安明，常珍，呂寧，郎昌野，孫靜芬

鹵米松是一種強(qiáng)效外用糖皮質(zhì)激素類固醇藥物，具有抗炎、抗過(guò)敏、抗增生、收縮毛細(xì)血管和止癢等作用。目前臨床使用的鹵米松主要?jiǎng)┬蜑槿楦鄤?，其適應(yīng)證為對(duì)皮質(zhì)類固醇治療有效的非感染性炎癥性皮膚病，如脂溢性皮炎、接觸性皮炎、異位性皮炎、局限性神經(jīng)性皮炎、濕疹、白癜風(fēng)、尋常型銀屑病和扁平苔蘚等。鹵米松乳膏因使用方便、起效迅速、療效顯著，而得到廣泛的臨床應(yīng)用，并有大量文獻(xiàn)報(bào)道[1-7]。但鹵米松及鹵米松乳膏相關(guān)的質(zhì)量研究報(bào)道卻極少，僅有 1 篇鹵米松原料藥有關(guān)物質(zhì)研究和 1 篇鹵米松乳膏含量測(cè)定的文獻(xiàn)[8-9]，尚未見(jiàn)到對(duì)鹵米松乳膏有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)研究的報(bào)道。隨著近年來(lái)國(guó)家藥監(jiān)部門對(duì)藥品質(zhì)量控制的加強(qiáng)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高，外用制劑的有關(guān)物質(zhì)研究成為質(zhì)控重點(diǎn)之一。因此，系統(tǒng)研究鹵米松乳膏的有關(guān)物質(zhì)，并建立嚴(yán)格的控制標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于保證藥品質(zhì)量和臨床用藥安全具有重要意義。

本文參照相關(guān)文獻(xiàn)方法[8,10]，建立了鹵米松乳膏有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)的高效液相色譜（HPLC）分析方法，并對(duì)方法學(xué)進(jìn)行了全面系統(tǒng)的驗(yàn)證。在此基礎(chǔ)上，對(duì)多個(gè)批次的鹵米松乳膏自制品進(jìn)行了有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)，并與原研品進(jìn)行了比較。

1 材料與方法

1.1 材料

LC-20A 型高效液相色譜儀（包括 LC-20AT型二元高壓梯度泵、SIL-20AC 型自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-20AC 型柱溫箱、SPD-20A 型紫外檢測(cè)器、Labsolution 工作站）為日本島津公司產(chǎn)品；Ultimate 3000 型高效液相色譜儀（包括集成式四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器和變色龍工作站）為美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品；MS105DU 型電子天平為美國(guó)梅特勒托利多公司產(chǎn)品。

鹵米松乳膏自制品（批號(hào)：171201、171202、171203）由湖南明瑞制藥有限公司生產(chǎn)；鹵米松乳膏原研品（批號(hào)：6171131、6171119）為香港澳美制藥廠產(chǎn)品；鹵米松對(duì)照品（純度：95.9%）、雜質(zhì)A（純度：80.48%）、雜質(zhì) B（純度：95.12%）、雜質(zhì) C（純度：97.86%）、雜質(zhì) D（純度：97.37%）、雜質(zhì) E（純度：97.50%）、雜質(zhì) F（純度：96.94%）、雜質(zhì) G（純度：99.02%）、雜質(zhì) H（純度：99.75%）、雜質(zhì) I（純度：99.27%）、雜質(zhì) J（純度：92.41%）、雜質(zhì) K（純度：99.56%）均由湖南明瑞制藥有限公司標(biāo)定；HPLC 級(jí)乙腈為美國(guó) Honeywell 公司產(chǎn)品；GR 級(jí)冰醋酸為美國(guó)阿拉丁公司產(chǎn)品；水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18 色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：以 0.03% 冰醋酸為流動(dòng)相 A，乙腈為流動(dòng)相 B，按表1 所列條件進(jìn)行梯度洗脫；流速：0.8 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：238 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積：20 μl。

