沈金花，李威

（中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院& 醫(yī)學(xué)生物研究所& 武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430074）

哮喘是一種由結(jié)構(gòu)細(xì)胞、炎癥細(xì)胞、細(xì)胞組分等共同參與的疾?。?］.臨床研究發(fā)現(xiàn)，哮喘的癥狀通常為陣發(fā)的呼吸困難、反復(fù)發(fā)作的喘息、胸悶以及咳嗽等，且通常伴隨有哮鳴音［2］.氣管平滑肌的收縮特性在哮喘發(fā)作中起重要作用［3］.調(diào)查顯示，全球患有哮喘的人數(shù)現(xiàn)已超過(guò)3億人［4］.哮喘對(duì)患者的生活和整個(gè)社會(huì)都造成了負(fù)擔(dān)，臨床上治療哮喘以緩解癥狀為主［5］，目前常規(guī)的藥物并不能徹底治愈哮喘，且長(zhǎng)期使用會(huì)使患者產(chǎn)生一定耐藥性，不利于疾病的治療.因此，新型藥物的開(kāi)發(fā)是臨床治療哮喘亟待解決的一個(gè)問(wèn)題.而中藥價(jià)格低廉、作用溫和、且不易產(chǎn)生耐藥性，可以此為切入點(diǎn)尋找出治療哮喘的有效藥物.

蘿芙木（Rauvofia verticillata）是取自?shī)A竹桃科植物蘿芙木的根部作為中藥材，可清熱、降壓、利尿、安神，對(duì)感冒發(fā)燒、跌打損傷、咽喉腫痛、頭痛、失眠、高血壓等病癥有治療效果［6］.目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于蘿芙木在氣管平滑肌方面的作用的研究還處于空白階段.而本課題組通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蘿芙木乙醇提取物可以舒張異常收縮的小鼠離體氣管環(huán)，因此，本文以蘿芙木的乙醇提取物為實(shí)驗(yàn)藥物探究其對(duì)小鼠氣管平滑肌的舒張作用及作用機(jī)理.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 試劑和儀器

蘿芙木（采自云南昆明，經(jīng)中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院劉虹副教授鑒定為蘿芙木根部）；乙酰膽堿（上海源葉生物科技）；氯化鉀、氯化鋰、無(wú)水乙醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑）；Pyr3、Gadolinium、硝苯地平（美國(guó)Sigma）.

2 Ca2+PSS：135 mmol·L-1NaCl、10 mmol·L-1Glucose、10 mmol·L-1HEPES、5 mmol·L-1KCl、2 mmol·L-1CaCl2、1 mmol·L-1MgCl2·6H2O，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 至7.4. 0 Ca2+PSS：135 mmol·L-1NaCl、10 mmol·L-1Glucose、10 mmol·L-1HEPES、5 mmol·L-1KCl、1 mmol·L-1MgCl2·6H2O、0.5 mmol·L-1EGTA，用NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 至7.4. 2 Ca2+母液：120 mmol·L-1CaCl2. Li-PSS：135 mmol·L-1LiCl、10 mmol·L-1Glucose、10 mmol·L-1HEPES、5 mmol·L-1KCl、2 mmol·L-1CaCl2、1 mmol·L-1MgCl2·6H2O，用Trisbase溶液調(diào)節(jié)pH至7.4.

DZ-1A真空干燥箱、FW135型中草藥粉碎機(jī)（天津市秦斯特儀器）；體視顯微鏡（SZM，武漢愛(ài)斯佩科學(xué)儀器）；HV-4型離體組織器官恒溫灌流系統(tǒng)、BL-420S型生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟科技）；JH-2型張力換能器（中國(guó)北京·航天醫(yī)學(xué)工程研究所）；小動(dòng)物肺功能儀（Flexivent，SCIREQ Inc，Montreal，Canada）.

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

無(wú)特定病原體級(jí)（SPF級(jí)）小鼠，品系為BALB/c，雄性，6～8 周齡，購(gòu)買于湖北省疾病預(yù)防控制中心，在中南民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行飼養(yǎng).動(dòng)物實(shí)驗(yàn)按照《中南民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與福利指導(dǎo)手冊(cè)》中相關(guān)規(guī)定進(jìn)行.

