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        HPLC法測(cè)定鹵米松乳膏中有關(guān)物質(zhì)

        2022-03-09 02:10:58安明常珍呂寧郎昌野孫靜芬
        關(guān)鍵詞:鹵米專屬性原研

        安明,常珍,呂寧,郎昌野,孫靜芬

        鹵米松是一種強(qiáng)效外用糖皮質(zhì)激素類固醇藥物,具有抗炎、抗過(guò)敏、抗增生、收縮毛細(xì)血管和止癢等作用。目前臨床使用的鹵米松主要?jiǎng)┬蜑槿楦鄤?,其適應(yīng)證為對(duì)皮質(zhì)類固醇治療有效的非感染性炎癥性皮膚病,如脂溢性皮炎、接觸性皮炎、異位性皮炎、局限性神經(jīng)性皮炎、濕疹、白癜風(fēng)、尋常型銀屑病和扁平苔蘚等。鹵米松乳膏因使用方便、起效迅速、療效顯著,而得到廣泛的臨床應(yīng)用,并有大量文獻(xiàn)報(bào)道[1-7]。但鹵米松及鹵米松乳膏相關(guān)的質(zhì)量研究報(bào)道卻極少,僅有 1 篇鹵米松原料藥有關(guān)物質(zhì)研究和 1 篇鹵米松乳膏含量測(cè)定的文獻(xiàn)[8-9],尚未見(jiàn)到對(duì)鹵米松乳膏有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)研究的報(bào)道。隨著近年來(lái)國(guó)家藥監(jiān)部門對(duì)藥品質(zhì)量控制的加強(qiáng)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高,外用制劑的有關(guān)物質(zhì)研究成為質(zhì)控重點(diǎn)之一。因此,系統(tǒng)研究鹵米松乳膏的有關(guān)物質(zhì),并建立嚴(yán)格的控制標(biāo)準(zhǔn),對(duì)于保證藥品質(zhì)量和臨床用藥安全具有重要意義。

        本文參照相關(guān)文獻(xiàn)方法[8,10],建立了鹵米松乳膏有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)的高效液相色譜(HPLC)分析方法,并對(duì)方法學(xué)進(jìn)行了全面系統(tǒng)的驗(yàn)證。在此基礎(chǔ)上,對(duì)多個(gè)批次的鹵米松乳膏自制品進(jìn)行了有關(guān)物質(zhì)檢測(cè),并與原研品進(jìn)行了比較。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        LC-20A 型高效液相色譜儀(包括 LC-20AT型二元高壓梯度泵、SIL-20AC 型自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-20AC 型柱溫箱、SPD-20A 型紫外檢測(cè)器、Labsolution 工作站)為日本島津公司產(chǎn)品;Ultimate 3000 型高效液相色譜儀(包括集成式四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器和變色龍工作站)為美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品;MS105DU 型電子天平為美國(guó)梅特勒托利多公司產(chǎn)品。

        鹵米松乳膏自制品(批號(hào):171201、171202、171203)由湖南明瑞制藥有限公司生產(chǎn);鹵米松乳膏原研品(批號(hào):6171131、6171119)為香港澳美制藥廠產(chǎn)品;鹵米松對(duì)照品(純度:95.9%)、雜質(zhì)A(純度:80.48%)、雜質(zhì) B(純度:95.12%)、雜質(zhì) C(純度:97.86%)、雜質(zhì) D(純度:97.37%)、雜質(zhì) E(純度:97.50%)、雜質(zhì) F(純度:96.94%)、雜質(zhì) G(純度:99.02%)、雜質(zhì) H(純度:99.75%)、雜質(zhì) I(純度:99.27%)、雜質(zhì) J(純度:92.41%)、雜質(zhì) K(純度:99.56%)均由湖南明瑞制藥有限公司標(biāo)定;HPLC 級(jí)乙腈為美國(guó) Honeywell 公司產(chǎn)品;GR 級(jí)冰醋酸為美國(guó)阿拉丁公司產(chǎn)品;水為超純水。