表1 鹵米松乳膏有關(guān)物質(zhì)檢查色譜條件的梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure of chromatographic condition for the determination of the related substances in halomethasone ointment

1.2.2 溶液配制 供試品溶液：取鹵米松乳膏內(nèi)容物適量（約相當(dāng)于鹵米松 5 mg），置具塞錐形瓶中，加乙腈:水:冰醋酸（75:25:0.03）10 ml 和氯化鈉 0.2 g，60 ℃ 水浴振搖使鹵米松溶解，置冰浴中放置 30 min，取出搖勻，放至室溫，取上清液3000 r/min 離心 1 min 后，經(jīng) 0.22 μm 濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

對(duì)照溶液：精密量取供試品溶液 1 ml，置100 ml 量瓶中，以乙腈:0.03% 冰醋酸溶液（50:50）稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液（1.0%）。

靈敏度溶液：精密量取對(duì)照溶液 1 ml，置 20 ml量瓶中，以乙腈:0.03% 冰醋酸溶液（50:50）稀釋至刻度，搖勻，作為靈敏度溶液（0.05%）。

系統(tǒng)適用性溶液：取鹵米松對(duì)照品、雜質(zhì) A、雜質(zhì) C、雜質(zhì) F、雜質(zhì) G、雜質(zhì) J 對(duì)照品各適量，精密稱定，加乙腈:0.03% 冰醋酸溶液（50:50）溶解并定量稀釋制成約含鹵米松 0.5 mg/ml、各雜質(zhì) 2.5 μg/ml 的溶液，作為系統(tǒng)適用性溶液。

1.2.3 測(cè)定法 參照高效液相色譜法（《中國(guó)藥典》2020年版四部通則 0512）試驗(yàn)，采用上述色譜條件，取系統(tǒng)適用性溶液 20 μl 注入液相色譜儀，按鹵米松、雜質(zhì) G、雜質(zhì) J、雜質(zhì) F、雜質(zhì) C、雜質(zhì) A 的順序依次出峰，上述各峰之間的分離度均應(yīng)符合要求。取靈敏度溶液 20 μl 注入液相色譜儀，主成分峰高的信噪比應(yīng)大于 10。再取對(duì)照溶液和供試品溶液各 20 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰（扣除相對(duì)鹵米松保留時(shí)間 0.35 倍之前的苯氧基乙醇峰及其他輔料峰），采用加校正因子的自身對(duì)照法進(jìn)行計(jì)算，雜質(zhì) A、C、F、G、J 峰面積均不得大于對(duì)照溶液主峰面積的 0.5 倍（0.5%）；其他單個(gè)雜質(zhì)峰面積不得大于對(duì)照溶液主峰面積的 0.5 倍（0.5%）；各雜質(zhì)峰面積和不得大于對(duì)照溶液主峰面積的 2 倍（2.0%）。供試品溶液色譜圖中小于靈敏度溶液中主峰面積的峰忽略不計(jì)（0.05%）。鹵米松及各雜質(zhì)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1，相對(duì)校正因子見(jiàn)表2。

表2 鹵米松乳膏各有關(guān)物質(zhì)相對(duì)校正因子及可接受限度Table 2 Relative correction factor and acceptable limit of various related substances in halomethasone ointment

圖1 鹵米松及鹵米松乳膏中各有關(guān)物質(zhì)結(jié)構(gòu)式Figure 1 Structural formula of halomethasone and various related substances in halomethasone ointment

1.2.4 專屬性 鹵米松乳膏有關(guān)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中，已知雜質(zhì)規(guī)定了雜質(zhì) A、雜質(zhì) C、雜質(zhì) F、雜質(zhì) G、雜質(zhì) J。專屬性試驗(yàn)應(yīng)考察溶劑、空白輔料對(duì)測(cè)定有無(wú)干擾；鹵米松主峰與相鄰雜質(zhì)峰之間，以及各雜質(zhì)峰相互之間是否能夠很好地分離。各溶液配制方法如下：

