劉 進(jìn)，許 謙**，賈世杰，李秉恩，丁紅振，孫宜秀，張慧敏，張 鑫，王瑩菲

（1.菏澤學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院，山東菏澤，274015；2.青島大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東青島，266071）

桑黃菌（Phellinus igniarius） 自古以來就被用作藥用真菌[1]。桑黃菌在生長初期表現(xiàn)為茶色，隨后顏色漸漸變深；在生長中期逐漸變成馬蹄形，往木質(zhì)發(fā)展，越來越堅(jiān)硬；到了生長末期，桑黃菌表面的皮質(zhì)硬殼就會(huì)從自身脫落，顏色與菌體本身的色彩相同，堅(jiān)硬，木質(zhì)，上端逐漸變尖[2]。桑黃的應(yīng)用歷史十分悠久，“桑黃”一詞最早出現(xiàn)在隋唐時(shí)期甄權(quán)的《藥性論》中[3]，藥理作用最初記載在秦漢時(shí)期的《神農(nóng)本草經(jīng)》中，從古至今被廣泛記錄，具有止血、排毒、活血的功效[4]，現(xiàn)代經(jīng)過大量科研工作者的努力，研究出桑黃有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗腫瘤等生物醫(yī)學(xué)方面的作用[5-8]。桑黃的活性成分有很多，其中最主要的活性成分是多糖、黃酮和三萜類物質(zhì)。多糖具有抗腫瘤、抗氧化等功效；黃酮具有降血脂血糖、抗衰老等功效；三萜具有抗菌、抗腫瘤等功效[2]。

桑黃在我國集中分布在黑龍江東部、西北地區(qū)陜西與甘肅交界的“子午嶺”自然保護(hù)區(qū)、東北的長白山林區(qū)等地，國外主要分布在日本、韓國、朝鮮、俄羅斯等地[9]。桑黃的野生資源十分匱乏，產(chǎn)量有限，不足以滿足龐大的市場需求，其最有效的解決方法是進(jìn)行人工栽培和菌絲體發(fā)酵。但桑黃人工栽培的難度較大[10-11]，且價(jià)格昂貴。然而菌絲體液體發(fā)酵技術(shù)卻具有技術(shù)要求低、周期短、污染少等優(yōu)點(diǎn)[12]，采用液體發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)桑黃具有較好的應(yīng)用前景。目前桑黃相關(guān)研究大多集中在培養(yǎng)以及其活性物質(zhì)的提取和作用功效方面，對(duì)桑黃擴(kuò)大培養(yǎng)過程中活性成分變化規(guī)律的研究較少，因此通過對(duì)桑黃擴(kuò)大培養(yǎng)過程中活性成分變化規(guī)律進(jìn)行研究，希望對(duì)桑黃的擴(kuò)大培養(yǎng)以及活性成分的規(guī)?；a(chǎn)提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

試驗(yàn)的供試菌株為桑黃菌種SH-001，由菏澤學(xué)院E208實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 試驗(yàn)試劑

主要試劑的信息見表1。

表1 主要試劑Tab.1 The main reagents

多糖的測定[12-13]：葡萄糖，蒽酮-硫酸試劑（200 mg蒽酮迅速溶于100 mL 98%濃硫酸中，當(dāng)天使用）。

黃酮的測定[14]：95%乙醇，98%蘆丁，無水AlCl3。

三萜的測定[15-16]：齊墩果酸對(duì)照品，香草醛溶液（在10 mL冰醋酸中加入0.5 g香草醛使其溶解，當(dāng)天使用），乙酸乙酯，高氯酸。

其余試劑為瓊脂粉、玉米粉、KH2PO4、MgSO4、馬鈴薯提取液、豆面。

1.1.3 試驗(yàn)儀器

XY-YT液體菌種培養(yǎng)器，濟(jì)南蕈源農(nóng)業(yè)機(jī)械有限公司；UV-6100可見光分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；MLS-3780高壓蒸汽滅菌鍋，三洋電機(jī)株式會(huì)社；ZQZY-C8震蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；HR/T20M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，湖南赫西儀器裝備有限公司；GL224I-1SCN電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京） 有限公司；YJVS-2雙人垂直超凈工作臺(tái)，無錫一凈凈化設(shè)備有限公司；BCD-268STCV冰箱，青島海爾股份有限公司；HH-W-420數(shù)顯恒溫水箱，金壇市江南儀器廠；電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊醫(yī)療生物儀器有限公司；MJ-250-1霉菌培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 桑黃菌種活化

