孟凡艷，吳桐忠，王 旭，張星星，韓猛立，鐘發(fā)剛，胡建軍，黃 新

（1.塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點實驗室）

我國奶牛乳房炎的發(fā)病率較高，平均每年損失超過3億元[1]。奶牛乳房炎的發(fā)病原因主要是由病原微生物感染引起的[2]。目前已經(jīng)確定引起奶牛乳房炎的病原微生物約有150種，其中最常見的有金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及鏈球菌等[3]。新疆處于國際公認最適宜奶牛飼養(yǎng)的地區(qū)，奶牛養(yǎng)殖業(yè)是新疆地區(qū)的重要產(chǎn)業(yè)[4]。2021年7月份，石河子地區(qū)某奶牛養(yǎng)殖場出現(xiàn)了奶牛乳房炎的病例，奶牛乳房紅腫，產(chǎn)奶量下降，乳汁呈水樣、絮狀，對養(yǎng)殖場造成了一定的經(jīng)濟損失。本試驗對該養(yǎng)殖場送檢的15份乳樣進行病原菌分離，通過形態(tài)觀察、PCR檢測及同源性比對確定病原菌，通過藥敏試驗分析病原菌的耐藥性，以期對石河子地區(qū)奶牛乳房炎的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料信息

石河子地區(qū)某奶牛養(yǎng)殖場送檢乳樣15份，標記為樣品1 -15號?；疾∧膛Ｄ挲g在2～ 7歲不等，大部分處于產(chǎn)奶后期，乳汁多呈水樣，采用紫花地丁、蒲公英、頭孢喹啉等藥物進行不同程度的治療，治療時間為3～24 d不等，治療效果不佳。詳見表1。

表1 送檢樣品信息

1.1.2 主要試劑

TSA、MH、甘露醇高鹽瓊脂、麥康凱培養(yǎng)基、細菌微量生化反應(yīng)管，購自青島海博生物技術(shù)有限公司；引物、2×master PCR Mix，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DL2000 Maker，購自Ta KaRa公司；細菌DNA提取試劑盒，購自天根生化科技有限公司；藥敏紙片，購自杭州微生物試劑有限公司。

1.1.3 主要儀器

PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀，均為Bio-Rad公司生產(chǎn)。

1.2 試驗方法

1.2.1 細菌分離

在無菌條件下，用移液器吸取200 μL乳樣接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，再將LB液體培養(yǎng)基中的菌液分別劃線接種于麥康凱瓊脂、甘露醇高鹽瓊脂平板上，放于恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)，選擇單個菌落進行純化。在純化后的細菌中挑取形態(tài)良好的單菌落進行革蘭氏染色和鏡檢，觀察其形態(tài)。

1.2.2 生化試驗

無菌挑取純化后的單菌落或吸取2～ 10 μL單菌落的增菌液，將其注入鑒定生化管內(nèi)（按照說明書操作），37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，部分生化試驗需要培養(yǎng)24～48 h后觀察結(jié)果，結(jié)果參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[5]進行判定。

1.2.3 細菌的16S rRNA的鑒定

使用細菌DNA提取試劑盒對分離株的菌液進行細菌DNA的提?。ò丛噭┖姓f明書操作），獲取細菌DNA后，參照細菌通用引物序列進行PCR擴增，細菌16S rRNA通用引物27F（5′ -AGAGTTTGATCCT?GGCTC -3′；1492R：5′ -CGGCTACCTTGTTAC?GACTT -3′，由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司合成）；預(yù)計擴增片段長度為1 500 bp。PCR擴增采用20 μL體系：dd H2O（8 μL），2×PCR Mix（10μL），上、下游引物（各0.5 μL），DNA模板（1 μL）。擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸5 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物吸取5 μL進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像后，將陽性產(chǎn)物送至通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司進行測序，測序結(jié)果與NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中的登錄基因序列進行同源性比較與分析。

1.2.4 藥物敏感性試驗

選取青霉素、阿莫西林、頭孢喹啉、頭孢他啶、頭孢拉定、頭孢哌酮、鏈霉素、慶大霉素、多西環(huán)素、麥迪霉素、氟苯尼考、丁胺卡那、多粘菌素B、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、復(fù)方新諾明、阿奇霉素、替考拉寧、克林霉素等藥物采用K -B 法對分離菌進行藥敏試驗。取100 μL菌液均勻涂布在MH 瓊脂平板上，待其干燥后貼上藥敏紙片，放置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃過夜培養(yǎng)后將其拿出測量抑菌圈直徑，根據(jù)CLSI的判定標準對試驗結(jié)果進行判斷。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌分離