        1.2 方法

        1.2.1 色譜條件 色譜柱:Agilent ZORBAX SB-C18 色譜柱(4.6 mm × 250 mm,5 μm);流動(dòng)相:以 0.03% 冰醋酸為流動(dòng)相 A,乙腈為流動(dòng)相 B,按表1 所列條件進(jìn)行梯度洗脫;流速:0.8 ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng):238 nm;柱溫:35 ℃;進(jìn)樣體積:20 μl。

        表1 鹵米松乳膏有關(guān)物質(zhì)檢查色譜條件的梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure of chromatographic condition for the determination of the related substances in halomethasone ointment

        1.2.2 溶液配制 供試品溶液:取鹵米松乳膏內(nèi)容物適量(約相當(dāng)于鹵米松 5 mg),置具塞錐形瓶中,加乙腈:水:冰醋酸(75:25:0.03)10 ml 和氯化鈉 0.2 g,60 ℃ 水浴振搖使鹵米松溶解,置冰浴中放置 30 min,取出搖勻,放至室溫,取上清液3000 r/min 離心 1 min 后,經(jīng) 0.22 μm 濾膜濾過(guò),取續(xù)濾液作為供試品溶液。

        對(duì)照溶液:精密量取供試品溶液 1 ml,置100 ml 量瓶中,以乙腈:0.03% 冰醋酸溶液(50:50)稀釋至刻度,搖勻,作為對(duì)照溶液(1.0%)。

        靈敏度溶液:精密量取對(duì)照溶液 1 ml,置 20 ml量瓶中,以乙腈:0.03% 冰醋酸溶液(50:50)稀釋至刻度,搖勻,作為靈敏度溶液(0.05%)。

        系統(tǒng)適用性溶液:取鹵米松對(duì)照品、雜質(zhì) A、雜質(zhì) C、雜質(zhì) F、雜質(zhì) G、雜質(zhì) J 對(duì)照品各適量,精密稱定,加乙腈:0.03% 冰醋酸溶液(50:50)溶解并定量稀釋制成約含鹵米松 0.5 mg/ml、各雜質(zhì) 2.5 μg/ml 的溶液,作為系統(tǒng)適用性溶液。

        1.2.3 測(cè)定法 參照高效液相色譜法(《中國(guó)藥典》2020年版四部通則 0512)試驗(yàn),采用上述色譜條件,取系統(tǒng)適用性溶液 20 μl 注入液相色譜儀,按鹵米松、雜質(zhì) G、雜質(zhì) J、雜質(zhì) F、雜質(zhì) C、雜質(zhì) A 的順序依次出峰,上述各峰之間的分離度均應(yīng)符合要求。取靈敏度溶液 20 μl 注入液相色譜儀,主成分峰高的信噪比應(yīng)大于 10。再取對(duì)照溶液和供試品溶液各 20 μl,注入液相色譜儀,記錄色譜圖。供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰(扣除相對(duì)鹵米松保留時(shí)間 0.35 倍之前的苯氧基乙醇峰及其他輔料峰),采用加校正因子的自身對(duì)照法進(jìn)行計(jì)算,雜質(zhì) A、C、F、G、J 峰面積均不得大于對(duì)照溶液主峰面積的 0.5 倍(0.5%);其他單個(gè)雜質(zhì)峰面積不得大于對(duì)照溶液主峰面積的 0.5 倍(0.5%);各雜質(zhì)峰面積和不得大于對(duì)照溶液主峰面積的 2 倍(2.0%)。供試品溶液色譜圖中小于靈敏度溶液中主峰面積的峰忽略不計(jì)(0.05%)。鹵米松及各雜質(zhì)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1,相對(duì)校正因子見(jiàn)表2。

        表2 鹵米松乳膏各有關(guān)物質(zhì)相對(duì)校正因子及可接受限度Table 2 Relative correction factor and acceptable limit of various related substances in halomethasone ointment

        圖1 鹵米松及鹵米松乳膏中各有關(guān)物質(zhì)結(jié)構(gòu)式Figure 1 Structural formula of halomethasone and various related substances in halomethasone ointment