1）PDA培養(yǎng)基的制備[17]：馬鈴薯去皮切塊，稱取200 g，煮沸30 min，8層紗布過濾取濾液，加入20 g瓊脂，攪拌至完全溶解，加入20 g葡萄糖混勻，溫水定容至1 000 mL，pH自然，趁熱分裝至錐形瓶，121℃滅菌30 min，倒平板。

2）菌種活化：把桑黃菌種轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)，每2天觀察記錄其生長形態(tài)。

1.2.2 液體培養(yǎng)

1） 液體培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基配方：玉米粉20 g·L-1、豆面10 g·L-1、KH2PO42.5 g·L-1、MgSO41 g·L-1，pH 自然。

液體培養(yǎng)基配制方法：玉米粉和豆面加適量蒸餾水煮沸30 min，加入KH2PO4和MgSO4，溶解后定容，pH自然。

2） 錐形瓶培養(yǎng)

處理1：250 mL錐形瓶中倒入150 mL液體培養(yǎng)基，8層紗布2層報(bào)紙封口，共25瓶，121℃滅菌30 min，冷卻備用。從活化桑黃菌種的固體培養(yǎng)基上，用打孔器取直徑1 cm圓形菌塊接種到液體培養(yǎng)基，每瓶接種2個(gè)菌塊，28℃、180 r·min-1搖床培養(yǎng)。

處理2：500 mL錐形瓶倒入300 mL液體培養(yǎng)基，8層紗布2層報(bào)紙封口，共45瓶，121℃滅菌30 min，冷卻備用。從活化桑黃菌種的固體培養(yǎng)基上，用打孔器取直徑1 cm圓形菌塊接種到液體培養(yǎng)基，每瓶接種4個(gè)菌塊，28℃、180 r·min-1搖床培養(yǎng)。

2個(gè)處理均每3天取樣觀察，測定并記錄其3種活性物質(zhì)的含量。

3） 發(fā)酵罐培養(yǎng)

發(fā)酵罐液體培養(yǎng)基：玉米粉20 g·L-1、豆面10 g·L-1，pH自然，接種量10%。

60 L發(fā)酵罐加35.8 L液體培養(yǎng)基，閉罐118℃高溫滅菌1 h后冷卻水循環(huán)冷卻，取500 mL錐形瓶培養(yǎng)14 d的桑黃菌絲體14瓶，在無菌操作下倒入發(fā)酵罐中，溫度設(shè)定為23℃，罐內(nèi)氣壓為0.03 MPa～0.05 MPa，培養(yǎng)7 d，觀察記錄。

1.2.3 分離菌絲體

培養(yǎng)桑黃菌絲體的250 mL和500 mL錐形瓶各取3瓶，發(fā)酵罐取菌絲體時(shí)要嚴(yán)格按照操作規(guī)范進(jìn)行無菌操作。各取20 mL培養(yǎng)液通過8層紗布過濾得到菌絲體和發(fā)酵液。發(fā)酵液放冰箱冷藏，用作胞外活性物質(zhì)的測量，菌絲體用蒸餾水清洗3次，在60℃干燥箱中干燥至恒重，備用。

1.2.4 多糖含量測定

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制[13]：根據(jù)參考文獻(xiàn)[13]的方法測定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

胞外多糖測定：取5 mL菌液10 000 r·min-1離心10 min，取1 mL上清液，加入3倍95%乙醇，振蕩，4℃過夜，3 500 r·min-1離心15 min，收集沉淀，得到桑黃粗多糖。取桑黃粗多糖溶于10 mL熱水，稀釋10倍，取0.5 mL于試管中，加入蒽酮-硫酸試劑2 mL，立即搖勻，100℃水浴中顯色10 min，取出，冰浴至室溫，于波長620 nm處測定其吸光度值。

胞內(nèi)多糖測定：取0.2 g桑黃干粉加水，料液比為 1 ∶45，100℃浸提 3.5 h，3 500 r·min-1離心 10 min，取上清液，加3倍95%乙醇，后續(xù)步驟與胞外多糖的測定方法相同。

1.2.5 黃酮含量測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制、胞外和胞內(nèi)黃酮含量的測量均按照參考文獻(xiàn)[15]進(jìn)行操作。

1.2.6 三萜含量測定

齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制、胞內(nèi)三萜含量的測量均按照參考文獻(xiàn)[16]進(jìn)行操作。

胞外三萜的測定：取1 mL桑黃培養(yǎng)液過濾液，加入95%乙醇3 mL，靜置24 h，去沉淀，取上清液1 mL，100℃蒸餾去除乙醇，加入0.4 mL香草醛，1.6 mL高氯酸，70℃水浴15 min，加入4 mL乙酸乙酯搖勻，靜置15 min，于波長551 nm處測定吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑黃菌絲體液體發(fā)酵

