李昕霖

（福建省食用菌技術(shù)推廣總站，福建 福州 350003）

香菇（Lentinus edodes），別名香蕈、香菌、冬菇等，屬擔(dān)子菌綱（Basidiomycotina） 傘菌目（A－garicales） 口蘑科 （Tricholomataceae） 香菇屬（Lentinus），是一種高蛋白、低脂肪的營(yíng)養(yǎng)保健食品，其香氣特殊，味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，且具有抗病毒、抗腫瘤、抗癌癥、調(diào)節(jié)免疫、降血脂等多種功能，被譽(yù)為“山珍之王”[1-4]。香菇是世界上發(fā)展最快的菇類，我國(guó)又是全球主要的香菇生產(chǎn)國(guó)、消費(fèi)國(guó)和出口國(guó)，市場(chǎng)潛力巨大[5]。而傳統(tǒng)的“一家一戶”粗放式栽培模式在氣候要求、生長(zhǎng)周期、生產(chǎn)成本、勞動(dòng)強(qiáng)度等方面存在諸多弊端[6-7]，已無(wú)法滿足產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的需求，工廠化則具有實(shí)現(xiàn)周年生產(chǎn)、機(jī)械化程度高、生產(chǎn)成本較低等優(yōu)勢(shì)，順應(yīng)了現(xiàn)代食用菌發(fā)展的趨勢(shì)。因此，培育適合工廠化栽培的香菇品種，可促進(jìn)香菇工廠化的發(fā)展。

香菇屬于四極性異宗結(jié)合的食用菌[8]，通過(guò)品種間雜交很容易產(chǎn)生有結(jié)實(shí)能力的雙核菌絲[9]。雜交育種的主要方法有單孢雜交、雙單雜交和多孢雜交[10]，目前單孢雜交育種是香菇育種中最常用的手段之一[11-13]，多孢雜交方法操作簡(jiǎn)單，也可篩選出比親本更加優(yōu)良的品種[14]。香菇雜交菌株常用的鑒定技術(shù)為形態(tài)學(xué)鑒定、拮抗以及簡(jiǎn)單重復(fù)序列間擴(kuò)增（ISSR）、簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（SRAP）等[15]，通常采用拮抗與DNA指紋圖譜相結(jié)合鑒定品種[16]。為了選育適合工廠化栽培的香菇新品種，試驗(yàn)采用多孢雜交技術(shù)，并結(jié)合拮抗試驗(yàn)和ISSR、SRAP分子技術(shù)進(jìn)行雜交子的特異性鑒定。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

親本菌株：香菇101由福建省三明市尤溪縣洋中鎮(zhèn)香菇菇農(nóng)提供，香菇L18和L19由福建省龍巖市永定區(qū)農(nóng)業(yè)局提供，為當(dāng)?shù)氐闹髟云贩N，香菇SK11由福建省福州市羅源縣起步鎮(zhèn)香菇菇農(nóng)提供，為工廠化栽培品種。

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯250 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，水1 000 mL，pH自然。液體培養(yǎng)基：玉米粉15 g、黃豆粉10 g、葡萄糖10 g、VB110 mg、VB210 mg，水2 000 mL。栽培培養(yǎng)基：粗木屑30%、細(xì)木屑25%、玉米芯30%、麩皮15%、石膏1%，含水量62%，pH自然。

1.3 孢子收集

取香菇101、L18、L19和SK11成熟的子實(shí)體各3朵，切除菌柄，將菌蓋朝下置于滅菌后的平皿中，于超凈工作臺(tái)過(guò)夜收集孢子印，孢子印放4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 多孢雜交

用無(wú)菌環(huán)刮取孢子印5環(huán)至5 mL無(wú)菌水，混勻后備用。取不同菌株的孢子懸浮液各100 μL混合后涂布于PDA平板進(jìn)行兩兩菌株的多孢雜交，其中SK11是一株適合工廠栽培的菌株，因此進(jìn)行了多孢自交，以期獲得產(chǎn)量更高的雜交菌株；菌株接種各重復(fù)5皿，25℃恒溫培養(yǎng)10 d～15 d，移取一小塊菌落至新鮮的PDA平板進(jìn)行純化，并用顯微觀察鎖狀聯(lián)合，有鎖狀聯(lián)合的菌株即為雜交子。

1.5 出菇試驗(yàn)

配制液體培養(yǎng)基，取600 mL裝入1 000 mL三角瓶中，經(jīng)高壓滅菌后備用。獲得的雜交子制作試管菌種，從試管種中移取5小塊接入液體培養(yǎng)基，25℃，160 r·min-1振蕩培養(yǎng)7 d。采用 18 cm×35 cm×0.05 cm的聚丙烯塑料袋，使用窩口打包機(jī)裝料，每袋裝料濕重約1 100 g，每袋接種量約為20 mL，置于23℃～25℃菇房培養(yǎng)，待菌絲生理成熟后，轉(zhuǎn)移至出菇房，出菇管理的主要參數(shù)為12℃～15℃、相對(duì)濕度80%～95%、二氧化碳濃度＜0.1%，光照強(qiáng)度200 lx。記錄子實(shí)體采收日期、出菇周期、產(chǎn)量、菌蓋直徑、厚度、菌柄直徑及長(zhǎng)度等數(shù)據(jù)。

