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        真菌Aspergillus sp.對銅的耐受機制研究

        2022-03-10 09:34:44陳蘭洲吳萬銀李昌虎何凡張玉克
        關(guān)鍵詞:琥珀酸有機酸培養(yǎng)液

        陳蘭洲,吳萬銀,李昌虎,何凡,張玉克

        (武漢大學 資源與環(huán)境科學學院,武漢 430074)

        廢棄礦山的尾礦中含有大量的重金屬,其滲濾液容易污染礦山周邊的土壤,并且會對周邊居民的健康以及生態(tài)環(huán)境造成影響[1].因此,對廢棄礦山進行修復變得極為重要和迫切.目前,物理修復、化學修復以及生物修復技術(shù)是常用的礦山修復方法,其中,無額外污染、經(jīng)濟有效的微生物修復技術(shù)逐漸受到研究者的關(guān)注[2].

        微生物修復技術(shù)是指利用人工馴化或者土著微生物的自身特性和新陳代謝作用來吸附重金屬、降低重金屬毒性以及改善土壤質(zhì)地的修復技術(shù)[3].微生物細胞壁中帶有負電的官能團,展現(xiàn)出了較好的與重金屬結(jié)合的能力,此外,微生物代謝的各種小分子有機酸也是微生物修復重金屬污染土壤的重要物質(zhì),這些有機酸能夠改變基質(zhì)酸堿度以及結(jié)合重金屬降低其毒性[4].合適的微生物物種選擇則是微生物修復成功的關(guān)鍵,與異位微生物相比,原位微生物更加有優(yōu)勢,主要表現(xiàn)在對生態(tài)環(huán)境的適應性和相關(guān)重金屬的耐受性上[5],然而目前對特定場地的微生物修復物種的相關(guān)耐受性、污染物去除機理、作用機制等方面的研究尚有欠缺.

        因此,本研究以銅尾礦庫篩選出的一株土著真菌為對象,研究了其對重金屬銅的耐受、去除能力,并進一步分析了其耐受的機理和其對生長環(huán)境的改變能力,以期為選擇金屬礦區(qū)污染土壤修復的微生物物種提供參考依據(jù).

        1 材料與方法

        1.1 實驗材料

        供試真菌為Aspergillussp.TDC-1,分離自云南湯丹的一處銅礦尾礦庫,經(jīng)純化鑒定后(NCBI檢索號:MZ221492)保存于武漢大學資源與環(huán)境科學學院生態(tài)學與環(huán)境生物學實驗室.將保存的菌種接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)固體培養(yǎng)基上,28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d 后,在平板中倒入無菌去離子水,使用滅菌的接種環(huán)將孢子輕輕劃入無菌水中,然后將孢子懸浮液吸出備用.

        1.2 實驗方法

        將含有200 mL PDA 液體培養(yǎng)基的錐形瓶高溫滅菌,冷卻至室溫后加入CuSO4·5H2O 儲備液,分別配置成Cu2+濃度為0、5、25、50、100、150、200 mg·L-1的培養(yǎng)基.然后接種2 mL孢子懸浮液,設置3個平行,最后置于震蕩培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)(27 ℃,150 r/min),培養(yǎng)14 d 后使用0.45 μm 水膜過濾,收集菌絲體和濾液用于后續(xù)分析.

        1.3 菌絲掃描電鏡觀察

        將新鮮菌絲體洗滌后使用FAA 固定液(50%乙醇、丙三醇、甲醛、冰醋酸的體積比為18∶1∶1∶1)固定過夜,固定后,使用20%的乙醇對菌絲進行處理,時間為15 min,然后離心收集菌絲,之后依次使用濃度為50%、80%、100%的乙醇各處理一次.處理結(jié)束后加入叔丁醇,并放于-20 ℃冰箱進行樣品固化,然后在冷凍干燥機中凍干樣品,凍干時長為12 h,凍干后使用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察菌絲的形態(tài).

        1.4 菌絲生理生化指標

        將收集到的新鮮菌絲體用去離子水洗滌2~3次,放入70 ℃烘箱中烘干至恒重,然后稱量菌絲體的干重.真菌的生長抑制率按照公式(1)進行計算.

        式中,m0為未受脅迫處理組的真菌干重,mc為受脅迫處理組的真菌干重.