        1.2.4 專屬性 鹵米松乳膏有關(guān)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中,已知雜質(zhì)規(guī)定了雜質(zhì) A、雜質(zhì) C、雜質(zhì) F、雜質(zhì) G、雜質(zhì) J。專屬性試驗(yàn)應(yīng)考察溶劑、空白輔料對(duì)測(cè)定有無(wú)干擾;鹵米松主峰與相鄰雜質(zhì)峰之間,以及各雜質(zhì)峰相互之間是否能夠很好地分離。各溶液配制方法如下:

        溶劑1:乙腈:0.03%冰醋酸溶液(50:50)。

        溶劑2:乙腈:水:冰醋酸(75:25:0.03)。

        空白輔料溶液:取鹵米松乳膏自制品處方比例空白輔料約 10 g,精密稱定,置 50 ml 具塞錐形瓶中,加 10 ml 溶劑 2 和氯化鈉 0.2 g,水浴 60 ℃振搖使鹵米松溶解,置冰浴中放置 30 min,取出搖勻,放至室溫,取上清液離心 1 min(3000 r/min)后,經(jīng) 0.22 μm 濾膜濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。

        各雜質(zhì)對(duì)照品貯備液(500 μg/ml):取鹵米松雜質(zhì) A、雜質(zhì) B、雜質(zhì) C、雜質(zhì) D、雜質(zhì) E、雜質(zhì) F、雜質(zhì) G、雜質(zhì) H、雜質(zhì) I、雜質(zhì) J、雜質(zhì) K對(duì)照品各約 10 mg,精密稱定,分別置不同 20 ml量瓶中,加溶劑 1 溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得。

        混合雜質(zhì)對(duì)照品貯備液 1(10 μg/ml):分別精密量取上述各雜質(zhì)對(duì)照品貯備液(500 μg/ml)各1 ml,置同一 50 ml 量瓶中,加溶劑 1 稀釋至刻度,搖勻,即得。

        混合雜質(zhì)對(duì)照品貯備液 2(25 μg/ml):分別精密量取上述雜質(zhì) A、雜質(zhì) C、雜質(zhì) F、雜質(zhì) G、雜質(zhì) J、雜質(zhì) K 對(duì)照品貯備液(500 μg/ml)各1 ml,置同一 20 ml 量瓶中,加溶劑 1 稀釋至刻度,搖勻,即得。

        系統(tǒng)適用性溶液:取鹵米松工作對(duì)照品約10 mg,精密稱定,置 20 ml 量瓶中,精密加入 2 ml混合雜質(zhì)對(duì)照品貯備液 1(10 μg/ml),加溶劑 1 溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得。

        自制品溶液:取鹵米松乳膏自制品(批號(hào):171201)約 10 g,精密稱定,置 50 ml 具塞錐形瓶中,然后按上述空白輔料溶液配制方法操作,即得。

        自制品 + 混合雜質(zhì)對(duì)照品溶液(0.5%):取鹵米松乳膏自制品約 10 g,精密稱定,置 50 ml 具塞錐形瓶中,加 1 ml 混合雜質(zhì)對(duì)照品貯備液 2、9 ml 溶劑 2 和氯化鈉 0.2 g,然后按上述空白輔料溶液配制方法操作,即得。

        原研品溶液:取鹵米松乳膏原研品(批號(hào):6171131)約 10 g,精密稱定,置 50 ml 具塞錐形瓶中,然后按上述空白輔料溶液配制方法操作,即得。

        自制品自身對(duì)照溶液:精密量取自制品溶液1 ml,置 100 ml 量瓶中,加溶劑 1 稀釋至刻度,搖勻,即得。

        靈敏度溶液:精密量取自制品自身對(duì)照溶液1 ml,置 20 ml 量瓶中,加溶劑 1 稀釋至刻度,搖勻,即得。

        精密量取上述溶液各 20 μl,分別注入液相色譜儀,記錄色譜圖。

        1.2.5 干擾性 干擾性試驗(yàn)應(yīng)考察供試品溶液色譜圖中主峰是否為純峰,以及高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、氧化、光照等破壞條件下降解的供試品溶液相對(duì)于未破壞供試品溶液物料平衡率是否在 90% ~ 110%之間,各峰之間是否能夠充分分離。空白輔料溶液、自制品未破壞溶液、原研品未破壞溶液配制方法同1.2.4 專屬性項(xiàng)下各溶液。