1.6 品種特異性試驗(yàn)

1.6.1 拮抗試驗(yàn)

按無(wú)菌操作要求，用直徑8 mm的打孔器在菌落邊緣挖取菌種塊，交叉接種到9 cm的PDA培養(yǎng)基平板上[17]，兩菌種間約1 cm。25℃培養(yǎng)，當(dāng)試驗(yàn)品種的菌落接觸后繼續(xù)培養(yǎng)5 d～7 d，觀察菌落生長(zhǎng)和拮抗情況。

1.6.2 DNA提取

按參考文獻(xiàn)[18]中的CTAB法提取菌株DNA。

1.6.3 ISSR分子鑒定

ISSR-PCR擴(kuò)增條件和擴(kuò)增體系參照參考文獻(xiàn)[19]，所選用的引物見(jiàn)表1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 ISSR引物Tab.1 ISSR primers

1.6.4 SRAP分子鑒定

SRAP-PCR前引物Me和后引物Em相互組合成16對(duì)引物，擴(kuò)增條件和擴(kuò)增體系參照參考文獻(xiàn)[20]，引物統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 SRAP引物Tab.2 SRAP primers

2 結(jié)果與分析

2.1 多孢雜交子獲得及初篩

以福建省農(nóng)作物品種審定委員會(huì)認(rèn)定的香菇新品種農(nóng)香2號(hào)作為對(duì)照菌株，香菇菌株雜交子的篩選結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 雜交子篩選結(jié)果Tab.3 Hybridization and screening results

由表3可知，以 101×L18、101×L19、101×SK11和SK11×SK11共4個(gè)組合進(jìn)行多孢雜交或多孢自交，挑起萌發(fā)的菌落269個(gè)，經(jīng)鏡檢含有鎖狀聯(lián)合的數(shù)量為223個(gè)，即多孢雜交子，編號(hào)為L(zhǎng)e0001～Le0223。對(duì)獲得的雜交子進(jìn)行出菇試驗(yàn)，有97個(gè)可以正常出菇，正常出菇比例為43.5%，余下雜交子不出菇或子實(shí)體不正常。97個(gè)雜交子中16個(gè)產(chǎn)量高于對(duì)照菌株。

2.2 雜交菌株的復(fù)篩試驗(yàn)

將初篩獲得的16株產(chǎn)量高于對(duì)照菌株的雜交子進(jìn)行出菇復(fù)篩，以4個(gè)親本和已認(rèn)定的品種農(nóng)香2號(hào)作對(duì)比，記錄滿袋時(shí)間，統(tǒng)計(jì)第一潮鮮菇產(chǎn)量、子實(shí)體的含水量等，結(jié)果統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表4。

表4 雜交菌株出菇試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 fruiting test of hybrid strains

由表4試驗(yàn)結(jié)果可知，雜交菌株的滿袋時(shí)間在25 d～39 d；親本菌株的菌絲在培養(yǎng)料上生長(zhǎng)能力較快，5個(gè)親本菌株中除SK11外，其余4個(gè)菌株的滿袋時(shí)間均為25 d，顯示出較強(qiáng)的菌絲活力；16個(gè)雜交子中，Le0055、 Le0059、Le0064、Le0153和Le0191菌株的滿袋時(shí)間較短。在第一潮菇產(chǎn)量方面，親本菌株L18、L19和SK11的產(chǎn)量超過(guò)200 g/袋，也顯示較大的優(yōu)勢(shì)。僅有Le0152雜交子的產(chǎn)量較高，鮮菇達(dá)325 g/袋，產(chǎn)量遠(yuǎn)高于栽培品種；干菇重量達(dá)20.8 g/袋，也比對(duì)照高。Le0152雜交子的子實(shí)體含水量較高，為93.6%，產(chǎn)品可以鮮銷為主。因此，對(duì)Le0152雜交子進(jìn)行進(jìn)一步生產(chǎn)性試驗(yàn)。

2.3 雜交子Le0152生產(chǎn)試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)雜交子Le0152進(jìn)行生產(chǎn)性試驗(yàn)，連續(xù)4批次栽培以觀察其性狀的穩(wěn)定性，以親本SK11和已認(rèn)定的品種農(nóng)香2號(hào)作對(duì)比，其生產(chǎn)性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5，子實(shí)體性狀見(jiàn)圖1。

表5 農(nóng)香152生產(chǎn)性試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Production test of Nongxiang 152