接種6、7、13號乳樣的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基在培養(yǎng)24 h后長出黃色且表面光滑的菌落，呈葡萄狀排列；鏡檢結(jié)果顯示，為革蘭氏陰性菌。接種14號乳樣的麥康凱培養(yǎng)基，恒溫培養(yǎng)18 h后，菌株形成典型的大腸桿菌樣形態(tài)特征：圓形，表面光滑且濕潤的大菌落；將細菌進行革蘭氏染色后鏡檢，為革蘭氏陰性的短桿菌。共從15份乳樣中分離到1株大腸桿菌、5株金黃色葡萄球菌，分離率為40.0%。

2.2 生化試驗結(jié)果

結(jié)合培養(yǎng)特性初步鑒定出1株大腸桿菌和5株金黃色葡萄球菌，為進一步驗證結(jié)果，進行生化試驗。大腸桿菌生化結(jié)果顯示：分離株可發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇；M.R.顯示陽性；對明膠、V-P試驗均為陰性。金黃色葡萄球菌生化結(jié)果顯示：分離株可發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇；明膠、V-P試驗M.R.顯示陽性。

2.3 16S rRNA鑒定結(jié)果

采用細菌通用16S rRNA 基因引物進行擴增，電泳結(jié)果如圖1所示。通過測序結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫中進行BLAST對比，大腸桿菌同源性大于99.9%，金黃色葡萄球菌的同源性在97.49%～ 99.71%之間，進一步確定了菌株信息。

圖1 部分樣本16SrRNA PCR鑒定結(jié)果

2.4 藥敏試驗結(jié)果

選取從乳樣7中分離到的1株金黃色葡萄球菌與從乳樣14中分離到的大腸桿菌為代表進行藥敏試驗，結(jié)果見表2。藥敏試驗結(jié)果顯示，金黃色葡萄球菌對阿莫西林、頭孢喹啉、頭孢拉定、頭孢哌酮、鏈霉素、慶大霉素、多西環(huán)素、麥迪霉素、氟苯尼考、丁胺卡那、多粘菌素B、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、復(fù)方新諾明、阿奇霉素和克林霉素17種藥物敏感，對替考拉寧耐藥、青霉素和頭孢他啶的作用尚不清楚；大腸桿菌對頭孢哌酮、慶大霉素、氟苯尼考、丁胺卡那、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、復(fù)方新諾明和阿奇霉素9種藥物敏感，對青霉素、阿莫西林、頭孢拉定、鏈霉素、麥迪霉素、替考拉寧和克林霉素的作用尚不清楚，對剩余的4種藥物表現(xiàn)為中介。

表2 藥敏試驗結(jié)果

3 討論

經(jīng)過對乳樣進行分離鑒定，本試驗共分離出6株菌株，通過形態(tài)學(xué)觀察、生化試驗、測序比對等，最終確定為1株大腸桿菌和5株金黃色葡萄球菌。

引起奶牛乳房炎的細菌主要是金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和鏈球菌，三者總比例可占到90%以上，同時金黃色葡萄球菌的帶菌率最高，本次實驗中分離到的菌株主要為金黃色葡萄球菌，與雙金[6]等研究相符。

臨床中常常使用抗菌藥物對奶牛乳房炎進行治療，但由于近年來抗菌藥物的濫用導(dǎo)致臨床中產(chǎn)生嚴重的耐藥性，致使奶牛乳房炎治療效果較差，同時抗生素在畜產(chǎn)品中的殘留問題，也嚴重危害著消費者的健康。本試驗中，金黃色葡萄球菌對阿莫西林、頭孢喹啉、頭孢拉定等17種藥物敏感，大腸桿菌對頭孢哌酮、慶大霉素、氟苯尼考等9種藥物敏感。今后在該養(yǎng)殖場的用藥中，我們要選擇敏感的藥物進行治療，如慶大霉素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星等，而且要交替使用，避免耐藥性的產(chǎn)生。

我國是畜牧業(yè)養(yǎng)殖大國，奶牛養(yǎng)殖在我國畜牧業(yè)生產(chǎn)中占有較大比例，其中在奶牛養(yǎng)殖業(yè)中，牛奶的產(chǎn)量是決定生產(chǎn)效益的較大因素之一，但奶牛感染乳腺炎后導(dǎo)致泌乳下降，造成治療成本升高和死亡率增加，給我國奶牛業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失[7]。因此，在實際生產(chǎn)中，我們要及時查明奶牛乳房炎的病因，對病原進行有效控制，及時減少不必要的經(jīng)濟損失。