        取鹵米松乳膏自制品約 10 g,精密稱定,平行數(shù)份,分別:①置 50 ml 具塞錐形瓶中,置高溫120 ℃ 烘箱中,放置 16 h 后取出,冷卻至室溫(高溫破壞);②置 50 ml 石英量瓶中,在 4500 Lx 光照強(qiáng)度下放置 24 h 后取出(光照破壞);③置50 ml 石英量瓶中,在 200 μW/cm2紫外光照強(qiáng)度下放置 24 h 后取出(紫外光照破壞);④置 50 ml具塞錐形瓶中,加入 1 mol/L 鹽酸 1 ml,放置24 h 后,立即加入 1 mol/L 氫氧化鈉溶液 1 ml 中和(強(qiáng)酸破壞);⑤置 50 ml 具塞錐形瓶中,加1 mol/L 氫氧化鈉溶液 1 ml,放置 16 h 后,立即加入 1 mol/L 鹽酸 1 ml 中和(強(qiáng)堿破壞);⑥置50 ml 具塞錐形瓶中,加入 30% 雙氧水 1 ml,放置 24 h(氧化破壞)。然后,分別按照 1.2.4 專屬性項(xiàng)下自制品溶液配制方法操作(其中強(qiáng)氧化破壞樣品中加入溶劑 9 ml,強(qiáng)酸和強(qiáng)堿破壞樣品中加入溶劑 8 ml,其余破壞樣品中均加入溶劑 10 ml),分別作為相應(yīng)破壞條件的自制品溶液。

        原研品和空白輔料各破壞條件溶液的配制方法與自制品相應(yīng)破壞條件的溶液相同。

        精密量取上述溶液各 20 μl,分別注入液相色譜儀,記錄色譜圖。

        1.2.6 線性與范圍 取鹵米松對(duì)照品適量,加溶劑溶解并稀釋制成適當(dāng)濃度的主成分對(duì)照品溶液;分別取雜質(zhì) A、C、F、G、J、K 對(duì)照品,加溶劑溶解并稀釋制成系列濃度的各雜質(zhì)對(duì)照品溶液。取各溶液 20 μl,注入液相色譜儀,記錄色譜圖。以濃度 C(μg/ml)為橫坐標(biāo),以峰面積 A 為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,求出線性方程。

        1.2.7 定量限與檢測(cè)限 取上述線性與范圍項(xiàng)下各溶液,以溶劑逐步稀釋,精密量取 20 μl,注入液相色譜儀,記錄色譜圖,按峰高約為基線噪音10 倍和 3 倍分別作為定量限(S/N ≥ 10)和檢測(cè)限(S/N ≥ 3)。

        1.2.8 精密度

        ⑴重復(fù)性:按照專屬性項(xiàng)下方法分別配制自制品溶液和自制品自身對(duì)照溶液。按照專屬性項(xiàng)下空白輔料溶液配制方法,僅將其中 10 ml 溶劑 2 替換為 1 ml 混合雜質(zhì)對(duì)照品貯備液 2(25 μg/ml)+9 ml 溶劑 2,制得混合雜質(zhì)對(duì)照品溶液。分別精密量取上述溶液各 20 μl,分別注入液相色譜儀,記錄色譜圖。以 6 份自制品溶液中雜質(zhì)含量(采用加校正因子的自身對(duì)照法計(jì)算)的 RSD 考察方法的重復(fù)性。

        ⑵中間精密度:不同操作人員采用不同儀器于不同日期照重復(fù)性項(xiàng)下方法進(jìn)行自制品溶液(6 份)和自制品自身對(duì)照溶液的配制。以 12 份自制品中雜質(zhì)含量(采用加校正因子的自身對(duì)照法計(jì)算)的 RSD 考察方法的中間精密度。