2.1.1 固體培養(yǎng)基菌種活化

PDA固體培養(yǎng)基上桑黃菌種活化過程中的菌絲體形態(tài)變化見圖1。

圖1 固體培養(yǎng)基上桑黃形態(tài)的變化Fig.1 Morphological changes of Phellinus igniarius on solid medium

在PDA固體培養(yǎng)基上桑黃菌種活化過程的生長情況詳見表2。

表2 桑黃菌種活化過程生長情況記錄Tab.2 Growth record of Phellinus igniarius during activation

2.1.2 錐形瓶液體培養(yǎng)

在300 mL液體培養(yǎng)基（處理2） 中桑黃的生長形態(tài)變化見圖2。

圖2 錐形瓶液體培養(yǎng)基中桑黃形態(tài)的變化Fig.2 Morphological changes of Phellinus igniarius in liquid medium of conical flask

桑黃在錐形瓶液體培養(yǎng)過程中，取20 mL培養(yǎng)液測定菌絲干重，其測定結(jié)果及生長情況記錄詳見表3。

表3 桑黃菌種錐形瓶液體培養(yǎng)過程生長情況記錄Tab.3 Growth record of Phellinus igniarius strain in liquid medium of conical flask

由表3可知，處理1與處理2培養(yǎng)的桑黃菌絲體干重基本相同，第6天～第9天菌絲體干重翻倍增加，之后穩(wěn)步增加。但2個(gè)處理中菌絲體生長情況稍有不同，第12天時(shí)處理1的桑黃菌絲體呈球狀，處理2的桑黃菌絲體呈放射狀。

2.1.3 發(fā)酵罐液體培養(yǎng)

發(fā)酵罐液體培養(yǎng)桑黃的形態(tài)變化詳見圖3。

圖3 發(fā)酵罐液體培養(yǎng)基中桑黃形態(tài)的變化Fig.3 Morphological changes of Phellinus igniarius in liquid medium of fermenter

發(fā)酵罐液體培養(yǎng)桑黃過程中取20 mL培養(yǎng)液測定菌絲干重，其測定結(jié)果及生長情況記錄詳見表4。

表4 桑黃菌種發(fā)酵罐液體培養(yǎng)過程生長情況記錄表Tab.4 Growth record of Phellinus igniarius in liquid medium of fermenter

由表4可知，60 L發(fā)酵罐培養(yǎng)的桑黃菌絲體干重在第4天達(dá)到最大，第6天不變，第7天時(shí)減少0.01 g。證明在60 L發(fā)酵罐培養(yǎng)時(shí)，菌絲體最好的收獲時(shí)間為4 d～6 d。

2.2 桑黃液體培養(yǎng)過程中的活性成分

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

1）多糖測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線

在波長620 nm處測定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖4。

圖4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of glucose

如圖4所示，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為：

該回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2為0.999 8。

2）黃酮測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過AlCl3比色法在波長410 nm處測蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖5。

圖5 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve of rutin

如圖5所示，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為：

該回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2為0.999 8。

3）三萜測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線

在波長551 nm處測定齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖6。

圖6 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of oleanolic acid

如圖6所示，齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為：

該回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2為0.999 7。

2.2.2 桑黃活性成分變化趨勢

1） 多糖變化趨勢

錐形瓶液體培養(yǎng)桑黃的胞外多糖含量變化趨勢見圖7。

圖7 錐形瓶培養(yǎng)桑黃菌絲體的胞外多糖Fig.7 The extracellular polysaccharide from mycelium of Phellinus igniarius in conical flask

由圖7可知，錐形瓶培養(yǎng)的桑黃菌絲體胞外多糖含量的變化趨勢總體下降，2個(gè)培養(yǎng)規(guī)格均在第6天時(shí)菌絲體胞外多糖的含量最高，在第12天后快速降低。

錐形瓶液體培養(yǎng)桑黃的胞內(nèi)多糖含量變化趨勢見圖8。

圖8 錐形瓶培養(yǎng)桑黃菌絲體的胞內(nèi)多糖Fig.8 The Intracellular polysaccharide from mycelium of Phellinus igniarius in conical flask

由圖8可知，胞內(nèi)多糖含量變化呈波浪形。處理1的桑黃菌絲體胞內(nèi)多糖在第9天時(shí)含量最高，處理2的桑黃菌絲體胞內(nèi)多糖在第6天含量最高，處理1比處理2的胞內(nèi)多糖含量峰值延遲3 d出現(xiàn)。二者相比，處理2的培養(yǎng)條件更利于胞內(nèi)多糖迅速產(chǎn)生。