溶劑1：乙腈:0.03%冰醋酸溶液（50:50）。

溶劑2：乙腈:水:冰醋酸（75:25:0.03）。

空白輔料溶液：取鹵米松乳膏自制品處方比例空白輔料約 10 g，精密稱定，置 50 ml 具塞錐形瓶中，加 10 ml 溶劑 2 和氯化鈉 0.2 g，水浴 60 ℃振搖使鹵米松溶解，置冰浴中放置 30 min，取出搖勻，放至室溫，取上清液離心 1 min（3000 r/min）后，經(jīng) 0.22 μm 濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

各雜質(zhì)對(duì)照品貯備液（500 μg/ml）：取鹵米松雜質(zhì) A、雜質(zhì) B、雜質(zhì) C、雜質(zhì) D、雜質(zhì) E、雜質(zhì) F、雜質(zhì) G、雜質(zhì) H、雜質(zhì) I、雜質(zhì) J、雜質(zhì) K對(duì)照品各約 10 mg，精密稱定，分別置不同 20 ml量瓶中，加溶劑 1 溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

混合雜質(zhì)對(duì)照品貯備液 1（10 μg/ml）：分別精密量取上述各雜質(zhì)對(duì)照品貯備液（500 μg/ml）各1 ml，置同一 50 ml 量瓶中，加溶劑 1 稀釋至刻度，搖勻，即得。

混合雜質(zhì)對(duì)照品貯備液 2（25 μg/ml）：分別精密量取上述雜質(zhì) A、雜質(zhì) C、雜質(zhì) F、雜質(zhì) G、雜質(zhì) J、雜質(zhì) K 對(duì)照品貯備液（500 μg/ml）各1 ml，置同一 20 ml 量瓶中，加溶劑 1 稀釋至刻度，搖勻，即得。

系統(tǒng)適用性溶液：取鹵米松工作對(duì)照品約10 mg，精密稱定，置 20 ml 量瓶中，精密加入 2 ml混合雜質(zhì)對(duì)照品貯備液 1（10 μg/ml），加溶劑 1 溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

自制品溶液：取鹵米松乳膏自制品（批號(hào)：171201）約 10 g，精密稱定，置 50 ml 具塞錐形瓶中，然后按上述空白輔料溶液配制方法操作，即得。

自制品 + 混合雜質(zhì)對(duì)照品溶液（0.5%）：取鹵米松乳膏自制品約 10 g，精密稱定，置 50 ml 具塞錐形瓶中，加 1 ml 混合雜質(zhì)對(duì)照品貯備液 2、9 ml 溶劑 2 和氯化鈉 0.2 g，然后按上述空白輔料溶液配制方法操作，即得。

原研品溶液：取鹵米松乳膏原研品（批號(hào)：6171131）約 10 g，精密稱定，置 50 ml 具塞錐形瓶中，然后按上述空白輔料溶液配制方法操作，即得。

自制品自身對(duì)照溶液：精密量取自制品溶液1 ml，置 100 ml 量瓶中，加溶劑 1 稀釋至刻度，搖勻，即得。

靈敏度溶液：精密量取自制品自身對(duì)照溶液1 ml，置 20 ml 量瓶中，加溶劑 1 稀釋至刻度，搖勻，即得。

精密量取上述溶液各 20 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

1.2.5 干擾性 干擾性試驗(yàn)應(yīng)考察供試品溶液色譜圖中主峰是否為純峰，以及高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、氧化、光照等破壞條件下降解的供試品溶液相對(duì)于未破壞供試品溶液物料平衡率是否在 90% ～ 110%之間，各峰之間是否能夠充分分離。空白輔料溶液、自制品未破壞溶液、原研品未破壞溶液配制方法同1.2.4 專屬性項(xiàng)下各溶液。

