵染顯著調控；通過根轉過表達實驗證明，LjCLE-RS1和LjCLE-RS2可以顯著抑制結瘤，同時利用har1突變體證明LjCLE-RS1和LjCLE-RS2在HAR1上游行使功能[33]。在苜蓿中，研究人員共鑒定到25個CLE短肽基因，其中MtCLE12和MtCLE13受根瘤菌侵染誘導表達，MtCLE12和MtCLE13同樣抑制苜蓿的結瘤，并且部分依賴于SUNN基因的存在[34]。Reid等[35]通過對大豆基因組的分析，鑒定出了3個參與大豆結瘤抑制的CLE短肽基因，GmRIC1、GmRIC2和GmNIC1，其中GmRIC1、GmRIC2受根瘤菌侵染調控，而GmNIC1受硝酸鹽調控。三者的過表達都能抑制大豆根瘤的產(chǎn)生，其中GmRIC1和GmRIC2的過表達可以幾乎完全抑制結瘤的產(chǎn)生。

在豆科植物中鑒定出的與結瘤調控相關的CLE短肽，如百脈根LjCLE-RS1/2、蒺藜苜蓿MtCLE12/13及大豆GmRIC1/2在序列和功能上都具有高度的保守性。CLE短肽前體通常由信號肽、可變結構域和CLE結構域組成[36]。Reid等使用定點突變方法確定GmRIC1的CLE結構域Arg1，Ala3，Pro4，Gly6，Pro7，Asp8，His11和Asn12序列對結瘤抑制活性至關重要[37]。Hastwell等[38]基于序列分析，細化CLE結構域和相鄰殘基，將大豆CLE肽劃分為Ⅰ～Ⅶ類，結果顯示，第Ⅵ類完全由根瘤菌誘導的CLE肽及其同源基因組成，而氮素誘導的CLE肽及其同源基因主要集中在第Ⅶ類，這側面反映了高度保守的氨基酸殘基可能是CLE肽的活性中心。

Okamoto等[39]研究發(fā)現(xiàn)，百脈根CLE的成熟體具有13個氨基酸，同時Hyp7被阿拉伯糖基化。將羥基化、單阿拉伯糖基化和三阿拉伯糖基化的大豆GmRIC1a和GmRIC2a通過葉柄飼喂豌豆，結果顯示僅三阿拉伯糖基化的GmRIC1a和GmRIC1a可以種間抑制野生型豌豆結瘤[40]。Schnabel等[41]進一步發(fā)現(xiàn)編碼阿拉伯糖基轉移酶的基因RDN的突變會導致超結瘤現(xiàn)象，Kassaw等[42]通過嫁接和遺傳分析，發(fā)現(xiàn)RDN1參與AON通路并作用在SUNN上游，同時RND1在SUNN識別MtCLE12過程中起關鍵的作用。

Wang等[43]研究了大豆miR172c-GmNNC1-ENOD40模塊的調控作用。在沒有根瘤菌存在時，大豆轉錄抑制子NNC1(Nodule Number Control 1)抑制ENOD40基因表達。而根瘤菌侵染大豆根系時，被誘導表達的miR172c轉錄后調節(jié)GmNNC1表達，從而解除了GmNNC1對ENOD40的抑制。隨后，Wang等[44]對該研究進行了進一步的補充，發(fā)現(xiàn)GmNINa可以激活CLE-RIC1/2的基因轉錄，而NNC1與之作用相反，并且GmNINa和NNC1對CLE-RIC1/2基因元件的結合表現(xiàn)出競爭性，從而綜合調控AON中地下釋放的CLE信號。

2.3 根部超結瘤突變體(TML)在AON中的功能研究

Magori等[45]在百脈根中鑒定出一個超結瘤突變體toomuchlove(tml)，該突變體與har1突變體具有類似的結瘤表型。tmlhar1雙突變體[45-46]的結瘤表型與tml突變體表型一致，未出現(xiàn)任何結瘤相關的加性效應，說明TML與HAR1共同參與AON長距信號轉導的調控通路。tml突變體中過表達根信號肽CLE-RS1/RS2，未發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性的結瘤抑制[46]，因此證明TML應該在CLE-RS1/RS2的下游起作用。TML編碼一種Kelch Repeat-Containing F-box蛋白，該基因在根和根瘤組織表達，反向嫁接實驗證明tml超結瘤表型是由地下基因型決定的[46]，推測TML在HAR1下游作用，HAR1通過釋放長距離信號從而調控根部TML對結瘤的抑制。