        在研缽中加入0.1~0.2 g 新鮮菌絲、適量石英砂和2 mL 0.05 mol/L 的磷酸緩沖溶液(含有體積分數(shù)為1%的聚乙烯吡咯烷酮并且調(diào)節(jié)pH到7.8),研磨,待研磨成勻漿后吸出勻漿液并定容到10 mL,然后離心10 min(4 ℃,8000 r/min),取上清液并使用紫外分光光度計測量菌絲中的蛋白質(zhì)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性[6].然后另取0.1~0.2 g 新鮮菌絲于研缽中,以2 mL 0.05 mol·L-1的磷酸緩沖溶液(pH為7.8)為提取液,研磨離心后取上清液測量菌絲中的丙二醛(MDA)的含量[6].

        1.5 pH和有機酸含量的測定

        使用pH 計直接測量培養(yǎng)液的pH.用0.1 mol·L-1的H2SO4酸化濾液,并用0.22 μm 濾膜進行二次過濾,然后用高效液相色譜進行有機酸的檢測.以草酸、乙酸、抗壞血酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸和蘋果酸標準品的出峰時間和峰面積作為對照,對培養(yǎng)液中有機酸的成分和濃度進行分析.色譜條件為:0.01 mol/L 的磷酸二氫鉀緩沖液(pH 為2.8)與甲醇混合液(緩沖液與甲醇的體積比為95∶5)作為流動相,色譜柱為Agilent SB-C18,進樣量為200 μL,柱溫設置為25 ℃,流速為1 mL/min,分析波長為210 nm.

        1.6 Cu2+去除率的測定

        濾液中的Cu2+濃度通過火焰原子吸收法進行測量,測量前使用0.22 μm 濾膜對濾液進行二次過濾.培養(yǎng)液中Cu2+的去除率按照公式(2)計算.

        式中,ρ0為培養(yǎng)初期培養(yǎng)液的Cu2+濃度,ρc為培養(yǎng)結(jié)束時培養(yǎng)液的Cu2+濃度.

        1.7 數(shù)據(jù)分析

        使用Excel 2019 進行數(shù)據(jù)整理和計算;使用Origin 2021 繪圖;使 用IBM SPSS Statistics 26 進 行單因子方差分析,顯著性水平設置為α=0.05,多重比較方法選擇Duncan′s multiple range test,用不同的小寫字母表示處理之間存在顯著差異(P<0.05);使用R 語言的corrplot 和Hmisc 程序包進行相關(guān)性分析,用*表示顯著(P<0.05),用**表示極顯著(P<0.01).

        2 結(jié)果與分析

        2.1 Cu2+脅迫對真菌TDC-1生物量的影響

        如圖1 所示,真菌的干重隨著Cu2+脅迫濃度的升高而降低,與未受脅迫的處理組(CK)相比,5、25和50 mg·L-1的Cu2+脅迫對真菌干重無顯著影響(P>0.05),其 生 長 抑 制 率 分 別 為3.35%、12.44% 和10.72%;而100 和150 mg·L-1的脅迫濃度使真菌干重顯著降低(P<0.05),其生長抑制率分別為31.73%和39.29%;當脅迫濃度為200 mg/L 時真菌干重最小,其生長抑制率高達82.62%.

        圖1 Cu2+脅迫對真菌TDC-1干重的影響Fig.1 Effect of Cu2+stress on the dry weight of fungus TDC-1

        2.2 Cu2+脅迫對TDC-1 菌絲可溶性蛋白質(zhì)、MDA 含量和SOD活性的影響

        如圖2(a)所示,菌絲可溶性蛋白質(zhì)含量隨著Cu2+脅迫濃度的升高呈現(xiàn)下降趨勢.與CK 相比,5~50 mg·L-1的Cu2+脅迫對菌絲的蛋白質(zhì)含量無顯著影響(P>0.05),而100~200 mg·L-1的脅迫下菌絲的蛋白質(zhì)含量顯著降低(P<0.05),其中,當脅迫濃度為150 和200 mg·L-1時菌絲的蛋白質(zhì)含量分別降低了49.91%和55.51%.

        由圖2(b)可以看出,Cu2+脅迫引起了真菌TDC-1 的MDA 含量變化,并且隨著脅迫濃度的升高,其MDA 含量也在不斷升高.其中,除5 和50 mg·L-1的Cu2+脅迫處理組對真菌細胞的MDA 含量無顯著影響(P>0.05),其余處理組的真菌MDA 含量與CK 相比有顯著的增加(P<0.05),同時在脅迫濃度為200 mg·L-1時觀察到了最大的MDA 含量增加,為CK的2.51倍.