        1.2.9 準(zhǔn)確度 按“1.2.8 精密度”中“重復(fù)性”項(xiàng)下方法,配制混合雜質(zhì)對(duì)照品溶液。向鹵米松乳膏自制品中分別加入“1.2.4 專屬性”項(xiàng)下所述混合雜質(zhì)對(duì)照品貯備液 2(25 μg/ml)適量,按自制品溶液配制方法操作,制備成含各已知雜質(zhì)限度量的 50%、100%、150% 濃度的溶液,作為回收率供試品溶液。分別精密量取該回收率供試品溶液各 0.5 ml,置 50 ml 量瓶中,加溶劑稀釋至刻度,搖勻,作為回收率自身對(duì)照溶液。

        精密量取上述溶液各 20 μl,分別注入液相色譜儀,記錄色譜圖。按加校正因子的自身對(duì)照法計(jì)算回收率。

        1.2.10 溶液穩(wěn)定性 照專屬性項(xiàng)下方法配制自制品溶液,于室溫條件下放置,在 0、4、8、12、24、36、48 h 分別量取 20 μl,注入液相色譜儀,記錄色譜圖。以各已知雜質(zhì)、單雜、總雜含量變化及雜質(zhì)峰個(gè)數(shù)考察自制品溶液穩(wěn)定性。

        1.2.11 耐用性

        ⑴校正因子耐用性:考察了更換不同色譜柱(色譜柱 1、2、3)以及微調(diào)柱溫(33、35、37 ℃),流速(0.75、0.8、0.9 ml/min),檢測(cè)波長(zhǎng)(236、238、240 nm),流動(dòng)相初始比例(流動(dòng)相 A:B 分別為63:37、65:35、67:33)等條件,對(duì)校正因子結(jié)果的影響。

        ⑵方法耐用性:考察了更換不同色譜柱(色譜柱 1、2、3)以及微調(diào)柱溫(33、35、37 ℃),流速(0.75、0.8、0.9 ml/min),檢測(cè)波長(zhǎng)(236、238、240 nm),流動(dòng)相初始比例(流動(dòng)相 A:B 分別為63:37、65:35、67:33)等條件,對(duì)系統(tǒng)分離情況和雜質(zhì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

        1.2.12 樣品有關(guān)物質(zhì)檢測(cè) 采用上述經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的有關(guān)物質(zhì)檢查方法,對(duì)鹵米松乳膏 3 批自制品和 2 批原研品進(jìn)行檢測(cè)。

        2 結(jié)果

        2.1 專屬性

        由專屬性試驗(yàn)結(jié)果(圖2 和表3)可知:溶劑和空白輔料對(duì)測(cè)定無(wú)干擾;主峰與相鄰雜質(zhì)峰之間,以及各已知雜質(zhì)峰與相鄰峰之間均能很好分離;靈敏度溶液中,主成分峰高信噪比 > 10;自制品中檢出雜質(zhì) C、雜質(zhì) F 和雜質(zhì) J;原研品中檢出雜質(zhì) C、雜質(zhì) F 和雜質(zhì) G;自制品中加入混合雜質(zhì)對(duì)照品后,相應(yīng)雜質(zhì)位置檢出雜質(zhì)峰。結(jié)果表明,自制品與原研品雜質(zhì)譜基本一致,本方法專屬性良好。

        表3 鹵米松乳膏有關(guān)物質(zhì)檢查專屬性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of specificity test of halomethasone ointment

        圖2 鹵米松乳膏有關(guān)物質(zhì)檢查專屬性試驗(yàn)色譜圖(A:溶劑 1;B:空白輔料溶液;C:系統(tǒng)適用性溶液;D:靈敏度溶液;E:自制品溶液;F:自制品+混合雜質(zhì)對(duì)照品溶液;G:原研品溶液)Figure 2 Chromatograms of specificity test of halomethasone ointment (A: Solvent 1; B: Blank excipient solution; C: System suitability solution; D: Sensitivity solution; E: Self-made preparation solution; F: Self-made preparation + mixed impurities reference solution; G: Reference preparation solution)