2.4 AON中地上長距離信號的研究進展

在AON調控體系中，雖然CLV1受體激酶與TML的關鍵作用已經(jīng)被鑒定，但地上組織通過CLV1釋放何種信號調控TML的分子機制還不清楚。Delves等[22]發(fā)現(xiàn)，大豆嫩枝產(chǎn)生信號分子SDI(shoot-derived inhibitor)，經(jīng)過韌皮部運輸?shù)礁?，抑制結瘤反應。Lin等[47]通過利用超結瘤和野生型葉片提取物外源施加，證實大豆SDI是一種小分子化合物，其分子量小于1 000 Da，而且熱、蛋白酶和核酸酶均不影響SDI的活性。

研究發(fā)現(xiàn)，部分植物激素起著地上傳遞到地下的結瘤抑制信號的作用。在蒺藜苜蓿中，超結瘤sunn突變體較野生型會產(chǎn)生大量的生長素運送到根部[48]。Noorden等[49]利用生長素抑制劑、生長素運輸抑制劑以及生長素對幼苗進行處理，發(fā)現(xiàn)生長素可以調控結瘤的數(shù)量，因此推測生長素可能參與AON途徑，作為地上傳遞到地下的信號。Sasaki等[50]通過對CLE-RS1和CLE-RE2過表達植株以及har1突變體進行檢測，發(fā)現(xiàn)細胞分裂素的前體iPRP在CLE短肽過表達材料中含量顯著提高，而在har1突變體中顯著下降。通過在地上部分外源飼喂細胞分裂素，發(fā)現(xiàn)細胞分裂素可以通過地上組織運送到地下抑制根部結瘤。進一步實驗證明枝源細胞分裂素的產(chǎn)生依賴于一個編碼異戊烯基轉移酶的基因LjIPT3，而LjIPT3影響結瘤受AON通路中的HAR1調控。

除了植物激素外，最近的研究也發(fā)現(xiàn)小分子miRNA也參與到了AON地上地下的信號交互中。Tsikou等[51]發(fā)現(xiàn)百脈的miR2111在葉片組織的韌皮部特異表達，且其表達受根瘤菌侵染誘導。通過miR2111過表達以及靶基因分析，發(fā)現(xiàn)miR2111通過地上到地下的長距運輸，抑制結瘤調控因子TML的表達，從而在根系需要結瘤時維持根部對根瘤菌侵染的敏感性。同時通過將地上與地下組織分離，研究發(fā)現(xiàn)miR2111過表達以及tml突變體可以在沒有地上組織的情況下仍能與根瘤菌形成根瘤，從而證明了miR2111與TML調控結瘤的關鍵作用。

2.5 硝酸鹽對AON通路的影響機制

在研究豆科植物AON分子機制時，科研人員發(fā)現(xiàn)硝酸鹽濃度可以影響根部的結瘤，如高硝態(tài)氮或銨態(tài)氮可以顯著抑制豆科植物結瘤數(shù)量[52]。在超結瘤突變體中，10 mM的KNO3顯著抑制野生型材料的結瘤，部分抑制了tml突變體的結瘤，而har1突變體則對氮素不敏感[45]。Okamoto等[33]將百脈根幼苗在不同濃度的硝酸鹽進行處理，對編碼CLE短肽的基因進行表達分析，結果顯示參與AON調控的CLE短肽也受到氮素的調控，其中LjCLE-RS2受硝酸鹽處理誘導表達，在30 mmol·L-1的KNO3條件下LjCLE-RS2轉錄本積累達到最大值，而LjCLE-RS1表達則受到硝酸鹽抑制。在大豆中發(fā)現(xiàn)了同樣的機制，硝酸鹽處理可以顯著誘導CLE短肽基因GmNIC1的表達，過表達GmNIC1以CLV1受體激酶GmNARK依賴方式抑制根部結瘤[35]。Mens等[53]鑒定出同時受根瘤菌和硝酸鹽誘導的蒺藜苜蓿CLE肽基因MtCLE35。MtCLE35的過表達可以抑制苜蓿的結瘤數(shù)量，而MtCLE35抑制作用需要CLE受體激酶SUNN和修飾CLE短肽的阿拉伯糖基轉移酶RDN1的參與[53-54]。

Nishida等[55]鑒定出一個百脈根突變體nrsym1(nitrateunresponsivesymbiosis1)，NRSYM1基因編碼NIN類蛋白NLP(NIN-LIKE PROTEIN)，在高硝酸鹽誘導下，NLP可以直接調節(jié)CLE-RS2的表達來抑制結瘤數(shù)量。此外，苜蓿中NIN的同源蛋白NLP1可以響應硝酸鹽信號，nlp1突變體可以降低外源硝酸鹽對其的結瘤抑制，而過表達NLP1導致植株對硝酸鹽抑制結瘤極為敏感。進一步研究表明，外源硝酸鹽可以調控NLP1使其進入細胞核與NIN形成復合物，進而抑制結瘤反應[56]。