取鹵米松乳膏自制品約 10 g，精密稱定，平行數(shù)份，分別：①置 50 ml 具塞錐形瓶中，置高溫120 ℃ 烘箱中，放置 16 h 后取出，冷卻至室溫（高溫破壞）；②置 50 ml 石英量瓶中，在 4500 Lx 光照強(qiáng)度下放置 24 h 后取出（光照破壞）；③置50 ml 石英量瓶中，在 200 μW/cm2紫外光照強(qiáng)度下放置 24 h 后取出（紫外光照破壞）；④置 50 ml具塞錐形瓶中，加入 1 mol/L 鹽酸 1 ml，放置24 h 后，立即加入 1 mol/L 氫氧化鈉溶液 1 ml 中和（強(qiáng)酸破壞）；⑤置 50 ml 具塞錐形瓶中，加1 mol/L 氫氧化鈉溶液 1 ml，放置 16 h 后，立即加入 1 mol/L 鹽酸 1 ml 中和（強(qiáng)堿破壞）；⑥置50 ml 具塞錐形瓶中，加入 30% 雙氧水 1 ml，放置 24 h（氧化破壞）。然后，分別按照 1.2.4 專屬性項(xiàng)下自制品溶液配制方法操作（其中強(qiáng)氧化破壞樣品中加入溶劑 9 ml，強(qiáng)酸和強(qiáng)堿破壞樣品中加入溶劑 8 ml，其余破壞樣品中均加入溶劑 10 ml），分別作為相應(yīng)破壞條件的自制品溶液。

原研品和空白輔料各破壞條件溶液的配制方法與自制品相應(yīng)破壞條件的溶液相同。

精密量取上述溶液各 20 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

1.2.6 線性與范圍 取鹵米松對(duì)照品適量，加溶劑溶解并稀釋制成適當(dāng)濃度的主成分對(duì)照品溶液；分別取雜質(zhì) A、C、F、G、J、K 對(duì)照品，加溶劑溶解并稀釋制成系列濃度的各雜質(zhì)對(duì)照品溶液。取各溶液 20 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以濃度 C（μg/ml）為橫坐標(biāo)，以峰面積 A 為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，求出線性方程。

1.2.7 定量限與檢測(cè)限 取上述線性與范圍項(xiàng)下各溶液，以溶劑逐步稀釋，精密量取 20 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按峰高約為基線噪音10 倍和 3 倍分別作為定量限（S/N ≥ 10）和檢測(cè)限（S/N ≥ 3）。

1.2.8 精密度

⑴重復(fù)性：按照專屬性項(xiàng)下方法分別配制自制品溶液和自制品自身對(duì)照溶液。按照專屬性項(xiàng)下空白輔料溶液配制方法，僅將其中 10 ml 溶劑 2 替換為 1 ml 混合雜質(zhì)對(duì)照品貯備液 2（25 μg/ml）+9 ml 溶劑 2，制得混合雜質(zhì)對(duì)照品溶液。分別精密量取上述溶液各 20 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以 6 份自制品溶液中雜質(zhì)含量（采用加校正因子的自身對(duì)照法計(jì)算）的 RSD 考察方法的重復(fù)性。

⑵中間精密度：不同操作人員采用不同儀器于不同日期照重復(fù)性項(xiàng)下方法進(jìn)行自制品溶液（6 份）和自制品自身對(duì)照溶液的配制。以 12 份自制品中雜質(zhì)含量（采用加校正因子的自身對(duì)照法計(jì)算）的 RSD 考察方法的中間精密度。