        2.2 干擾性

        由干擾性測(cè)定結(jié)果(代表性圖譜見(jiàn)圖3)可知,空白輔料在各條件下破壞后,對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。各破壞條件下的自制品和原研品經(jīng)二極管陣列(PDA)檢測(cè)器測(cè)定主峰純度,均為單一峰。自制品和原研品對(duì)強(qiáng)酸破壞基本穩(wěn)定,對(duì)強(qiáng)堿破壞極不穩(wěn)定,在其他破壞條件下不穩(wěn)定。具體如下:

        高溫破壞條件下,自制品雜質(zhì) G、J、F、C、其他單個(gè)最大雜質(zhì)和總雜質(zhì)均有所增加;原研品雜質(zhì) G、F、C 及總雜質(zhì)有所增加。光照破壞條件下,自制品和原研品的雜質(zhì) G、F 及總雜質(zhì)均稍有增加。紫外光照條件下,自制品雜質(zhì) A 和總雜質(zhì)有所增加;原研品雜質(zhì) F、A 和總雜質(zhì)有所增加。強(qiáng)酸破壞條件下,自制品僅總雜質(zhì)稍有增加;原研品僅雜質(zhì) G 和總雜質(zhì)稍有增加。強(qiáng)堿破壞條件下,自制品和原研品雜質(zhì) G、J、F 均稍有增加,均出現(xiàn)新的未知雜質(zhì)峰(自制品在 RRT 0.54 和 RRT 0.56 處,原研品在 RRT 0.55 和 RRT 0.57 處),總雜質(zhì)均明顯增加。氧化破壞條件下,自制品雜質(zhì)J 稍有增加,原研品總雜質(zhì)稍有增加。

        破壞前后物料平衡率計(jì)算結(jié)果表明,各破壞條件下,破壞前后物料守恒(物料平衡率在 93.9% ~103.4% 之間)。可見(jiàn),本方法干擾性符合相關(guān)規(guī)定。

        由于空白輔料在各破壞條件下對(duì)測(cè)定無(wú)干擾,原研品與自制品在各破壞條件下結(jié)果類似,因此圖3中僅列出自制品未破壞和各破壞條件下色譜圖。

        圖3 鹵米松乳膏有關(guān)物質(zhì)檢查干擾性試驗(yàn)色譜圖(A:空白輔料溶液;B:自制品溶液;C:原研品溶液;D:高溫破壞;E:光照破壞;F:紫外光照破壞;G:強(qiáng)酸破壞;H:強(qiáng)堿破壞;I:氧化破壞)Figure 3 Chromatograms of interference test of halomethasone ointment (A: Blank excipient solution; B: Self-made preparation solution; C: Reference preparation solution; D: High temperature damaged; E: Light damaged; F: Ultraviolet light damaged; G:Strong acid damaged; H: Strong alkali damaged; I: Strong oxidants damaged)

        2.3 線性與范圍

        線性與范圍測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。主成分鹵米松有兩個(gè)線性方程,其中方程 1 對(duì)應(yīng)有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)時(shí)供試品濃度的線性,方程 2 對(duì)應(yīng)限度濃度范圍的線性。

        表4 鹵米松及各有關(guān)物質(zhì)線性方程Table 4 Linear equation of halomethasone and various related substances by HPLC

        結(jié)果表明,主成分鹵米松與各已知雜質(zhì)(雜質(zhì)A、C、F、G、J、K)在上述濃度范圍內(nèi),濃度與峰面積線性相關(guān)系數(shù)r均 ≥ 0.9992,各雜質(zhì)和主峰的截距/限度濃度峰面積均 < 10%,各峰響應(yīng)因子RSD 均 < 10%。因此各雜質(zhì)濃度與峰面積線性關(guān)系均良好。

