劉夢，董欣越，楊愛珍，黃艷虹，高凡，郭家選

農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/北京農(nóng)學(xué)院資源與環(huán)境系，北京 102206

雙酚A(2,2-二(4-羥基苯基)丙烷，bisphenol A，BPA)，通常用于合成環(huán)氧樹脂、酚類樹脂和聚碳酸酯等工業(yè)產(chǎn)品[1]，同時BPA具有內(nèi)分泌干擾特性，可能會威脅胎兒和兒童的健康[2]。近年來，隨著BPA生產(chǎn)以及使用量的增加，其在環(huán)境中的直接或間接排放也隨之增加。BPA已成為一種全球性的環(huán)境污染物，在環(huán)境、食品、人體血液和尿液等不同基質(zhì)中被廣泛檢出[3-6]，歐洲和韓國土壤中BPA濃度分別高達(dá)140 μg·kg-1和48.68 μg·kg-1[7]；日本垃圾填埋場滲濾液中的BPA濃度高達(dá)17.2 mg·L-1[8]。環(huán)境中BPA的污染修復(fù)方法主要有物理法、化學(xué)法和生物法等，其中物理、化學(xué)法運(yùn)轉(zhuǎn)費(fèi)用高昂[9]，并可能產(chǎn)生二次污染，對生態(tài)系統(tǒng)健康產(chǎn)生進(jìn)一步的破壞，而植物修復(fù)技術(shù)屬于原位修復(fù)技術(shù)，其維護(hù)成本低、操作簡單、二次污染易于控制，具有良好的生態(tài)環(huán)境效益[10-11]。隋春曉和王琳[12]在人工濕地實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，香蒲床濕地對BPA的去除率在74%～96%之間，蘆葦床濕地對BPA的去除率基本維持在70%～83%。植物修復(fù)技術(shù)主要是利用自然生長植物根系(或莖葉)吸收、富集、降解或者固定污染土壤、水體和大氣中的污染物，達(dá)到凈化環(huán)境污染物的目的。然而，植物在吸收、富集污染物的生物過程中，污染物的毒性可能會影響到植物的生長發(fā)育。已有研究表明光合作用的改變是環(huán)境污染物影響植物生長發(fā)育的關(guān)鍵性因素[13]，而植物葉片氧化損傷與其解毒能力密切相關(guān)[14-15]。因此，研究BPA對植物葉片氣體交換參數(shù)、葉綠素?zé)晒鈪?shù)和氧化損傷的影響對于科學(xué)評價BPA脅迫下植物耐受和富集能力非常重要。

目前關(guān)于BPA對植物光合生理影響的研究主要集中在水稻、玉米和大豆等糧食作物[13, 16-17]，而對污染修復(fù)植物鮮見報道[18]。合果芋(SyngoniumpodophyllumSchott)，是天南星科代表性景觀葉植物，環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)[19]，具有較強(qiáng)的耐污和去污能力，對甲醛、苯的吸收效果十分顯著，是一種理想的富集植物[20-21]。王艷英等[22]發(fā)現(xiàn)合果芋等植物對城市河道的化學(xué)需氧量(COD)、氨氮和磷都有較好的降解效果。檀笑等[23]發(fā)現(xiàn)合果芋是一種具備去碳、脫氧、除磷和積累重金屬的高效修復(fù)植物，在有機(jī)物和重金屬復(fù)合污染水體的修復(fù)中應(yīng)用潛力較大。因此，合果芋也可能是一種對BPA污染具有較強(qiáng)耐受和富集能力的植物。然而，目前關(guān)于合果芋對BPA的耐受和富集能力，以及BPA對其葉片光合生理和氧化損傷的影響研究還非常缺乏[24]?；诖?，本文以合果芋為研究對象，研究BPA對合果芋葉片氣體交換參數(shù)、葉綠素?zé)晒鈪?shù)和氧化損傷的影響，以期為BPA污染的植物修復(fù)提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2021年3—4月在北京農(nóng)學(xué)院科技園區(qū)進(jìn)行。試驗(yàn)所用BPA購自北京酷來搏科技有限公司，BPA試劑配制以甲醇(色譜純，北京邁瑞達(dá)科技有限公司)為助溶劑。供試材料白蝶合果芋幼苗購自廣西欽州合果芋生產(chǎn)基地，隨后在人工氣候室中蒸餾水培養(yǎng)1個月，控制生長環(huán)境晝夜溫度為25 ℃/15 ℃，光暗時間為12 h/12 h，空氣相對濕度為60%。采用水培試驗(yàn)，塑料水培箱體積為10 L，尺寸為380 mm×280 mm×140 mm。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計