        如圖2(c)所示,Cu2+脅迫下真菌菌絲的SOD 活性顯著增加(P<0.05),同時5~150 mg·L-1處理組之間的SOD 活性無顯著差異(P>0.05).然而,真菌在200 mg/L Cu2+脅迫下未檢測到SOD活性.

        圖2 Cu2+脅迫對真菌TDC-1生化指標的影響Fig.2 Effect of Cu2+stress on the biochemical indexes of fungus TDC-1

        2.3 Cu2+脅迫對真菌TDC-1形態(tài)的影響

        圖3 展示了不同濃度Cu2+脅迫下真菌TDC-1 的形態(tài).低濃度(5 mg·L-1)的Cu2+對真菌TDC-1 幾乎沒有影響,隨著脅迫濃度(25~150 mg·L-1)的升高,菌絲體受到損傷的同時開始出現(xiàn)菌絲縮小、斷裂的現(xiàn)象,并且在高濃度(200 mg·L-1)時發(fā)生菌絲膨大以及真菌破裂死亡的現(xiàn)象.

        圖3 Cu2+脅迫對真菌TDC-1形態(tài)的影響Fig.3 Effect of Cu2+stress on the morphology of fungus TDC-1

        2.4 Cu2+脅迫對培養(yǎng)液中pH和有機酸含量的影響

        對培養(yǎng)液pH 的測定結(jié)果顯示,隨著Cu2+脅迫濃度的升高,培養(yǎng)液的pH 值出現(xiàn)先增大后降低的現(xiàn)象(圖4(a)),并且在脅迫濃度為50 mg·L-1時達到了最大值(6.21),在150 mg·L-1時有最小值(4.37).同時,對培養(yǎng)液中7 種有機酸的檢測中僅檢出了3 種有機酸,分別為草酸、乙酸和琥珀酸(圖4(b)),其中,在Cu2+脅迫濃度為50 mg·L-1時觀察到了3 種有機酸的最小值,在200 mg·L-1處理組中觀察到了3種有機酸的最大值.與CK 相比,50 mg·L-1處理組的草酸、乙酸和琥珀酸含量分別降低了72.79%、57.06%和55.23%;而200 mg·L-1處理組的草酸和琥珀酸含量分別提升了213.30%和534.65%.就有機酸的總量而言,與CK 相比,50 mg·L-1處理組的總量降低了61.31%,而200 mg·L-1處理組的總量增加了184.72%.

        圖4 Cu2+脅迫對培養(yǎng)液中pH和有機酸含量的影響Fig.4 The effect of Cu2+stress on pH and organic acid content in culture broth(a)pH;(b)有機酸含量

        2.5 不同脅迫濃度下真菌對Cu2+去除率的變化

        對培養(yǎng)液中Cu2+的測定發(fā)現(xiàn),隨著初始Cu2+濃度的升高,去除率也在逐漸下降(圖5).其中,真菌在Cu2+脅迫濃度為5、25、50 和100 mg·L-1的脅迫下有超過60% 的去除率,分別為99.24%、88.73%、74.65%和68.06%.

        2.6 不同濃度Cu2+脅迫下真菌生理生化指標和有機酸的相關(guān)性分析

        圖6展示了脅迫下真菌生理生化指標和有機酸之間的相關(guān)性.其中,脅迫濃度與pH、菌絲干重和蛋白質(zhì)含量呈極顯著負相關(guān),與MDA、草酸和琥珀酸濃度呈極顯著正相關(guān);培養(yǎng)液中的pH 與草酸和琥珀酸的含量呈極顯著負相關(guān),與蛋白質(zhì)含量呈極顯著正相關(guān);MDA 與菌絲干重和蛋白質(zhì)含量呈極顯著負相關(guān),與琥珀酸和草酸含量呈極顯著正相關(guān).

        圖6 不同濃度Cu2+脅迫下真菌生理生化指標和有機酸的相關(guān)性分析Fig.6 Correlation analysis between physiological and biochemical indexes and organic acids of fungi under different concentrations of Cu2+Stress

        3 討論

        真菌干重的大小可在一定程度上反映Cu2+脅迫對真菌TDC-1 的影響程度,真菌TDC-1 的生長抑制率(圖1)表明:TDC-1至少可以耐受50 mg·L-1的Cu2+脅迫.SEM 的圖像分析(圖3)則發(fā)現(xiàn),50 mg·L-1的Cu2+脅迫下TDC-1 形態(tài)良好僅部分菌絲出現(xiàn)縮小的現(xiàn)象,而隨著Cu2+濃度的升高,菌絲縮小加劇,并出現(xiàn)膨大死亡的現(xiàn)象.同時,對培養(yǎng)液中Cu2+的測量(圖5)發(fā)現(xiàn),TDC-1 在100 mg·L-1的脅迫濃度下仍有較好的Cu2+去除率.因此,本研究說明:真菌TDC-1能夠較好地耐受濃度50 mg·L-1以下的Cu2+脅迫,并且有著較好的Cu2+去除作用.