1.2 蘿芙木乙醇提取物的制備

取用蘿芙木的根部作為原料，將其研磨成粉末狀.以體積比例為1∶10 的固液比把蘿芙木粉末與95%的乙醇溶液混合，在常溫下浸泡4 d 后，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到蘿芙木乙醇部提取物，充分烘干后去除殘留的乙醇，根據(jù)溶解度選擇二甲基亞砜（DMSO）進(jìn)行溶解.

1.3 小鼠離體氣管環(huán)的分離與上樣

利用脊椎脫臼法處死小鼠，將氣管及肺部組織取下，放置到冰浴后的PSS溶液中，利用體視顯微鏡去除黏附于氣管環(huán)上的血塊及組織，將主氣管兩端剪斷，分離出約5 mm主氣管環(huán).取邊長(zhǎng)約為5 mm的三角鉤固定氣管環(huán)后，連接到張力換能器上.此時(shí)向37 ℃恒溫水浴槽中加入6 mL PSS，持續(xù)給予氧氣供應(yīng).將氣管環(huán)置于水浴槽中，調(diào)前負(fù)荷數(shù)值為270～300 mg，穩(wěn)定15 min 后重新加入PSS 溶液，調(diào)前負(fù)荷數(shù)值為270～300 mg，共計(jì)平衡60 min.平衡結(jié)束后利用激動(dòng)劑刺激氣管環(huán)，當(dāng)氣管環(huán)收縮至穩(wěn)定水平時(shí)，將其洗脫，使其穩(wěn)定在基線30 min后正式實(shí)驗(yàn).

1.4 呼吸系統(tǒng)阻力的檢測(cè)

用1%戊巴比妥鈉對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉，每20 g 體重注射200 μL.將完全麻醉的小鼠腹部朝上進(jìn)行固定，用酒精消毒后剪開(kāi)小鼠氣管所在部位的皮膚和肌肉，使氣管暴露，將氣管剪開(kāi)一個(gè)“T”型小口，插入插管，深度約為2～3個(gè)氣管環(huán)，棉線打結(jié)以固定插管，將小鼠通過(guò)金屬插管連接到肺功能儀的“Y”型管上，保持水平.連接Fexivent 系統(tǒng)，讓小鼠進(jìn)行深呼吸使其達(dá)到最佳實(shí)驗(yàn)狀態(tài).首先測(cè)量基線，待基線平穩(wěn)可靠后向霧化頭中按0～50.0 mg·mL-1的濃度梯度加入ACh 或混合了EERV 的ACh，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)使小鼠霧化吸入上述藥物，獲得相應(yīng)的Rrs 值，重復(fù)6次進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 EERV對(duì)高鉀誘導(dǎo)預(yù)收縮的氣管平滑肌的舒張作用

高鉀溶液是電壓依賴性鈣通道（VDCCs）的一種激動(dòng)劑，可通過(guò)作用于氣管平滑肌上的VDCCs 使細(xì)胞外的Ca2+出現(xiàn)內(nèi)流的現(xiàn)象，此時(shí)細(xì)胞內(nèi)游離的Ca2+濃度迅速升高進(jìn)而導(dǎo)致氣管平滑肌發(fā)生收縮作用［7］.EERV 可劑量依賴性地有效舒張由高鉀誘導(dǎo)預(yù)收縮的氣管環(huán)（圖1（a）、圖1（b）），最大舒張值為（101.88±1.13）%，IC75=0.418 mg·mL-1，IC50=0.194 mg·mL-1.為了達(dá)到較顯著的效果，選取IC75進(jìn)行實(shí)驗(yàn).硝苯地平（Nifedipine）對(duì)L-型電壓依賴性鈣通道（VDLCCs）可起阻斷作用［8］，在濃度為80 mmol·L-1的高鉀溶液作用下預(yù)收縮的氣管環(huán)可被10 μmol·L-1Nifedipine 全部舒張（圖1（c））.EERV 對(duì)靜息的氣管環(huán)張力不產(chǎn)生影響（圖1（d））.實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：EERV 可通過(guò)抑制VDLCCs 達(dá)到舒張高鉀誘導(dǎo)預(yù)收縮的氣管平滑肌的作用.