為了分析BPA對合果芋葉片氣體交換參數(shù)、葉綠素?zé)晒鈪?shù)和氧化損傷的影響，選擇株高約為40 cm、具有5～6片功能葉、莖稈粗細(xì)和根系等長勢一致的合果芋144株，使用0.5% NaClO溶液消毒20 min，蒸餾水清洗3～5次后種植于水培箱中，內(nèi)裝1/2強(qiáng)度Hoagland營養(yǎng)液，用穿孔塑料板固定，封蓋。營養(yǎng)液預(yù)培養(yǎng)7 d后，分別加入0.0、10.0、30.0和50.0 mg·L-1(濃度選擇基于世界各地環(huán)境中的BPA污染水平、其他植物的BPA毒性研究以及前期預(yù)試驗(yàn)數(shù)據(jù))的BPA進(jìn)行脅迫處理，共計4個處理水平；每個處理3個平行水培箱，每個平行水培箱種植12株，種植行距為60～80 mm。在BPA添加后的第0、1、3、5、7、10天隨機(jī)選取每個平行水培箱中植株的完全舒展葉(從頂端起向下取其完全展開的葉子)數(shù)片混勻，用液氮速凍且儲藏于-80 ℃冰箱內(nèi)。

1.3 測定方法

1.3.1 光合色素含量、氣體交換參數(shù)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定

隨機(jī)選取每個處理的合果芋若干，從頂端起向下取其完全展開的葉子混勻后，采用丙酮提取法[25-26]測定葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量，最終計算3次上述測定指標(biāo)的平均值。

氣體交換參數(shù)采用便攜式光合儀(CIRAS-3，漢莎科技儀器有限公司)測定。在上午9:00—11:00，測定合果芋頂芽向下數(shù)第2片完全展開葉片的凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、氣孔導(dǎo)度(Gs)和胞間CO2濃度(Ci)，并設(shè)定數(shù)據(jù)采集時間為200 s，穩(wěn)定后記錄，每個處理測定3株取平均值。

葉綠素?zé)晒鈪?shù)采用植物效率分析儀(Handy PEA，漢莎科技儀器有限公司)測定。暗適應(yīng)30 min后，測定合果芋頂芽向下數(shù)第2片完全展開葉片的初始熒光(F0)、最大熒光產(chǎn)量(Fm)和PSⅡ最大光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)值，每個處理測定3株取平均值。

1.3.2 過氧化氫、丙二醛和電解質(zhì)滲透率的測定

隨機(jī)選取每個處理的合果芋若干，從頂端起向下取其完全展開的葉子混勻后，采用二甲酚橙法[27]測定過氧化氫(H2O2)含量；采用改進(jìn)的硫代巴比妥酸法[28]測定丙二醛(MDA)含量；采用電導(dǎo)率儀(DDSJ-308F，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)測定電解質(zhì)滲透率(EC)，最終計算3次上述測定指標(biāo)的平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2019統(tǒng)計，SPSS 23.0分析處理間的差異顯著性，所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用雙因素方差方法分析顯著性(P<0.05)，使用Origin 2019b軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 BPA脅迫下合果芋葉片光合色素含量

由圖1可知，在同一培養(yǎng)階段，不同BPA處理(10、30和50 mg·L-1)的合果芋葉片葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量均低于對照處理(CK, 0 mg·L-1)。在10 mg·L-1處理下，合果芋葉片光合色素含量在3 d內(nèi)略有下降，但在3 d后變化相對穩(wěn)定。在30 mg·L-1和50 mg·L-1處理下，合果芋葉片光合色素含量隨著脅迫時間的增加顯著降低，其降低趨勢在前5 d顯著，后5 d趨于平緩。在第10天，10、30和50 mg·L-1處理下的葉綠素a分別比CK降低了6.4%、21.5%和30.1%；葉綠素b分別降低了7.0%、19.5%和32.5%；總?cè)~綠素分別降低了6.6%、21.0%和31.1%；類胡蘿卜素分別降低了10%、19%和30.2%。

