施樂樂

（福建省食用菌技術(shù)推廣總站，福建 福州 350000）

秀珍菇（Pleurotus pulmonarius） 學(xué)名為肺形側(cè)耳，又名袖珍菇、姬平菇，隸屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota） 傘菌目 （Agaricales） 側(cè)耳科 （Pleurotaceae） 側(cè)耳屬（Pleurotus）[1]，20世紀(jì) 90年代由中國臺灣引進(jìn)內(nèi)地試種并取得成功[2]。羅源縣是福建省秀珍菇主產(chǎn)區(qū)，2020年全縣秀珍菇產(chǎn)量達(dá)14.2萬噸，產(chǎn)值9.7億元，栽培秀珍菇成為菇農(nóng)創(chuàng)收致富的重要途徑。目前羅源秀珍菇主栽品種主要有：秀57、秀63、秀93、秀98、秀912、臺秀122等，上述品種由不同栽培企業(yè)在不同時期從中國臺灣地區(qū)不同機(jī)構(gòu)引進(jìn)，經(jīng)過多年繼代擴(kuò)繁，栽培企業(yè)又對引進(jìn)品種進(jìn)行了重命名，造成羅源秀珍菇栽培品種名稱混亂，同種異名或異種同名現(xiàn)象極為普遍，不利于秀珍菇產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

近年來，分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食用菌等大型真菌的分類、鑒定，其具有模板需求量少、操作簡便、多態(tài)性高等諸多優(yōu)點[3-5]，分子標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)分類鑒定方法的不足，進(jìn)一步提高了食用菌分類、鑒定的準(zhǔn)確性。研究共收集羅源地區(qū)秀珍菇栽培菌株16株，并以福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心保藏的1株野生秀珍菇菌株為對照，通過平板拮抗試驗及RAPD、ISSR、SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對其進(jìn)行親緣關(guān)系分析，以期在分子水平上為解決羅源秀珍菇栽培品種混亂問題提供數(shù)據(jù)支撐和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株共17株，其中16株收集自羅源秀珍菇栽培企業(yè)及菇農(nóng)，另有1株為福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心提供。供試菌株來源信息詳見表1。

表1 供試秀珍菇菌株Tab.1 Tested strains of Pleurotus pulmonarius

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖（PD） 液體培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g切成小塊，加1 000 mL水，水煮30 min，雙層紗布過濾，濾液中加入2%葡萄糖，并補(bǔ)足因蒸發(fā)失去的水分，pH自然，121℃滅菌20 min。

馬鈴薯葡萄糖（PDA）固體培養(yǎng)基：需另加入2%瓊脂，其余成分同馬鈴薯葡萄糖（PD）液體培養(yǎng)基。

1.3 平板拮抗試驗

將不同秀珍菇菌株兩兩接種至平板中，設(shè)置3個重復(fù)，菌絲萌發(fā)后，每天觀察平板菌落交界處的拮抗情況及平板菌落形態(tài)差異情況，做好記錄統(tǒng)計，無拮抗記為“-”，有拮抗記“+”，“+”的數(shù)量表示拮抗的強(qiáng)弱。另用“*”表示菌落形態(tài)差異情況，“*”的數(shù)量表示菌落形態(tài)差異的程度。

1.4 分子標(biāo)記試驗

用改良CTAB法[6]提取17個供試菌株DNA，提取后測定DNA濃度，經(jīng)凝膠電泳檢測合格后，進(jìn)行RAPD、ISSR和SRAP三種標(biāo)記PCR。引物及反應(yīng)體系見表2和表3。

表2 PCR引物Tab.2 The primers of PCR reaction

表3 PCR反應(yīng)體系Ta.3 The PCR reaction system

RAPD-PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性7 min；94℃變性 1 min，34℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。

ISSR-PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，48℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。

SRAP-PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，35℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，5個循環(huán)；94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析

在RAPD、ISSR和SRAP擴(kuò)增結(jié)果電泳圖譜中，按凝膠同一位置上DNA條帶的有無進(jìn)行統(tǒng)計，有條帶用“1”表示，無條帶用“0”表示。采用NTSYSpc-2.10e分析軟件計算樣品間的遺傳相似性系數(shù)，同時用UPGMA進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 平板拮抗試驗

不同秀珍菇菌株平板拮抗試驗結(jié)果見表4。

表4 不同秀珍菇菌株平板拮抗與菌落差異情況Tab.4 Plate antagonism and colony morphology difference of Pleurotus pulmonarius