1.2.9 準(zhǔn)確度 按“1.2.8 精密度”中“重復(fù)性”項(xiàng)下方法，配制混合雜質(zhì)對(duì)照品溶液。向鹵米松乳膏自制品中分別加入“1.2.4 專屬性”項(xiàng)下所述混合雜質(zhì)對(duì)照品貯備液 2（25 μg/ml）適量，按自制品溶液配制方法操作，制備成含各已知雜質(zhì)限度量的 50%、100%、150% 濃度的溶液，作為回收率供試品溶液。分別精密量取該回收率供試品溶液各 0.5 ml，置 50 ml 量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為回收率自身對(duì)照溶液。

精密量取上述溶液各 20 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按加校正因子的自身對(duì)照法計(jì)算回收率。

1.2.10 溶液穩(wěn)定性 照專屬性項(xiàng)下方法配制自制品溶液，于室溫條件下放置，在 0、4、8、12、24、36、48 h 分別量取 20 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以各已知雜質(zhì)、單雜、總雜含量變化及雜質(zhì)峰個(gè)數(shù)考察自制品溶液穩(wěn)定性。

1.2.11 耐用性

⑴校正因子耐用性：考察了更換不同色譜柱（色譜柱 1、2、3）以及微調(diào)柱溫（33、35、37 ℃），流速（0.75、0.8、0.9 ml/min），檢測(cè)波長(zhǎng)（236、238、240 nm），流動(dòng)相初始比例（流動(dòng)相 A:B 分別為63:37、65:35、67:33）等條件，對(duì)校正因子結(jié)果的影響。

⑵方法耐用性：考察了更換不同色譜柱（色譜柱 1、2、3）以及微調(diào)柱溫（33、35、37 ℃），流速（0.75、0.8、0.9 ml/min），檢測(cè)波長(zhǎng)（236、238、240 nm），流動(dòng)相初始比例（流動(dòng)相 A:B 分別為63:37、65:35、67:33）等條件，對(duì)系統(tǒng)分離情況和雜質(zhì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

1.2.12 樣品有關(guān)物質(zhì)檢測(cè) 采用上述經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的有關(guān)物質(zhì)檢查方法，對(duì)鹵米松乳膏 3 批自制品和 2 批原研品進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 專屬性

由專屬性試驗(yàn)結(jié)果（圖2 和表3）可知：溶劑和空白輔料對(duì)測(cè)定無(wú)干擾；主峰與相鄰雜質(zhì)峰之間，以及各已知雜質(zhì)峰與相鄰峰之間均能很好分離；靈敏度溶液中，主成分峰高信噪比 ＞ 10；自制品中檢出雜質(zhì) C、雜質(zhì) F 和雜質(zhì) J；原研品中檢出雜質(zhì) C、雜質(zhì) F 和雜質(zhì) G；自制品中加入混合雜質(zhì)對(duì)照品后，相應(yīng)雜質(zhì)位置檢出雜質(zhì)峰。結(jié)果表明，自制品與原研品雜質(zhì)譜基本一致，本方法專屬性良好。

表3 鹵米松乳膏有關(guān)物質(zhì)檢查專屬性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of specificity test of halomethasone ointment

圖2 鹵米松乳膏有關(guān)物質(zhì)檢查專屬性試驗(yàn)色譜圖（A：溶劑 1；B：空白輔料溶液；C：系統(tǒng)適用性溶液；D：靈敏度溶液；E：自制品溶液；F：自制品+混合雜質(zhì)對(duì)照品溶液；G：原研品溶液）Figure 2 Chromatograms of specificity test of halomethasone ointment (A: Solvent 1; B: Blank excipient solution; C: System suitability solution; D: Sensitivity solution; E: Self-made preparation solution; F: Self-made preparation + mixed impurities reference solution; G: Reference preparation solution)

2.2 干擾性

由干擾性測(cè)定結(jié)果（代表性圖譜見(jiàn)圖3）可知，空白輔料在各條件下破壞后，對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。各破壞條件下的自制品和原研品經(jīng)二極管陣列（PDA）檢測(cè)器測(cè)定主峰純度，均為單一峰。自制品和原研品對(duì)強(qiáng)酸破壞基本穩(wěn)定，對(duì)強(qiáng)堿破壞極不穩(wěn)定，在其他破壞條件下不穩(wěn)定。具體如下：