        2.4 定量限與檢測(cè)限

        由表5 可見(jiàn),0.0032% 的雜質(zhì) A、0.0013% 的雜質(zhì) C、0.0009% 的雜質(zhì) F、0.0019% 的雜質(zhì) G、0.0017% 的雜質(zhì) J、0.0018% 的雜質(zhì) K 均能被有效檢出;鹵米松的檢測(cè)限相當(dāng)于供試品溶液主成分濃度的 0.003%,表明 0.003% 的未知雜質(zhì)能被有效檢出??梢?jiàn)鹵米松及各雜質(zhì)檢測(cè)限完全滿足鹵米松乳膏有關(guān)物質(zhì)檢查標(biāo)準(zhǔn)限度的要求。

        表5 鹵米松及各有關(guān)物質(zhì)定量限和檢測(cè)限Table 5 Limit of quantitation and detection of halomethasone and various related substances by HPLC

        2.5 精密度

        2.5.1 重復(fù)性 鹵米松乳膏有關(guān)物質(zhì)重復(fù)性結(jié)果表明:6 份自制品中均未檢出雜質(zhì) G 和雜質(zhì) K,均在 RRT 約 1.64 處檢出最大單雜,檢出的已知雜質(zhì) A、C、F、J、最大單雜及總雜含量的 RSD 分別為 4.48%、3.19%、2.20%、1.59%、6.90%、2.42%,均小于 10%??梢?jiàn)本方法重復(fù)性良好。

        2.5.2 中間精密度 鹵米松乳膏有關(guān)物質(zhì)中間精密度結(jié)果表明:12 份自制品中均未檢出雜質(zhì) G 和K,均在 RRT 約 1.64 處檢出最大單雜;檢出的已知雜質(zhì) C、F、J、最大單雜及其總雜含量的 RSD 分別為 2.61%、3.71%、3.36%、5.29%、3.04%,均小于 10.0%;雜質(zhì) A 含量 RSD 為 17.23%,極差小于限度的 20%(限度為 0.5%)。表明本方法中間精密度良好。

        2.6 準(zhǔn)確度

        準(zhǔn)確度結(jié)果(表6)表明:在 50%、100% 和150% 限度濃度下,制劑中各雜質(zhì)回收率均在 92% ~105% 之間;各濃度下各雜質(zhì)回收率 RSD 均小于5.0%??梢?jiàn)本方法各雜質(zhì)回收率較高,準(zhǔn)確度良好。

        表6 鹵米松乳膏有關(guān)物質(zhì)檢查準(zhǔn)確度結(jié)果Table 6 Accuracy of various related substances in halomethasone ointment by HPLC

        2.7 溶液穩(wěn)定性

        溶液穩(wěn)定性結(jié)果表明,室溫條件下放置 48 h,各時(shí)間點(diǎn)自制品溶液中各雜質(zhì)均無(wú)明顯變化,均未檢出雜質(zhì) G 和雜質(zhì) K,雜質(zhì) A、C、F、J、最大單雜和總雜含量的 RSD 分別為 8.21%、1.47%、2.27%、0.82%、8.39%、2.95%,均小于 10%,說(shuō)明室溫條件下放置溶液穩(wěn)定性良好。

        2.8 耐用性

        2.8.1 校正因子耐用性試驗(yàn)結(jié)果 更換色譜柱以及微調(diào)柱溫、流速、檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相初始比例的條件下,各已知雜質(zhì)和主成分鹵米松的濃度與峰面積線性關(guān)系均良好;不同條件下各雜質(zhì)校正因子的RSD 均小于 10.0%。結(jié)果表明本方法校正因子耐用性良好。

        2.8.2 方法耐用性試驗(yàn)結(jié)果 更換色譜柱以及微調(diào)柱溫、流速、檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相初始比例的條件下,系統(tǒng)適用性溶液中各峰間分離度均大于 1.5,系統(tǒng)適用性試驗(yàn)?zāi)陀眯粤己?;供試品中均未檢出雜質(zhì) G 和雜質(zhì) K,檢出的已知雜質(zhì) A、C、F、J 和最大單雜及總雜含量 RSD 均小于 10%;在微調(diào)柱溫和流動(dòng)相比例后,雜質(zhì)的相對(duì)保留時(shí)間稍有變化,因此,在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中采用雜質(zhì)對(duì)照品配制系統(tǒng)適用性溶液進(jìn)行雜質(zhì)的定位。結(jié)果表明本方法耐用性良好。