由表4可知，菌株P(guān)916、P624、57-0、GD三代之間不存在拮抗，菌株P(guān)620和金秀之間不存在拮抗，菌株P(guān)615和X57之間不存在拮抗，菌株P(guān)626和P650之間不存在拮抗，其余菌株之間均存在拮抗；觀察不同供試菌株的菌落形態(tài)，發(fā)現(xiàn)供試秀珍菇菌株之間的菌落形態(tài)均存在一定差異。但平板觀察結(jié)果相對主觀，僅能作為菌株親緣關(guān)系初步判斷的依據(jù)。

2.2 分子標(biāo)記試驗

對提取的17株秀珍菇菌株DNA進(jìn)行RAPDPCR、ISSR-PCR和SRAP-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增所得的DNA圖譜見圖1～圖3。

圖1 秀珍菇菌株RAPD-PCR擴(kuò)增DNA圖譜Fig.1 RAPD-PCR amplification of Pleurotus pulmonarius strains

圖2 引物ISSR1對秀珍菇菌株ISSR-PCR擴(kuò)增DNA圖譜Fig.2 ISSR-PCR amplification of Pleurotus pulmonarius strains with primer ISSR1

圖3 引物em5-em8對秀珍菇菌株SRAP-PCR擴(kuò)增DNA圖譜Fig.3 SRAP-PCR amplification of Pleurotus pulmonarius strains with primer em5-em8

由圖1～圖3DNA圖譜可知，第10泳道的P627和第17泳道的對照菌株秀2與其他供試菌株的電泳條帶差異較大，這表明P627和秀2與其他供試菌株的遺傳差異較大。

2.3 遺傳距離綜合聚類分析

計算各供試菌株的相似系數(shù)，并構(gòu)建遺傳距離綜合分析聚類圖，結(jié)果見圖4。

圖4 秀珍菇遺傳距離綜合分析聚類圖Fig.4 Cluster diagram of Pleurotus pulmonarius strains

由圖4可知，17株供試菌株遺傳相似系數(shù)在0.45～1.00。當(dāng)遺傳距離D為0.68時，P627和秀2各被聚為1個單一群體，其余菌株被聚為一個復(fù)合群體，這表明P627和秀2與其余供試菌株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，遺傳差異較大，除了P627和秀2外，其余供試菌株的親緣關(guān)系均較近；當(dāng)遺傳距離D為1.00時（D為1，表示很可能為同一菌株），P605和P625被聚為一個群體，P916、P624、57-0、GD三代被聚為一個群體，這表明菌株P(guān)605和P625可能分屬同一菌株，菌株P(guān)916和P624、57-0、GD三代可能分屬同一菌株。

3 討論與結(jié)論

傳統(tǒng)的分類學(xué)鑒定方法是指在微觀和宏觀的層面上對食用菌的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和外部形態(tài)進(jìn)行分類鑒定的方法[7]。其通過直觀觀察的方式在一定程度上能對食用菌類群進(jìn)行劃分，但由于食用菌的形態(tài)特征常因生境的不同而存在較大差異，且近緣物種間表觀特征相似，使得單純依靠傳統(tǒng)分類學(xué)鑒定方法鑒定食用菌存在局限性[8]。隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，真菌分類學(xué)家結(jié)合核酸分子生物學(xué)鑒定技術(shù)建立了更為有效的分類鑒定方法，即分子標(biāo)記。分子標(biāo)記能直接反映生物個體或種群間基因組的差異，因其不受材料的限制，且具有數(shù)量多、多態(tài)性高、準(zhǔn)確性可靠、不影響生物個體目標(biāo)性狀表達(dá)的特點，已被廣泛應(yīng)用于食用菌的分類鑒定中。

研究通過平板拮抗試驗及分子標(biāo)記技術(shù)對供試秀珍菇菌株進(jìn)行親緣關(guān)系分析，試驗結(jié)果表明：P627菌株和野生對照菌株秀2與其余15株供試菌株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而其余15株供試菌株之間的親緣關(guān)系均較近。在親緣關(guān)系較近的供試菌株中，P605和P625可能分屬同一菌株，P916和P624、57-0、GD三代可能分屬同一菌株。研究后續(xù)將會開展所有供試菌株的出菇試驗，通過供試菌株農(nóng)藝性狀的比較以進(jìn)一步確定各供試菌株的親緣關(guān)系。