高溫破壞條件下，自制品雜質(zhì) G、J、F、C、其他單個(gè)最大雜質(zhì)和總雜質(zhì)均有所增加；原研品雜質(zhì) G、F、C 及總雜質(zhì)有所增加。光照破壞條件下，自制品和原研品的雜質(zhì) G、F 及總雜質(zhì)均稍有增加。紫外光照條件下，自制品雜質(zhì) A 和總雜質(zhì)有所增加；原研品雜質(zhì) F、A 和總雜質(zhì)有所增加。強(qiáng)酸破壞條件下，自制品僅總雜質(zhì)稍有增加；原研品僅雜質(zhì) G 和總雜質(zhì)稍有增加。強(qiáng)堿破壞條件下，自制品和原研品雜質(zhì) G、J、F 均稍有增加，均出現(xiàn)新的未知雜質(zhì)峰（自制品在 RRT 0.54 和 RRT 0.56 處，原研品在 RRT 0.55 和 RRT 0.57 處），總雜質(zhì)均明顯增加。氧化破壞條件下，自制品雜質(zhì)J 稍有增加，原研品總雜質(zhì)稍有增加。

破壞前后物料平衡率計(jì)算結(jié)果表明，各破壞條件下，破壞前后物料守恒（物料平衡率在 93.9% ～103.4% 之間）。可見(jiàn)，本方法干擾性符合相關(guān)規(guī)定。

由于空白輔料在各破壞條件下對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，原研品與自制品在各破壞條件下結(jié)果類似，因此圖3中僅列出自制品未破壞和各破壞條件下色譜圖。

圖3 鹵米松乳膏有關(guān)物質(zhì)檢查干擾性試驗(yàn)色譜圖（A：空白輔料溶液；B：自制品溶液；C：原研品溶液；D：高溫破壞；E：光照破壞；F：紫外光照破壞；G：強(qiáng)酸破壞；H：強(qiáng)堿破壞；I：氧化破壞）Figure 3 Chromatograms of interference test of halomethasone ointment (A: Blank excipient solution; B: Self-made preparation solution; C: Reference preparation solution; D: High temperature damaged; E: Light damaged; F: Ultraviolet light damaged; G:Strong acid damaged; H: Strong alkali damaged; I: Strong oxidants damaged)

2.3 線性與范圍

線性與范圍測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。主成分鹵米松有兩個(gè)線性方程，其中方程 1 對(duì)應(yīng)有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)時(shí)供試品濃度的線性，方程 2 對(duì)應(yīng)限度濃度范圍的線性。

表4 鹵米松及各有關(guān)物質(zhì)線性方程Table 4 Linear equation of halomethasone and various related substances by HPLC

結(jié)果表明，主成分鹵米松與各已知雜質(zhì)（雜質(zhì)A、C、F、G、J、K）在上述濃度范圍內(nèi)，濃度與峰面積線性相關(guān)系數(shù)r均 ≥ 0.9992，各雜質(zhì)和主峰的截距/限度濃度峰面積均 ＜ 10%，各峰響應(yīng)因子RSD 均 ＜ 10%。因此各雜質(zhì)濃度與峰面積線性關(guān)系均良好。

2.4 定量限與檢測(cè)限

由表5 可見(jiàn)，0.0032% 的雜質(zhì) A、0.0013% 的雜質(zhì) C、0.0009% 的雜質(zhì) F、0.0019% 的雜質(zhì) G、0.0017% 的雜質(zhì) J、0.0018% 的雜質(zhì) K 均能被有效檢出；鹵米松的檢測(cè)限相當(dāng)于供試品溶液主成分濃度的 0.003%，表明 0.003% 的未知雜質(zhì)能被有效檢出?？梢?jiàn)鹵米松及各雜質(zhì)檢測(cè)限完全滿足鹵米松乳膏有關(guān)物質(zhì)檢查標(biāo)準(zhǔn)限度的要求。