苜蓿地上組織表達的CRA2(CompactRootArchitecture2)編碼與MtSUNN同源的短肽受體激酶蛋白，cra2突變體表現(xiàn)出結瘤數(shù)量降低和側根數(shù)量增多的表型[57]。通過嫁接實驗證明，CRA2與MtSUNN類似，均在地上組織行使功能調控根部的結瘤數(shù)量。苜蓿根部表達的CEPs短肽 (C-terminally Encoded Peptides)受低氮條件誘導表達，CEPs過表達與cra2突變體表現(xiàn)出完全反向的表型，側根生長被抑制，根部結瘤數(shù)量增多，即使在高硝酸鹽條件下，CEPs仍能促進結瘤數(shù)量[58]。在擬南芥中，CRA2的同源基因CEPR1被驗證與AtCEP1短肽直接結合[59]。Mohd-Radzman等[60]研究證明，CEPs調控側根發(fā)育和結瘤數(shù)量依賴于CRA2受體激酶。Gautrat等[61]進一步研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿MtCEP通過長距離運輸被地上組織CRA2識別后，CRA2通過調控下游基因從而促進miR2111的表達，最終通過抑制TML的表達而促進結瘤的形成。

3 研究展望

豆科植物通過結瘤自調控(AON)信號通路平衡共生過程中氮素的需求以及維持共生的物質能量消耗，該機制的深入解析將有助于人們更好的利用AON途徑提高豆科植物的結瘤固氮能力，因此具有極其重要的研究價值。通過前期的研究，AON地上和地下交互的分子調控網(wǎng)絡框架已初步形成(圖1)，這一復雜的調控系統(tǒng)包括了信號的長距離運輸、信號的識別以及不同通路的交互調控，從而能夠精細針對不同的環(huán)境做出調節(jié)。

圖1 豆科植物結瘤自調控(AON)的分子機制Fig.1 Molecular mechanisms of autoregulation of nodulation(AON)in legumes

雖然AON的研究已取得了一些進展，但仍有很多關鍵問題亟待進一步解答：(1)地下信號的挖掘：大豆研究表明，CLE短肽GmRIC1和GmRIC2是AON途徑關鍵的地下信號因子，其長距離運輸?shù)降厣吓cGmNARK結合共同調控結瘤的數(shù)量。然而，研究發(fā)現(xiàn)gmric1/gmric2雙突并沒有表現(xiàn)出gmnark突變體一樣的超結瘤表型[62]。CLE短肽是植物中最龐大的多肽分子家族之一[63]，其中大豆中編碼了至少84個CLE基因[38]，而且其中有很多受到根瘤菌和氮素調控，因此，是否有其他CLE肽或其他短肽參與長距離信號調控仍有待于進一步的挖掘；(2)地上關鍵基因和信號的挖掘：雖然研究已鑒定出地上釋放的細胞分裂素及小分子RNA 在長距離運輸信號的關鍵作用，但并不能解釋全部AON地上信號的功能。實驗證明在地上組織外源施加細胞分裂素可以抑制結瘤，但其他研究也表明細胞分裂素是根瘤形成發(fā)育所必需的因子[64]，因此，其在地上和地下作用的差別機理有待于進一步解析；(3)地上受體激酶下游的作用機理：葉片表達的受體激酶CLV1和CRA2在與相應的短肽識別結合后，分別反向和正向調控miR2111的表達，但受體激酶如何調控miR2111的表達的機制仍然不清楚；(4)TML調控結瘤的分子機理：TML基因在地下根和根瘤中特異表達并抑制結瘤的數(shù)量。TML編碼一個F-box蛋白，但該F-box蛋白通過哪些通路來調控結瘤數(shù)量的機制仍然未知；(5)環(huán)境因素對AON機制的影響：TML雖然在AON機制中處于HAR1的下游，共同調控根瘤數(shù)量。但不同于har1突變體，tml突變體對環(huán)境氮素十分敏感，因此，對于環(huán)境調控AON通路仍然存在一些其他未知的關鍵基因有待探索。除了關于分子機制的研究問題外，如何有效利用AON途徑提高豆科植物共生固氮能力仍待進一步解決。在豆科植物中clv1和tml突變體雖然可以顯著促進結瘤數(shù)量，但超結瘤表型并沒有提高植株的固氮效率，反而抑制了植株的生長發(fā)育，因此，如何在自然資源中挖掘AON關鍵基因的優(yōu)異功能單倍型或利用基因編輯手段創(chuàng)制理想的變異材料是后續(xù)提高豆科植物結瘤固氮效率仍待解決的問題。