發(fā)酵罐液體培養(yǎng)桑黃菌絲體的胞外多糖含量變化趨勢見圖9。

圖9 發(fā)酵罐培養(yǎng)桑黃菌絲體的胞外多糖Fig.9 The extracellular polysaccharide from mycelium of Phellinus igniarius in fermenter

由圖9可知，發(fā)酵罐培養(yǎng)的桑黃菌絲體胞外多糖含量先減少后增加，在第7天時(shí)最高。

發(fā)酵罐液體培養(yǎng)桑黃菌絲體的胞外多糖含量變化趨勢見圖10。

圖10 發(fā)酵罐培養(yǎng)桑黃菌絲體的胞內(nèi)多糖Fig.10 The Intracellular polysaccharide from mycelium of Phellinus igniarius in fermenter

由圖10可知，發(fā)酵罐培養(yǎng)的桑黃菌絲體胞內(nèi)多糖波動(dòng)變化，含量先增加后減少再增加，在第7天達(dá)到峰值。

2） 黃酮變化趨勢

錐形瓶液體培養(yǎng)桑黃菌絲體的胞外黃酮含量變化趨勢見圖11。

圖11 錐形瓶培養(yǎng)桑黃菌絲體的胞外黃酮Fig.11 The extracellular flavonoids from mycelium of Phellinus igniarius in conical flask

由圖11可知，相同培養(yǎng)時(shí)間下，處理1培養(yǎng)的桑黃菌絲體胞外黃酮含量均高于處理2，且都呈先高后低的趨勢。處理1胞外黃酮含量在第12天時(shí)最高，處理2第9天含量最高，處理1峰值出現(xiàn)時(shí)間比處理2延遲3 d。

錐形瓶液體培養(yǎng)桑黃菌絲體的胞內(nèi)黃酮含量變化趨勢見圖12。

圖12 錐形瓶培養(yǎng)桑黃菌絲體的胞內(nèi)黃酮Fig.12 The Intracellular flavonoids from mycelium of Phellinus igniarius in conical flask

由圖12可知，除第9天以外，其他相同的培養(yǎng)時(shí)間下，處理1培養(yǎng)的桑黃菌絲體胞內(nèi)黃酮含量都高于處理2，且都呈先高后低的趨勢，并均于第12天達(dá)到峰值。

發(fā)酵罐液體培養(yǎng)桑黃菌絲體的胞外黃酮含量變化趨勢見圖13。

圖13 發(fā)酵罐培養(yǎng)桑黃菌絲體的胞外黃酮Fig.13 The extracellular flavonoids from mycelium of Phellinus igniarius in fermenter

由圖13可知，60 L發(fā)酵罐培養(yǎng)的桑黃菌絲體胞外黃酮含量先增加后減少再增加，第7天胞外黃酮的含量最高。

發(fā)酵罐液體培養(yǎng)桑黃菌絲體的胞內(nèi)黃酮含量變化趨勢見圖14。

圖14 發(fā)酵罐培養(yǎng)桑黃菌絲體的胞內(nèi)黃酮Fig.14 The Intracellular flavonoids from mycelium of Phellinus igniarius in fermenter

由圖14可知，60 L發(fā)酵罐培養(yǎng)的桑黃菌絲體胞內(nèi)黃酮的含量先增加后降低，第6天胞內(nèi)黃酮含量最高。

3） 三萜變化趨勢

錐形瓶液體培養(yǎng)桑黃菌絲體的胞外三萜含量變化趨勢見圖15。

圖15 錐形瓶培養(yǎng)桑黃菌絲體的胞外三萜Fig.15 The extracellular triterpenes from mycelium of Phellinus igniarius in conical flask

由圖15可知，相同的培養(yǎng)時(shí)間下，處理2的桑黃菌絲體胞外三萜含量均大于處理1。處理1中胞外三萜含量先減少后增加又減少，第15天含量最高；處理2中胞外三萜含量先減少后增加，第18天含量最高。

錐形瓶液體培養(yǎng)桑黃菌絲體的胞內(nèi)三萜含量變化趨勢見圖16。

圖16 錐形瓶培養(yǎng)桑黃菌絲體的胞內(nèi)三萜Fig.16 The Intracellular triterpenes from mycelium of Phellinus igniarius in conical flask

由圖16可知，相同的培養(yǎng)時(shí)間下，處理2的桑黃菌絲體胞內(nèi)三萜含量基本大于處理1。處理1中胞內(nèi)三萜的含量先增加后減少再增加又減少，第15天含量最高；處理2中胞內(nèi)三萜含量先增加后減少再增加，第9天含量最高。