圖1 EERV對(duì)高鉀誘導(dǎo)預(yù)收縮的氣管環(huán)的舒張作用（n=6）Fig.1 Relaxation effect of EERV on the precontracted trachearing induced by high K+（n=6）

2.2 EERV抑制高鉀誘導(dǎo)的外鈣內(nèi)流

在0 Ca2+環(huán)境下，氣管環(huán)無(wú)法收縮，恢復(fù)正常Ca2+水平后，在激動(dòng)劑高鉀的作用下，氣管環(huán)收縮.0.418 mg·mL-1EERV 可抑制這種收縮（圖2（a））.用0.418 mg·mL-1EERV 提前孵育，當(dāng)Ca2+水平恢復(fù)后，高鉀僅可小幅收縮氣管環(huán)（圖2（b））.結(jié)合2.1 可知，高鉀誘導(dǎo)了小鼠氣管平滑肌的VDLCCs 的開(kāi)放，引發(fā)細(xì)胞外的Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，收縮氣管平滑肌，EERV 可阻斷VDLCCs 進(jìn)而抑制Ca2+內(nèi)流，從而舒張小鼠氣管平滑肌.

圖2 EERV對(duì)高鉀誘導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of EERV on Ca2+influx induced by high K+

2.3 EERV 對(duì)ACh 誘導(dǎo)預(yù)收縮的氣管平滑肌的舒張作用

ACh 是多種離子通道的激動(dòng)劑，可通過(guò)打開(kāi)非選擇性陽(yáng)離子通道（NSCCs）等多種離子通道使細(xì)胞中Ca2+濃度升高，導(dǎo)致氣管平滑肌達(dá)到收縮的狀態(tài)［9-10］.濃度為100 μmol·L-1的ACh 可使氣管環(huán)達(dá)到最大收縮狀態(tài)，EERV 可以有效抑制這種收縮，呈現(xiàn)劑量依賴性（圖3（a）），最大舒張值為（99.73±1.11）%，IC75=2.039 mg·mL-1，IC50=1.244 mg·mL-1（圖3（b））.說(shuō)明EERV可以舒張ACh誘導(dǎo)預(yù)收縮的氣管平滑肌.

圖3 EERV對(duì)ACh誘導(dǎo)預(yù)收縮的氣管環(huán)的舒張作用（n=6）Fig.3 Relaxation effect of EERV on the precontracted trachearing induced by ACh（n=6）

利用100 μmol·L-1濃度的ACh 使離體氣管環(huán)達(dá)到最大收縮狀態(tài)，Nifedipine可以起到消除VDLCCs影響的作用，此時(shí)氣管環(huán)小幅舒張，加入2.039 mg·mL-1EERV 后，氣管環(huán)的收縮完全被抑制（圖4（a））.當(dāng)Nifedipine 存在時(shí)，ACh 仍然可以刺激氣管環(huán)達(dá)到最大收縮狀態(tài)，且能被EERV 舒張（圖4（b））.結(jié)果表明，EERV 還可通過(guò)其他離子通道起到舒張ACh 誘導(dǎo)產(chǎn)生預(yù)收縮的氣管平滑肌的作用.

圖4 排除VDLCCs后EERV對(duì)ACh誘導(dǎo)預(yù)收縮的氣管環(huán)的舒張作用Fig.4 Relaxation effect of EERV on the precontracted trachea ring induced by ACh without VDLCCs

