邱田美，王洪濤，于亞寧，徐麗麗，陸秀華

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省應(yīng)用真菌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266109）

美味扇菇（Panellus edulis） 隸屬于擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina） 層菌綱 （Hymenomycetes） 傘菌目（Agaricales） 側(cè)耳科 （Pleurotaceae） 扇菇屬 （Panellus）[1]，又名亞側(cè)耳、元蘑、冬蘑、黃蘑、凍蘑，廣泛分布于中國東北、日本北部、美國和俄羅斯遠(yuǎn)東等地區(qū)[2-3]。美味扇菇肉質(zhì)嫩滑，味道鮮美，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值和很好的保健功能[4]，如防止動(dòng)脈硬化、提高免疫力、抑制腫瘤增殖[5-6]。美味扇菇中還含有較高的麥角硫因，具有多種抗氧化和細(xì)胞保護(hù)作用[7]，能夠保護(hù)機(jī)體抵御氧化性壓力帶來的損傷，可降低神經(jīng)變性疾病的發(fā)生率[8]，是一種可以藥食兼用的菌類。由于美味扇菇菌絲體生長緩慢，限制了其工廠化栽培生產(chǎn)以及在食品等其他方面的應(yīng)用。

以野生美味扇菇為試驗(yàn)對象，優(yōu)化其菌絲體生長條件，旨在獲得生長速度快、菌絲潔白、稠密的菌絲體，為美味扇菇的工廠化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

野生美味扇菇1509菌株，青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g、葡萄糖20.0 g、蛋白胨 2.0 g、KH2PO41.0 g、MgSO40.5 g、CaCl20.5 g、VB110 mg、瓊脂20.0 g，pH自然，蒸餾水定容至1 000 mL[9]。

1.1.3 主要儀器

SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；LDZF-75L立式高壓蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器材廠；DPX-9052B-1電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；L-890003030901氨基酸分析儀，株式會(huì)社日立制作所；542403061701離心機(jī)，德國艾本德股份公司；OCEDB-02五段金屬浴，天根生化科技有限公司；QuantStudio503030973熒光定量PCR儀，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；打孔器、電子天平等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

試驗(yàn)菌株參照《大型真菌圖鑒》[10]，根據(jù)子實(shí)體的形狀、大小、顏色等宏觀特征進(jìn)行初步鑒定，再根據(jù)菌絲等微觀特征，進(jìn)行傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定。

1.2.2 分子鑒定

采用Omega真菌DNA抽提試劑盒提取DNA，采用引物 ITS1（5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG3’）和 ITS4（5’TCCTCCGCTTATTGATATGC3’） 進(jìn) 行PCR擴(kuò)增[11]，得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳觀察到有明亮條帶后送公司測序。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

在無菌條件下活化菌株，轉(zhuǎn)入不同碳源、氮源和無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，25℃黑暗條件下培養(yǎng)，采用十字交叉法測量菌落直徑，計(jì)算平均生長速率[12]。

碳源篩選以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為主，碳氮比30∶1為基礎(chǔ)，碳源分別為葡萄糖20.0 g·L-1、甘露糖20.0 g·L-1、果糖 20.0 g·L-1、麥芽糖 13.4 g·L-1、蔗糖 13.4 g·L-1、乳糖13.4 g·L-1、可溶性淀粉18 g·L-1和空白對照8個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

氮源篩選以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為主，氮源分別為蛋白胨 2.0 g·L-1、酵母粉 2.7 g·L-1、尿素 5.8 g·L-1、硝酸銨7.6 g·L-1和空白對照5個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

無機(jī)鹽篩選以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為主，分別設(shè)空白對照，MgSO4、KH2PO4、CaCl2各 1.0 g·L-1和 3 種無機(jī)鹽共添加1.0 g·L-1共5個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.4 正交試驗(yàn)

考慮到碳源、氮源和無機(jī)鹽之間的交互作用對菌絲體生長的影響，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以篩選出最優(yōu)的碳源、氮源和無機(jī)鹽做三因素三水平正交試驗(yàn)，以菌絲平均生長速率為標(biāo)準(zhǔn)，從而篩選出三者之間的最佳因素水平搭配。

1.3 菌株1509子實(shí)體中營養(yǎng)成分測定

1.3.1 粗多糖含量的測定

按照參考文獻(xiàn)[13]中苯酚-硫酸法測定多糖含量，按照DB37/T 3122-2018槐花多糖提取工藝及其生物活性評價(jià)技術(shù)規(guī)程[14]繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出多糖含量。

1.3.2 粗蛋白含量的測定

子實(shí)體粗蛋白含量測定采用考馬斯亮藍(lán)法[15]，A045-2蛋白定量測試盒購于南京建成生物工程研究所。按說明書步驟檢測并計(jì)算子實(shí)體中粗蛋白含量。