        2.9 樣品有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)

        對(duì)鹵米松乳膏 3 批自制品和 2 批原研品進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢測(cè),結(jié)果見(jiàn)表7。

        表7 鹵米松乳膏有關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果Table 7 Result of the related substances in halomethasone ointment

        由上述結(jié)果可知,鹵米松乳膏自制品和原研品雜質(zhì)譜基本一致,各批次自制品和原研品中各已知雜質(zhì)、其他最大單個(gè)雜質(zhì)和總雜質(zhì)含量均在規(guī)定限度內(nèi),說(shuō)明各批次樣品有關(guān)物質(zhì)均符合所訂質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定。

        3 討論

        本文參考了鹵米松乳膏國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)下對(duì)單個(gè)雜質(zhì)及總雜質(zhì)的限度規(guī)定,并結(jié)合自制鹵米松乳膏所用原料藥的合成路線、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及制劑處方工藝條件和降解路徑,對(duì)鹵米松乳膏的雜質(zhì)譜進(jìn)行了全面系統(tǒng)的研究。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步完善了鹵米松乳膏有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)條件,建立了本文所述的有關(guān)物質(zhì)檢查方法。

        國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)中鹵米松乳膏有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)下,并未規(guī)定已知雜質(zhì)采用自身對(duì)照法計(jì)算雜質(zhì)含量;而本研究中對(duì)多個(gè)已知雜質(zhì)進(jìn)行了規(guī)定,且采用加校正因子的自身對(duì)照法計(jì)算各已知雜質(zhì)含量,使雜質(zhì)定量更為準(zhǔn)確。

        本研究中干擾性試驗(yàn)顯示鹵米松乳膏自制品和原研品在強(qiáng)堿、高溫、光照及氧化條件下均不穩(wěn)定,可降解出雜質(zhì) A、C、F、G、J,因此將這幾種已知雜質(zhì)納入鹵米松乳膏有關(guān)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中。雜質(zhì)K 為鹵米松原料藥的工藝雜質(zhì),在鹵米松乳膏干擾性試驗(yàn)和影響因素試驗(yàn)中并未降解產(chǎn)生,因此,雖在方法學(xué)驗(yàn)證中對(duì)其進(jìn)行研究,但未將其納入制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中。此外,鹵米松原料藥的工藝雜質(zhì)還包括雜質(zhì) D(中間體 2)、雜質(zhì) B(中間體 2 的工藝副產(chǎn)物)、雜質(zhì) E(中間體 3)、雜質(zhì) H(氟米松)、雜質(zhì) I(中間體 1),這些雜質(zhì)在鹵米松乳膏干擾性和影響因素試驗(yàn)中均不會(huì)降解產(chǎn)生,且在原料藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中已進(jìn)行規(guī)定,因此鹵米松乳膏有關(guān)物質(zhì)方法中不再進(jìn)行相關(guān)研究,僅在方法學(xué)驗(yàn)證過(guò)程中的系統(tǒng)適用性溶液中加入,以確保制劑中如果引入這些工藝雜質(zhì),在所建立的色譜條件下能夠有效分離并檢出。

        綜上所述,本文建立了鹵米松乳膏有關(guān)物質(zhì)檢查的 HPLC 法,并進(jìn)行了全面系統(tǒng)的方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果表明,該法專屬性良好,干擾性符合相關(guān)規(guī)定,各已知雜質(zhì)濃度-峰面積之間的線性關(guān)系良好,方法精密度、準(zhǔn)確度和耐用性均良好,可用于簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)鹵米松乳膏中的有關(guān)物質(zhì)。

        采用該法對(duì)鹵米松乳膏 3 批自制品和 2 批原研品進(jìn)行了有關(guān)物質(zhì)檢查,結(jié)果表明,自制品和原研品雜質(zhì)譜基本一致,自制品中各已知雜質(zhì)、單個(gè)未知雜質(zhì)和總雜質(zhì)均低于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的限度。

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