        圖5 不同脅迫濃度下真菌TDC-1對Cu2+的去除率Fig.5 Removal rate of Cu2+by fungus TDC-1 under different stress concentrations

        生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)有參與重金屬的解毒,增強生物對各種脅迫耐受的能力,而不同的生物在脅迫下所表達出的可溶性蛋白質(zhì)有所不同,通過對可溶性蛋白質(zhì)總量的分析,可以更好地了解真菌對Cu2+脅迫的抵御機制[7].真菌TDC-1在Cu2+脅迫下總體蛋白質(zhì)含量呈下降趨勢(圖2(a)),可能是可溶性蛋白質(zhì)在抵御Cu 脅迫中并非起到主導作用的原因[8].此外,真菌在重金屬脅迫下活性氧和蛋白質(zhì)酶含量會增加,從而導致蛋白質(zhì)破裂和降解的速率加快,也可能會導致蛋白質(zhì)含量下降[9].

        MDA 是細胞膜受損后的產(chǎn)物,因此MDA 的含量成為了判斷真菌細胞膜受損程度的手段之一[10].研究發(fā)現(xiàn),隨著Cu2+脅迫濃度的升高,真菌TDC-1 受到的損傷越大(圖2(b)),Cu2+濃度超過100 mg·L-1就能觀察到較明顯的損傷現(xiàn)象(圖3).活性氧自由基(ROS)是真菌在受到外界脅迫時細胞產(chǎn)生的物質(zhì)之一,如果不對多余的ROS 進行清除,真菌的生長發(fā)育就會受到影響,而SOD 可以通過清除ROS 以應對非生物脅迫[11].實驗發(fā)現(xiàn),Cu2+脅迫下,菌絲體內(nèi)的SOD 活性增加(圖2(c)),但SOD 的活性隨著脅迫濃度的升高有下降的趨勢,表明TDC-1 對脅迫的耐受有一定的限度[12].

        在有毒金屬礦物存在的情況下,真菌在生長過程中會分泌大量的有機酸(如乙酸、檸檬酸和草酸)以應對脅迫[13].有機酸可以通過螯合作用結(jié)合重金屬使其從離子態(tài)轉(zhuǎn)化為無毒或是低毒性的螯合態(tài)[14].研究發(fā)現(xiàn),草酸和琥珀酸的含量與脅迫濃度呈極顯著的正相關(guān),說明有機酸的分泌是TDC-1 抵抗Cu2+脅迫的重要手段之一;此外,實驗還發(fā)現(xiàn),有機酸的分泌量與培養(yǎng)液的pH 有顯著的相關(guān)性,這與其他學者的研究結(jié)果類似[15].

        當脅迫濃度較低時(0~50 mg/L),TDC-1 受到的損害較小,生物量和菌絲形態(tài)與CK 相比無顯著改變,此時抗氧化酶系統(tǒng)可能是其耐受Cu2+的主要機制,而有機酸則在真菌受到脅迫和吸附重金屬離子的過程中含量降低[16],溶液中的pH 也因此增加。當脅迫濃度較高時(50~200 mg/L),TDC-1 受到的損害增大,生物量降低并且發(fā)生嚴重的形態(tài)改變,而SOD 活性也有所降低,此時有機酸可能是其耐受Cu2+的主要機制,因此培養(yǎng)液中有機酸含量大量增加,pH 降低.但關(guān)于真菌TDC-1 有機酸分泌的具體機制,還需要代謝和基因組學的驗證.

        綜上所述,真菌TDC-1 能夠耐受至少50 mg·L-1的Cu2+脅迫,并且對培養(yǎng)液中的Cu2+有較好的去除效率,是優(yōu)秀的銅礦區(qū)修復微生物物種.此外,真菌TDC-1 主要依賴抗氧化系統(tǒng)和分泌有機酸來應對Cu2+脅迫,SOD活性的提高和有機酸的分泌可能是其減輕銅毒害、提高銅耐受性的潛在機制.

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