1.3.3 鈣、鐵、VC、VE含量的測定

為測定菌株1509子實(shí)體中鈣、鐵、VC、VE的含量，參考GB 5009.90-2016食品中鐵的測定[16]測定1509子實(shí)體中鐵含量；參考GB 5009.92-2016食品中鈣的測定[17]測定子實(shí)體中鈣的含量；參考GB 5009.86-2016食品中抗壞血酸的測定[18]測定子實(shí)體VC含量，參考GB 1886.233-2016食品添加劑維生素E[19]測定子實(shí)體VE含量。

1.3.4 氨基酸含量分析

采用日立8900高速氨基酸分析儀，參考GB 5009.124-2016食品中氨基酸的測定[20]標(biāo)準(zhǔn)分析測定菌株1509子實(shí)體中的氨基酸成分。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生菌株1509形態(tài)及其菌絲體ITS測序分析

2.1.1 野生菌株1509形態(tài)

野生菌株1509的形態(tài)特征見圖1。

圖1 1509野生菌株Fig.1 Wild strain of 1509

如圖1所示，1509野生菌株菌蓋直徑在10 cm左右，呈半圓形，菌蓋為黃褐色，且有黏液，有短細(xì)絨毛。菌蓋邊緣內(nèi)卷，菌肉較厚，顏色為淡黃色。菌柄較短。

2.1.2 1509菌絲體ITS測序分析

菌株1509菌絲體的ITS序列擴(kuò)增電泳圖見圖2。

圖2 野生菌株ITS序列擴(kuò)增電泳圖Fig.2 ITS sequence amplification electrophoresis of wild strains

由圖2可知，野生菌株1509通過ITS1和ITS4引物擴(kuò)增后的堿基數(shù)約為750 bp。通過NCBI中的BLAST進(jìn)行測序比對發(fā)現(xiàn)，菌株1509與美味扇菇有98.98%的相似性。

2.2 培養(yǎng)基篩選結(jié)果

2.2.1 單因素篩選結(jié)果

扇菇菌株1509在7種不同碳源培養(yǎng)15 d后，菌絲生長速率見圖3。

圖3 菌株1509在不同碳源下的菌絲平均生長速率Fig.3 The average growth rate of mycelium of strain 1509 under different carbon sources

由圖3所示，可以看出在不同碳源條件下，菌絲生長速率有所差異。扇菇菌株1509以果糖為碳源時(shí)，菌絲稠密、潔白，菌絲邊緣生長整齊；以葡萄糖為碳源時(shí)菌絲生長速率較快。因此菌株1509最適碳源為果糖，其次為葡萄糖。

扇菇菌株1509在4種不同氮源中培養(yǎng)15 d后，菌絲的生長速率統(tǒng)計(jì)見圖4。

圖4 菌株1509在不同氮源下的菌絲平均生長速率Fig.4 The average growth rate of mycelium of strain 1509 under different nitrogen sources

由圖4可知，在不同氮源條件下，菌株1509菌絲生長速率有所差異。扇菇菌株1509在以蛋白胨為氮源時(shí)，菌絲稠密、潔白，菌絲邊緣生長整齊；以硝酸銨為氮源時(shí)生長速率較快，菌絲潔白；尿素最不適宜培養(yǎng)菌株1509。因此菌株1509的最適氮源為蛋白胨。

扇菇菌株1509在3種不同無機(jī)鹽中培養(yǎng)15 d后，菌絲的生長速率統(tǒng)計(jì)見圖5。

圖5 1509不同無機(jī)鹽下菌絲平均生長速率Fig.5 The average growth rate of mycelium of strain 1509 under different inorganic salts

由圖5可知，在不同無機(jī)鹽條件下，菌株1509菌絲生長速率有所差異。菌株1509在以硫酸鎂為無機(jī)鹽時(shí)，菌絲稠密、菌絲邊緣生長相對整齊。綜上所述菌株1509最適無機(jī)鹽為硫酸鎂。

2.2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

以篩選出最優(yōu)的碳源、氮源和無機(jī)鹽設(shè)計(jì)三因素三水平正交試驗(yàn)，因素水平搭配見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Tab.1 Orthogonal test factors and level

扇菇菌株1509的培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 美味扇菇培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Optimize the orthogonal test results of Panellus edulis culture medium

由表2可知，美味扇菇1509菌絲體各因素最佳水平有所差異，最佳配比為A2B2C3，即果糖20 g·L-1，蛋白胨 2 g·L-1，MgSO40.75 g·L-1。此時(shí)菌絲生長最快，菌絲稠密、潔白，菌絲邊緣生長相對整齊。根據(jù)碳氮比計(jì)算公式[21]，計(jì)算得碳氮比為31.57。極差分析表明，影響扇菇菌株1509菌絲生長速率的因素排序?yàn)锳>C>B，即果糖>MgSO4>蛋白胨。