圖1 雙酚A(BPA)處理對合果芋葉片葉綠素a (a)、葉綠素b (b)、總?cè)~綠素(c)和類胡蘿卜素(d)含量的影響注：不同大寫字母表示同一濃度下不同時間水平下差異性顯著(P<0.05)；不同小寫字母表示同一時間不同濃度水平下差異性顯著(P<0.05)；下同。Fig. 1 Effects of bisphenol (BPA) treatment on the content of chlorophyll a (a), chlorophyll b (b), total chlorophyll (c) and carotenoid (d) in leaves of Syngonium podophyllum SchottNote: Different capital letters indicate significant differences at the same concentration and different time levels (P<0.05); different lowercase letters indicate significant differences at the same time and different concentration levels (P<0.05); the same below.

2.2 BPA脅迫下合果芋葉片氣體交換參數(shù)

不同BPA處理下合果芋葉片Pn、Tr、Gs和Ci的變化情況如圖2所示。隨著BPA濃度的增加，合果芋葉片Pn逐漸下降，10 mg·L-1處理下變化相對穩(wěn)定，處理10 d內(nèi)略有下降但是變化不大，而30 mg·L-1、50 mg·L-1處理下前5 d內(nèi)變化顯著，5 d后變化趨緩(圖2(a))；在10、30和50 mg·L-1處理下合果芋葉片Tr顯著低于對照處理(CK, 0 mg·L-1)，在第10天分別降低8%、14%和25%，其中50 mg·L-1處理變化最顯著(圖2(b))；10、30和50 mg·L-1脅迫10 d后，Gs分別比CK降低了21%、31%和48%(圖2(c))；當(dāng)BPA濃度高于30 mg·L-1時，合果芋葉片Ci顯著增加，分別比CK增加了8%、27%和28%(圖2(d))。

圖2 BPA處理對合果芋葉片凈光合速率(Pn) (a)、蒸騰速率(Tr) (b)、氣孔導(dǎo)度(Gs) (c)和胞間二氧化碳濃度(Ci) (d)的影響Fig. 2 Effects of BPA treatment on net photosynthetic rate (Pn) (a), transpiration rate (Tr) (b), stomatal conductance (Gs) (c) and intercellular carbon dioxide concentration (Ci) (d) in leaves of Syngonium podophyllum Schott

2.3 BPA脅迫下合果芋葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)

不同BPA處理下合果芋葉片F(xiàn)0、Fm和Fv/Fm值的變化特征如圖3所示。10、30和50 mg·L-1處理下F0均高于對照處理(CK, 0 mg·L-1)，其中在第10天分別為696、730和746(圖3(a))；在同一培養(yǎng)階段，10、30和50 mg·L-1處理下Fm均低于CK，且在50 mg·L-1處理下達(dá)到最顯著水平(圖3(b))；10 mg·L-1處理下Fv/Fm值變化相對穩(wěn)定，處理10 d內(nèi)略有下降但是變化不大，而50 mg·L-1處理顯著下降，其中在第10天，10、30和50 mg·L-1處理下Fv/Fm值分別為0.763、0.745和0.737(圖3(c))。

圖3 BPA處理對合果芋葉片初始熒光(F0) (a)、最大熒光產(chǎn)量(Fm) (b)和PSⅡ最大光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm) (c)的影響Fig. 3 Effects of BPA treatment on initial fluorescence (F0) (a), maximum fluorescence yield (Fm) (b) and maximum light energy conversion efficiency (Fv/Fm) (c) of PSⅡ in leaves of Syngonium podophyllum Schott

2.4 BPA脅迫下合果芋葉片氧化損傷

由圖4可知，不同BPA處理下合果芋葉片H2O2、MDA含量和EC值均高于CK(0 mg·L-1)。在30 mg·L-1、50 mg·L-1處理下，隨著脅迫時間的增加，H2O2和MDA含量和EC值呈現(xiàn)不同程度的遞增，在第10天，H2O2分別比CK增加了16%和27.8%(圖4(a))，MDA含量分別比CK增加了12.2%和17.1%(圖4(b))，EC值分別比CK增加了3.6%和5.3%(圖4(c))。在10 mg·L-1處理下，H2O2、MDA含量和EC值在3 d內(nèi)略有上升，而在3 d后的變化趨于穩(wěn)定。