圖1 農(nóng)香152子實(shí)體Fig.1 Fruit body of Nongxiang 152

從表5可以看出，雜交子Le0152的產(chǎn)量穩(wěn)定，4批次的第一潮產(chǎn)量均超過(guò)300 g/袋，比對(duì)照農(nóng)香2號(hào)增產(chǎn)264.3%，比親本SK11增產(chǎn)60.2%，優(yōu)勢(shì)顯著；且其栽培周期短，從接種至第一潮采收僅69 d，比對(duì)照農(nóng)香2號(hào)縮短7 d。從圖1子實(shí)體朵形上看，雜交子Le0152朵形圓整，子實(shí)體厚實(shí)致密，數(shù)量多，個(gè)頭較小，菌蓋淺褐色至棕色；菌蓋直徑與厚度比親本和對(duì)照菌株小，但其菌柄較短，菌蓋直徑與菌柄長(zhǎng)度和菌柄直徑的比值分別是1.49和3.96。

2.4 品種特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 拮抗試驗(yàn)

雜交子農(nóng)香152與親本SK11及對(duì)照品種農(nóng)香2號(hào)的拮抗試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 拮抗試驗(yàn)Fig.2 Antagonistic experiment

由圖2試驗(yàn)結(jié)果可知，雜交子農(nóng)香152與親本SK11及對(duì)照品種農(nóng)香2號(hào)有較明顯的拮抗線，認(rèn)為3個(gè)菌株為不同品種。

2.4.2 ISSR和SRAP分子鑒定

從5個(gè)ISSR引物中，篩選到ISSR12和ISSR13可以將農(nóng)香152與親本SK11和對(duì)照品種農(nóng)香2號(hào)相區(qū)別的DNA指紋圖譜，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 農(nóng)香152菌株ISSR鑒定電泳圖Fig.3 Electrophoresis diagram of ISSR identification of Nongxiang 152 strain

由圖3可知，引物ISSR12擴(kuò)增出2個(gè)明顯的條帶將農(nóng)香152、SK11和農(nóng)香2號(hào)相互區(qū)別，同時(shí)引物ISSR13有1個(gè)條帶將農(nóng)香152與親本SK11進(jìn)行區(qū)分。

從16對(duì)SRAP引物組合中，篩選到Me1/Em3、Me1/Em6、Me1/Em13、Me2/Em10和Me2/Em13引物能將農(nóng)香152與親本SK11和對(duì)照品種農(nóng)香2號(hào)相區(qū)別的DNA指紋圖譜，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 農(nóng)香152菌株SRAP鑒定電泳圖Fig.4 Electrophoresis diagram of SRAP identification of Nongxiang 152 strain

由圖4可知，引物Me1/Em3、Me1/Em6、Me1/Em13、Me2/Em10和Me2/Em13引物分別擴(kuò)增出1個(gè)的條帶將農(nóng)香152、SK11和農(nóng)香2號(hào)相互區(qū)別。

ISSR和SRAP多態(tài)性分析結(jié)果表明，農(nóng)香152既具有與其親本SK11相同的條帶，也具有與其親本不同的條帶，表明該雜交種是親本多孢自交后遺傳物質(zhì)發(fā)生重新組合得到；其與農(nóng)香2號(hào)也有明顯不同，表明農(nóng)香152和農(nóng)香2號(hào)是不同的菌株。因此，DNA分子鑒定結(jié)果表明這3個(gè)菌株各具特異性，是不同的品種。

3 結(jié)論與討論

農(nóng)香152號(hào)子實(shí)體單生，菌蓋呈圓形，淡褐色，菌肉厚實(shí)致密，菌傘直徑約為3.9 cm，菌蓋厚約為1.5 cm，周圍有部分白色鱗片，菌柄直徑1.3 cm，長(zhǎng)度2.4 cm。子實(shí)體較小，數(shù)量多，為低溫出菇型品種，菌絲培養(yǎng)溫度22℃～25℃，溫度過(guò)高，菌絲體稀疏，PDA培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)慢；子實(shí)體發(fā)育溫度12℃～14℃，溫度過(guò)高容易開傘；生物轉(zhuǎn)化率達(dá)85%左右，子實(shí)體第一潮出菇集中產(chǎn)量高達(dá)340 g/袋，出菇周期短，未經(jīng)轉(zhuǎn)色可出菇，接種69 d即可采收。

試驗(yàn)以產(chǎn)量高、出菇整齊、栽培周期短、品質(zhì)優(yōu)良、子實(shí)體組織緊實(shí)為育種目標(biāo)，篩選出性狀優(yōu)良、適合工廠化栽培的香菇新菌株農(nóng)香152。其具有產(chǎn)量高，出菇周期短，不經(jīng)轉(zhuǎn)色即可出菇，第一潮出菇集中等突出特點(diǎn)，尤其適合工廠化栽培。并通過(guò)拮抗試驗(yàn)和ISSR、SRAP分子鑒定，確認(rèn)農(nóng)香152號(hào)是一個(gè)新菌株品種。為豐富和創(chuàng)新香菇種質(zhì)資源，進(jìn)一步推動(dòng)香菇工廠化栽培奠定基礎(chǔ)。