2.3 栽培出菇

根據(jù)培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果，配置最優(yōu)培養(yǎng)基用于培養(yǎng)1509菌絲，按標(biāo)準(zhǔn)制作野生扇菇菌株1509的菌種和菌包，在溫度條件為15℃～20℃，空氣相對濕度為85～90%的大棚中栽培出菇，其子實(shí)體形態(tài)見圖6。

圖6 實(shí)驗(yàn)室人工栽培出菇圖Fig.6 Results of artificial cultivation mushrooms in the laboratory

由圖6可知，菌株1509菌蓋形狀為半圓形、腎形和扇形，菌蓋直徑為5 cm～10 cm。菌蓋黃褐色，表面有絨毛，菌肉為淡黃色，厚而致密，菌褶為淡黃色，衍生，稍密。菌柄較短，內(nèi)部為實(shí)心。經(jīng)過馴化后的扇菇菌株1509出菇形態(tài)與野生扇菇形態(tài)一致。

2.4 菌株1509子實(shí)體營養(yǎng)成分分析結(jié)果

扇菇菌株1509子實(shí)體的營養(yǎng)成分含量及對照肺形側(cè)耳5271營養(yǎng)成分含量[22]統(tǒng)計(jì)見表3。

表3 菌株1509和5271子實(shí)體的營養(yǎng)成分含量的比較Tab.3 Comparison of nutrients content for strains 1509 and 5271 fruit bodies

由表3可知，1509菌株中鈣含量達(dá)到133.96 mg·100-1g-1，是大部分牛奶含鈣量的1.1倍～1.5倍，粗蛋白質(zhì)含量32.91 mg·100-1g-1，VE含量可達(dá)16.72 mg·100-1g-1，遠(yuǎn)超肺形側(cè)耳子實(shí)體中的含量。而多糖含量較低，是真正的高蛋白高鈣食品。

2.5 1509氨基酸成分分析

選用L-890003030901氨基酸分析儀，采用鹽酸水解法[23]測得了栽培出菇的扇菇1509子實(shí)體中的17種氨基含量，見表4。

表4 1509氨基酸成分含量Tab.4 1509 amino acid components content

由表4可知，扇菇1509菌株谷氨酸含量高達(dá)1.15%。谷氨酸為呈味氨基酸，因此可使美味扇菇1509味道更加鮮美，并且谷氨酸作為腸上皮細(xì)胞能源物質(zhì)、生物活性前體物質(zhì)和神經(jīng)遞質(zhì)，對腸道健康和功能的發(fā)揮具有重要的作用[24]。亮氨酸含量僅次于谷氨酸和天門冬氨酸，亮氨酸能夠改善由高脂高膽固醇膳食引起的肥胖和能量代謝紊亂[25]。氨基酸總量（TAA） 為8.17%，其中EAA含量為3.24%，NEAA含量為4.93%，根據(jù)1973年世界衛(wèi)生組織和聯(lián)合國糧農(nóng)組織發(fā)布的蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值必需氨基酸模式理論，EAA/TAA含量在40%左右，EAA/NEAA含量在60%以上，此時(shí)認(rèn)為該蛋白質(zhì)為理想蛋白質(zhì)[26]，更利于人體吸收。美味扇菇1509中EAA/TAA含量為39.65%，EAA/NEAA含量為65.72%，均符合世界衛(wèi)生組織和聯(lián)合國糧農(nóng)組織提出的理想蛋白均衡值[27]。

3 討論與結(jié)論

試驗(yàn)通過對野生菌株1509進(jìn)行鑒定和對其菌絲體生長條件優(yōu)化。經(jīng)鑒定，野生菌株1509為美味扇菇。單因素篩選其最適碳源為果糖，平均生長速率均高于其他試驗(yàn)組，并且果糖培養(yǎng)條件下菌絲潔白、稠密；最適氮源為蛋白胨，最適無機(jī)鹽為MgSO4。進(jìn)一步正交試驗(yàn)表明美味扇菇1509最適固體培養(yǎng)基配方為：果糖 20 g·L-1、蛋白胨 2 g·L-1、MgSO40.75 g·L-1、CaCl20.5 g·L-1、KH2PO41 g·L-1、VB110 mg·L-1、瓊脂20 g·L-1。人工培養(yǎng)獲得了美味扇菇1509的新鮮子實(shí)體，并測定了美味扇菇1509子實(shí)體的常規(guī)營養(yǎng)成分和氨基酸含量，可知其營養(yǎng)價(jià)值較高，風(fēng)味佳，粗蛋白和鈣含量尤其突出。美味扇菇1509中維生素E含量比常見的肺形側(cè)耳要高，可滿足每人每日所需VE。氨基酸比例均衡，EAA/TAA和EAA/NEAA含量均達(dá)到了人體吸收的理想蛋白均衡值。