2.4 EERV抑制ACh引起的內(nèi)鈣釋放

0 Ca2+條件下利用ACh 刺激氣管平滑肌，Ca2+從肌質(zhì)網(wǎng)釋放，細(xì)胞中的Ca2+濃度增加，誘導(dǎo)氣管環(huán)產(chǎn)生小幅收縮.當(dāng)Ca2+水平恢復(fù)后，細(xì)胞外的Ca2+出現(xiàn)內(nèi)流的現(xiàn)象，導(dǎo)致氣管環(huán)迅速產(chǎn)生收縮，EERV 可抑制這種收縮（圖5（a）），說(shuō)明EERV 可抑制ACh 引起的外鈣內(nèi)流及內(nèi)鈣釋放.為了驗(yàn)證這一結(jié)論，提前孵育EERV，在Ca2+水平恢復(fù)后，ACh 僅使氣管環(huán)產(chǎn)生小幅收縮，并很快恢復(fù)至基線（圖5（b）），證明EERV 可通過(guò)抑制外鈣內(nèi)流及內(nèi)鈣釋放兩種方式舒張ACh 誘導(dǎo)預(yù)收縮的氣管平滑肌.為了進(jìn)一步對(duì)離子通道進(jìn)行研究，阻斷VDLCCs 后，ACh 僅可小幅收縮氣管環(huán)，當(dāng)Ca2+水平恢復(fù)后，氣管環(huán)迅速收縮，這種收縮可被EERV 抑制（圖5（c）），因此推測(cè)：ACh引起的氣管平滑肌的收縮中可能有NSCCs 的參與.為了驗(yàn)證此推測(cè)，阻斷VDLCCs 后，用EERV 和NSCCs中TRP 的阻斷劑Pyr3 以及Gadolinium 作用于氣管環(huán)［11-12］，ACh 引發(fā)的氣管環(huán)收縮被抑制（圖5（d）、圖5（e））.以上結(jié)果表明，NSCCs 也參與了ACh 引起的氣管平滑肌收縮，EERV 可通過(guò)阻斷NSCCs 抑制ACh引起的內(nèi)鈣釋放.

圖5 EERV對(duì)ACh引起的內(nèi)鈣釋放的抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of EERV on Ca2+release activated by ACh

2.5 EERV抑制Na+/Ca2+交換

研究表明，NCX（Na+/Ca2+交換體）也可以影響細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度.當(dāng)氣管平滑肌細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度上升或者Na+濃度下降時(shí)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+排出；反之則導(dǎo)致Ca2+泵入細(xì)胞［13］.當(dāng)浴液為含有Na+的PSS 溶液時(shí)，ACh 可誘導(dǎo)氣管環(huán)達(dá)到最大收縮，這種收縮可被EERV 抑制（圖6（a））.當(dāng)氣管環(huán)處于不含Na+的Li-PSS 溶液時(shí)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度上升，氣管環(huán)基礎(chǔ)張力上升，加入ACh 后，離體氣管環(huán)產(chǎn)生一定收縮，EERV 可使氣管環(huán)張力降至基線之下（圖6（b））.兩組氣管環(huán)基礎(chǔ)張力值具有顯著性差異，P＜0.01；兩組氣管環(huán)收縮值具有極顯著性差異，P＜0.001（圖6（c））.以上結(jié)果表明：NCX 也參與了氣管平滑肌收縮，EERV 可通過(guò)抑制Na+/Ca2+交換來(lái)舒張ACh誘導(dǎo)預(yù)收縮的氣管平滑肌.

圖6 EERV對(duì)Na+/Ca2+交換的抑制作用Fig.6 Inhibitory effect of EERV on Na+/Ca2+exchange

2.6 EERV對(duì)組織活性的影響

用EERV 使在高鉀或ACh 刺激下收縮的氣管環(huán)舒張后，洗脫3 次，再次加入相同的激動(dòng)劑刺激后，氣管環(huán)均可再次收縮，但無(wú)法達(dá)到最大收縮值（圖7（a）、圖7（c））.用ACh 再次刺激該氣管環(huán)，其收縮值為（78.81±3.28）%，用高鉀再次刺激該氣管環(huán)后，其收縮值為（64.76±1.34）%（圖7（b）、圖7（d））.上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明：EERV 可舒張預(yù)收縮的氣管平滑肌，其洗脫后無(wú)法恢復(fù)可能由于藥物無(wú)法完全被瞬時(shí)洗脫.

圖7 EERV對(duì)組織活性的影響Fig.7 Effect of EERV on tissue activity

2.7 EERV降低ACh引起的Rrs

當(dāng)哮喘病情發(fā)展到一定程度，出現(xiàn)不可逆的氣道功能改變時(shí)，患者肺功能明顯異常，利用肺功能儀對(duì)小鼠Rrs進(jìn)行檢測(cè)，可反映哮喘的嚴(yán)重程度.按0～50.0 mg·mL-1濃度梯度加入ACh（對(duì)照組）模擬哮喘發(fā)生時(shí)的狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)Rrs 隨ACh 濃度增加而升高.在ACh中加入37.3 mg·mL-1EERV（實(shí)驗(yàn)組）后，可顯著降低Rrs.當(dāng)ACh 濃度為12.5 mg·mL-1時(shí)，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組Rrs 值具有差異性，P＜0.05；當(dāng)ACh 濃度為25.0、50.0 mg·mL-1時(shí)，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組Rrs值均具有極顯著性差異，P＜0.001（圖8）.