發(fā)酵罐液體培養(yǎng)桑黃菌絲體的胞外三萜含量變化趨勢見圖17。

圖17 發(fā)酵罐培養(yǎng)桑黃菌絲體的胞外三萜Fig.17 The extracellular triterpenes from mycelium of Phellinus igniarius in fermenter

由圖17可知，60 L發(fā)酵罐培養(yǎng)的桑黃菌絲體胞外三萜含量先減少后增加，在第7天含量最高。

發(fā)酵罐液體培養(yǎng)桑黃菌絲體的胞內(nèi)三萜含量變化趨勢見圖18。

圖18 發(fā)酵罐培養(yǎng)桑黃菌絲體的胞內(nèi)三萜Fig.18 The intracellular triterpenes from mycelium of Phellinus igniarius in fermenter

由圖18可知，60 L發(fā)酵罐培養(yǎng)的桑黃菌絲體胞內(nèi)三萜含量持續(xù)減少，在第2天含量最高。

3 討論與結(jié)論

桑黃菌絲體在2種規(guī)格錐形瓶液體培養(yǎng)基和發(fā)酵罐的擴(kuò)大培養(yǎng)過程中，3種活性物質(zhì)的含量分別表現(xiàn)出不同的變化趨勢。

在150 mL和300 mL液體培養(yǎng)基中胞外多糖都呈下降趨勢；150 mL液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的桑黃菌絲體胞內(nèi)多糖峰值出現(xiàn)時(shí)間比300 mL液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的延遲3 d，說明300 mL液體培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下更利于胞內(nèi)多糖的迅速產(chǎn)生。60 L發(fā)酵罐培養(yǎng)的桑黃胞外多糖呈上升趨勢，而單位胞外胞內(nèi)多糖的峰值產(chǎn)量低于錐形瓶培養(yǎng)胞內(nèi)胞外多糖的峰值產(chǎn)量。

在150 mL和300 mL液體培養(yǎng)基中桑黃菌絲體胞外、胞內(nèi)黃酮都呈先高后低的趨勢。150 mL液體培養(yǎng)基中單位黃酮產(chǎn)量高于300 mL液體培養(yǎng)基中單位黃酮產(chǎn)量，二者相比，150 mL液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件更利于胞外、胞內(nèi)黃酮的高產(chǎn)。60 L發(fā)酵罐培養(yǎng)的桑黃菌絲體胞外、胞內(nèi)黃酮都呈現(xiàn)先增長態(tài)勢，胞外黃酮第7天達(dá)到峰值，胞內(nèi)黃酮第6天達(dá)到峰值。發(fā)酵罐培養(yǎng)中單位胞外、胞內(nèi)黃酮的峰值產(chǎn)量均低于錐形瓶培養(yǎng)中的峰值產(chǎn)量。

在150 mL和300 mL液體培養(yǎng)基中桑黃菌絲體胞外、胞內(nèi)三萜都有相似的變化規(guī)律。其中，150 mL液體培養(yǎng)基中胞內(nèi)、胞外三萜含量都在第15天達(dá)到峰值。300 mL液體培養(yǎng)基中單位三萜產(chǎn)量高于150 mL液體培養(yǎng)基，二者相比，300 mL液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件更利于胞外、胞內(nèi)三萜的生產(chǎn)。60 L發(fā)酵罐中單位胞外三萜的峰值產(chǎn)量高于錐形瓶胞外三萜的峰值產(chǎn)量，單位胞內(nèi)三萜的峰值產(chǎn)量接近錐形瓶胞內(nèi)三萜的峰值產(chǎn)量，說明胞外三萜更適合在大容量培養(yǎng)條件下獲得。

通過比較2種規(guī)格錐形瓶桑黃菌絲體生長的情況，可以捕捉桑黃在擴(kuò)大培養(yǎng)過程中菌絲球的變化特征及活性物質(zhì)的變化規(guī)律，為規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)提供參考依據(jù)。同時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果說明，如果進(jìn)行桑黃菌絲體多糖及黃酮的規(guī)模化生產(chǎn)，培養(yǎng)條件還需要進(jìn)一步優(yōu)化。如果進(jìn)行桑黃三萜的規(guī)?；囵B(yǎng)，目前培養(yǎng)條件基本能夠達(dá)到量化生產(chǎn)需求。這為確定桑黃規(guī)?；囵B(yǎng)條件、適時(shí)收獲桑黃菌絲體及其多糖、黃酮、三萜等活性物質(zhì)具有重要的指導(dǎo)意義。