圖4 BPA處理對合果芋葉片過氧化氫(H2O2) (a)、丙二醛(MDA)(b)和電解質(zhì)滲透率(EC)(c)的影響Fig. 4 Effects of BPA treatment on hydrogen peroxide (H2O2) (a), malondialdehyde (MDA) (b) and electrolyte permeability EC (c) in leaves of Syngonium podophyllum Schott

3 討論(Discussion)

3.1 BPA脅迫對合果芋葉片光合作用的影響

植物生長發(fā)育依賴有機(jī)物的合成與積累，而有機(jī)物合成與累積依賴于植物的光合作用，因此光合作用的改變是環(huán)境污染物影響植物生長發(fā)育的關(guān)鍵性因素。其中葉綠素和類胡蘿卜素是植物光合作用的主要色素，其含量高低直接反映植物光合作用能力的強(qiáng)弱，當(dāng)植物受到逆境脅迫后可導(dǎo)致光合色素含量下降[18, 29-30]。有研究表明，高濃度的BPA能降低葉綠素的含量，干擾植物的正常生理活動，對有機(jī)物積累過程產(chǎn)生影響[24]。Zhang等[31]研究指出，高劑量BPA暴露會損害PSⅡ反應(yīng)中心，抑制光化學(xué)反應(yīng)，并導(dǎo)致多余的能量以熱量的形式釋放。本研究結(jié)果顯示，隨著BPA濃度的增加，合果芋葉片的葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量均呈下降的趨勢，當(dāng)BPA濃度達(dá)到50 mg·L-1時，合果芋葉片葉綠素的合成能力影響最嚴(yán)重，其中葉綠素a對脅迫處理更為敏感。推測其原因，可能是因?yàn)锽PA脅迫抑制了合果芋光合作用中的電子傳遞，葉綠體結(jié)構(gòu)遭到破壞，葉綠素合成酶的活性受到較大程度的影響。

植物的光合作用主要受氣孔因素和非氣孔因素的限制，在葉片氣體交換動態(tài)變化過程中，當(dāng)Ci與Gs同時下降時，Pn下降主要是由氣孔限制引起的，如果Pn的降低伴隨著Ci升高，光合作用的主要限制因素則是光合機(jī)構(gòu)活性降低的非氣孔因素引起的[32]。在逆境脅迫下，植物通常表現(xiàn)出氣孔導(dǎo)度降低，蒸騰減弱，CO2吸收和同化阻力增加，導(dǎo)致光合速率降低，同化產(chǎn)物供應(yīng)較少。趙繼武等[33]發(fā)現(xiàn)鈾脅迫會使黑麥草的Pn和Gs顯著降低，但未對Ci產(chǎn)生顯著影響，表明黑麥草的光合參數(shù)對鈾具有較好的耐受性，而Pn的降低可能是光抑制引起的。本研究中，Pn、Tr、Gs與葉綠素的變化趨勢基本一致，BPA濃度>30 mg·L-1時，合果芋葉片Gs顯著減小，Tr和Pn顯著降低，Ci逐漸增加，表明BPA導(dǎo)致光合作用降低應(yīng)是屬于非氣孔限制因子造成的，即葉肉消耗CO2的能力降低，光合作用過程受到BPA的抑制和損傷，進(jìn)而使光合代謝受到嚴(yán)重影響。這與李澤等[34]在重度干旱脅迫下2種油桐的Pn、Gs和Tr等顯著下降、Ci顯著升高的結(jié)果相似。