圖8 EERV對(duì)小鼠呼吸系統(tǒng)阻力的影響Fig.8 Effect of EERV on mouse respiratory system resistance

3 結(jié)語(yǔ)

哮喘屬于異質(zhì)性和基因性的復(fù)合型疾?。?4］.目前的藥物均無(wú)法徹底根治哮喘，且存在一定副作用.研究表明蘿芙木中含有大量的單萜吲哚生物堿及其他類型生物堿和非生物堿，藥理活性主要為降血壓、抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)靜等，其在民間主要以根部入藥［15］.目前的研究主要是針對(duì)蘿芙木中所含的生物堿所進(jìn)行的，但尚未發(fā)現(xiàn)有對(duì)其乙醇提取物的活性成分及藥理作用的研究.本課題組前期通過(guò)對(duì)多種中藥提取物的篩選，發(fā)現(xiàn)EERV 有潛在的治療哮喘的作用，故本文對(duì)EERV 舒張氣管平滑肌的作用機(jī)理進(jìn)行了研究，以期其能夠用于治療或緩解哮喘癥狀.

哮喘發(fā)病機(jī)理的重要特征之一是氣道高反應(yīng)性（AHR）.AHR 指多種刺激因子使氣道產(chǎn)生過(guò)早或過(guò)強(qiáng)的收縮反應(yīng)，而AHR 與氣管平滑肌收縮增強(qiáng)有著緊密的聯(lián)系，因此，與AHR 相關(guān)的氣管平滑肌細(xì)胞收縮信號(hào)的變化對(duì)哮喘的發(fā)展尤為重要［16］.在靜息狀態(tài)下，氣管平滑肌細(xì)胞中維持相對(duì)較低的Ca2+濃度，收縮性激動(dòng)劑刺激氣管平滑肌細(xì)胞引起細(xì)胞鈣庫(kù)中的Ca2+釋放或細(xì)胞外的Ca2+流入，細(xì)胞中游離狀態(tài)下的Ca2+濃度增高，最終可收縮氣管平滑肌［17］.高鉀和ACh可通過(guò)影響VDCCs、NSCCs、NCX等離子通道起到調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的作用.利用高鉀和ACh模擬哮喘發(fā)生時(shí)氣管平滑肌的狀態(tài)，經(jīng)EERV 作用于氣管環(huán)后，氣管平滑肌完全舒張.EERV 抑制細(xì)胞外Ca2+通過(guò)VDLCCs 進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，舒張氣管平滑肌.另外，阻斷VDLCCs 后，EERV 可通過(guò)影響NSCCs 和NCX 通道從而抑制ACh引起的細(xì)胞外Ca2+向細(xì)胞內(nèi)流入和Ca2+從肌質(zhì)網(wǎng)向細(xì)胞質(zhì)釋放，從而對(duì)氣管平滑肌起到舒張作用.哮喘是一種呼吸系統(tǒng)疾病，在活體水平上利用肺功能儀對(duì)小鼠Rrs進(jìn)行檢測(cè)，用ACh刺激小鼠模擬哮喘癥狀，Rrs隨ACh濃度的增加而升高，而在EERV的作用下，上述Rrs被顯著抑制，表明EERV可能在活體水平緩解哮喘癥狀.

綜上所述，EERV 可通過(guò)影響VDCCs、NSCCs 和NCX 等離子通道，對(duì)氣管平滑肌起舒張作用，并在活體水平進(jìn)一步得到了驗(yàn)證.本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：EERV 有望成為治療或緩解哮喘癥狀的新藥，但還需進(jìn)行后續(xù)更加深入的研究.本文僅從組織水平和活體水平對(duì)EERV 舒張氣管平滑肌的機(jī)理進(jìn)行了研究，還可以從細(xì)胞水平上進(jìn)一步驗(yàn)證EERV 對(duì)離子通道的影響，或者對(duì)其主要起舒張氣管平滑肌作用的有效成分進(jìn)行進(jìn)一步研究.由于哮喘是一種炎癥性疾病，還可通過(guò)研究EERV 對(duì)炎癥因子表達(dá)的影響，進(jìn)一步檢驗(yàn)EERV對(duì)哮喘病情緩解的效果.