表5 鹵米松及各有關(guān)物質(zhì)定量限和檢測(cè)限Table 5 Limit of quantitation and detection of halomethasone and various related substances by HPLC

2.5 精密度

2.5.1 重復(fù)性 鹵米松乳膏有關(guān)物質(zhì)重復(fù)性結(jié)果表明：6 份自制品中均未檢出雜質(zhì) G 和雜質(zhì) K，均在 RRT 約 1.64 處檢出最大單雜，檢出的已知雜質(zhì) A、C、F、J、最大單雜及總雜含量的 RSD 分別為 4.48%、3.19%、2.20%、1.59%、6.90%、2.42%，均小于 10%?？梢?jiàn)本方法重復(fù)性良好。

2.5.2 中間精密度 鹵米松乳膏有關(guān)物質(zhì)中間精密度結(jié)果表明：12 份自制品中均未檢出雜質(zhì) G 和K，均在 RRT 約 1.64 處檢出最大單雜；檢出的已知雜質(zhì) C、F、J、最大單雜及其總雜含量的 RSD 分別為 2.61%、3.71%、3.36%、5.29%、3.04%，均小于 10.0%；雜質(zhì) A 含量 RSD 為 17.23%，極差小于限度的 20%（限度為 0.5%）。表明本方法中間精密度良好。

2.6 準(zhǔn)確度

準(zhǔn)確度結(jié)果（表6）表明：在 50%、100% 和150% 限度濃度下，制劑中各雜質(zhì)回收率均在 92% ～105% 之間；各濃度下各雜質(zhì)回收率 RSD 均小于5.0%?？梢?jiàn)本方法各雜質(zhì)回收率較高，準(zhǔn)確度良好。

表6 鹵米松乳膏有關(guān)物質(zhì)檢查準(zhǔn)確度結(jié)果Table 6 Accuracy of various related substances in halomethasone ointment by HPLC

2.7 溶液穩(wěn)定性

溶液穩(wěn)定性結(jié)果表明，室溫條件下放置 48 h，各時(shí)間點(diǎn)自制品溶液中各雜質(zhì)均無(wú)明顯變化，均未檢出雜質(zhì) G 和雜質(zhì) K，雜質(zhì) A、C、F、J、最大單雜和總雜含量的 RSD 分別為 8.21%、1.47%、2.27%、0.82%、8.39%、2.95%，均小于 10%，說(shuō)明室溫條件下放置溶液穩(wěn)定性良好。

2.8 耐用性

2.8.1 校正因子耐用性試驗(yàn)結(jié)果 更換色譜柱以及微調(diào)柱溫、流速、檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相初始比例的條件下，各已知雜質(zhì)和主成分鹵米松的濃度與峰面積線性關(guān)系均良好；不同條件下各雜質(zhì)校正因子的RSD 均小于 10.0%。結(jié)果表明本方法校正因子耐用性良好。

2.8.2 方法耐用性試驗(yàn)結(jié)果 更換色譜柱以及微調(diào)柱溫、流速、檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相初始比例的條件下，系統(tǒng)適用性溶液中各峰間分離度均大于 1.5，系統(tǒng)適用性試驗(yàn)?zāi)陀眯粤己?；供試品中均未檢出雜質(zhì) G 和雜質(zhì) K，檢出的已知雜質(zhì) A、C、F、J 和最大單雜及總雜含量 RSD 均小于 10%；在微調(diào)柱溫和流動(dòng)相比例后，雜質(zhì)的相對(duì)保留時(shí)間稍有變化，因此，在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中采用雜質(zhì)對(duì)照品配制系統(tǒng)適用性溶液進(jìn)行雜質(zhì)的定位。結(jié)果表明本方法耐用性良好。