葉綠素?zé)晒馐翘綔y和分析植物光合功能的重要手段之一，為研究光系統(tǒng)及其電子傳遞過程提供了豐富信息，常被用于評價環(huán)境脅迫對植物生長的影響[16, 35]。其中F0是PSⅡ反應(yīng)中心全部開放時的熒光，它可以表示逆境對作物葉片PSⅡ永久性傷害；Fm是PSⅡ反應(yīng)中心處于完全關(guān)閉時的熒光產(chǎn)量，可反映通過PSⅡ的電子傳遞情況；Fv/Fm為PSⅡ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量，常用于度量植物葉片PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)換效率和PSⅡ潛在活性[33, 36-37]。徐小遜等[30]發(fā)現(xiàn)豨薟葉片F(xiàn)v/Fm、電子傳遞的量子產(chǎn)率(ΦPSⅡ)、表觀光合電子傳遞速率(ETR)隨Cd濃度的升高而逐漸降低，而非光化學(xué)淬滅系數(shù)(NPQ)則呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，表明豨薟光合機(jī)構(gòu)對Cd脅迫有一定的耐受能力。在本研究中，合果芋葉片F(xiàn)0隨BPA濃度和脅迫時間的增加呈上升趨勢，F(xiàn)m、Fv/Fm值呈下降趨勢，表明BPA處理組合果芋葉片捕獲光能中用于光化學(xué)反應(yīng)的光能減少，降低了PSⅡ反應(yīng)中心開放程度和光化學(xué)活性，影響了合果芋內(nèi)部生理功能的正常代謝。Jiao等[38]研究在大豆不同生長階段BPA脅迫對光合作用的影響發(fā)現(xiàn)，隨著BPA脅迫濃度的增大，大豆的Fv/Fm值呈不斷降低趨勢，對其光合作用的抑制作用也更明顯。

3.2 BPA脅迫對合果芋葉片氧化損傷的影響

在正常生長環(huán)境下，植物體內(nèi)活性氧(ROS)產(chǎn)生和清除保持動態(tài)平衡，但不同的環(huán)境脅迫會導(dǎo)致ROS代謝紊亂。當(dāng)ROS過量積累，直到超過植物抗氧化清除能力的程度時，會在葉綠體、質(zhì)膜、線粒體和過氧化物酶體中產(chǎn)生氧化應(yīng)激，從而引起植物細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化損傷。其中，H2O2是ROS的重要代表物質(zhì)，MDA是膜脂過氧化作用的主要產(chǎn)物之一，是反映細(xì)胞膜脂過氧化作用強(qiáng)弱和質(zhì)膜破壞程度的重要指標(biāo)[39-40]。此外，EC反映細(xì)胞外滲物質(zhì)的多少，可作為膜受損程度的辨別指標(biāo)，其生物膜結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性與植物的抗逆性密切相關(guān)，在逆境脅迫下細(xì)胞膜受到了損傷，會導(dǎo)致滲透物質(zhì)大量外流，從而會引起EC升高[41]。郭暉等[41]發(fā)現(xiàn)隨著鹽濃度的增大，合果芋、綠蘿、蔓綠絨和龜背竹的MDA、EC整體上均不同程度增加。Ali等[42]發(fā)現(xiàn)，高劑量的BPA增加了細(xì)胞的膜通透性，并導(dǎo)致ROS濃度增加和脂質(zhì)過氧化作用加強(qiáng)。本研究發(fā)現(xiàn)，除10 mg·L-1處理外，30 mg·L-1和50 mg·L-1的BPA處理下H2O2、MDA含量均隨BPA濃度和脅迫時間的增加呈穩(wěn)定上升的趨勢，這與本試驗(yàn)中EC的變化趨勢一致，表明低劑量BPA誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS具有降解少量BPA的能力，高劑量BPA會使合果芋葉片膜脂過氧化程度加劇，膜的透性增大，穩(wěn)定性降低，細(xì)胞內(nèi)含物外滲，影響植物的正常代謝，從而加大植物的毒害作用，這與Wang等[43]的試驗(yàn)結(jié)果相似。

綜上所述，所有BPA脅迫處理中，30 mg·L-1和50 mg·L-1處理的合果芋葉片的葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素量都顯著低于對照組(6.4%～32.5%)，且葉綠素a的破壞作用高于葉綠素b；同時，BPA脅迫還抑制了合果芋葉片對光能的吸收、轉(zhuǎn)化和利用，明顯降低了Pn、Tr、Gs、Fm和Fv/Fm值，且下降幅度隨著BPA處理濃度和時間的增加而增大。相對來說，10 mg·L-1的BPA脅迫處理對合果芋葉片氣體交換參數(shù)、葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響較小。此外，30 mg·L-1和50 mg·L-1處理的合果芋葉片H2O2和MDA含量、EC值均有不同程度的增加，且葉片膜脂過氧化嚴(yán)重，明顯受到損傷；而10 mg·L-1處理的合果芋葉片氧化損傷沒有顯著影響。