2.9 樣品有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)

對(duì)鹵米松乳膏 3 批自制品和 2 批原研品進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 鹵米松乳膏有關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果Table 7 Result of the related substances in halomethasone ointment

由上述結(jié)果可知，鹵米松乳膏自制品和原研品雜質(zhì)譜基本一致，各批次自制品和原研品中各已知雜質(zhì)、其他最大單個(gè)雜質(zhì)和總雜質(zhì)含量均在規(guī)定限度內(nèi)，說(shuō)明各批次樣品有關(guān)物質(zhì)均符合所訂質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定。

3 討論

本文參考了鹵米松乳膏國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)下對(duì)單個(gè)雜質(zhì)及總雜質(zhì)的限度規(guī)定，并結(jié)合自制鹵米松乳膏所用原料藥的合成路線、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及制劑處方工藝條件和降解路徑，對(duì)鹵米松乳膏的雜質(zhì)譜進(jìn)行了全面系統(tǒng)的研究。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步完善了鹵米松乳膏有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)條件，建立了本文所述的有關(guān)物質(zhì)檢查方法。

國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)中鹵米松乳膏有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)下，并未規(guī)定已知雜質(zhì)采用自身對(duì)照法計(jì)算雜質(zhì)含量；而本研究中對(duì)多個(gè)已知雜質(zhì)進(jìn)行了規(guī)定，且采用加校正因子的自身對(duì)照法計(jì)算各已知雜質(zhì)含量，使雜質(zhì)定量更為準(zhǔn)確。

本研究中干擾性試驗(yàn)顯示鹵米松乳膏自制品和原研品在強(qiáng)堿、高溫、光照及氧化條件下均不穩(wěn)定，可降解出雜質(zhì) A、C、F、G、J，因此將這幾種已知雜質(zhì)納入鹵米松乳膏有關(guān)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中。雜質(zhì)K 為鹵米松原料藥的工藝雜質(zhì)，在鹵米松乳膏干擾性試驗(yàn)和影響因素試驗(yàn)中并未降解產(chǎn)生，因此，雖在方法學(xué)驗(yàn)證中對(duì)其進(jìn)行研究，但未將其納入制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中。此外，鹵米松原料藥的工藝雜質(zhì)還包括雜質(zhì) D（中間體 2）、雜質(zhì) B（中間體 2 的工藝副產(chǎn)物）、雜質(zhì) E（中間體 3）、雜質(zhì) H（氟米松）、雜質(zhì) I（中間體 1），這些雜質(zhì)在鹵米松乳膏干擾性和影響因素試驗(yàn)中均不會(huì)降解產(chǎn)生，且在原料藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中已進(jìn)行規(guī)定，因此鹵米松乳膏有關(guān)物質(zhì)方法中不再進(jìn)行相關(guān)研究，僅在方法學(xué)驗(yàn)證過(guò)程中的系統(tǒng)適用性溶液中加入，以確保制劑中如果引入這些工藝雜質(zhì)，在所建立的色譜條件下能夠有效分離并檢出。

綜上所述，本文建立了鹵米松乳膏有關(guān)物質(zhì)檢查的 HPLC 法，并進(jìn)行了全面系統(tǒng)的方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果表明，該法專屬性良好，干擾性符合相關(guān)規(guī)定，各已知雜質(zhì)濃度-峰面積之間的線性關(guān)系良好，方法精密度、準(zhǔn)確度和耐用性均良好，可用于簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)鹵米松乳膏中的有關(guān)物質(zhì)。

采用該法對(duì)鹵米松乳膏 3 批自制品和 2 批原研品進(jìn)行了有關(guān)物質(zhì)檢查，結(jié)果表明，自制品和原研品雜質(zhì)譜基本一致，自制品中各已知雜質(zhì)、單個(gè)未知雜質(zhì)和總雜質(zhì)均低于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的限度。