張麗芬，田曜愷

(1北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院腎病科,北京 100029;2廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,廣州510006)

衰老是一個不可避免的自然規(guī)律，然而衰老的過程是可以延緩的。正如《黃帝內(nèi)經(jīng)》中上古名醫(yī)歧伯與黃帝在對話中說“夫道者能卻老而全形，身年雖壽，能生子也?！薄吧瞎庞姓嫒苏?，提挈天地，把握陰陽，呼吸精氣，獨(dú)立守神，肌肉若一，故能壽敝天地，無有終時?！敝赋龅玫篮瓦_(dá)到真人的境界可以卻老，可以壽敝天地[1]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，抗氧化和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能是抗衰老和治療衰老性疾病的有效方法。中醫(yī)藥化痰除濕法在臨床上應(yīng)用廣泛，在治療糖尿病、腎臟病、脾胃病、血管癡呆、心腦血管病、高脂血癥及動脈硬化等多種老年性疾病中配合化痰除濕中藥療效良好，但其作用機(jī)制未明。本實驗以D-半乳糖復(fù)制經(jīng)典大鼠衰老模型，觀察化痰除濕湯干預(yù)后衰老大鼠血清總抗氧化力(total antioxidation capacity,T-AOC)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、脂質(zhì)過氧化物(lipid peroxide,LPO)和胸腺皮質(zhì)內(nèi)上皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，探討化痰除濕湯抗衰老分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究材料

1.1.1 動物 健康純種Wistar大鼠40只，一級動物，雌雄各20只，體質(zhì)量130～170 g，購自天津藥物研究院動物室(動物生產(chǎn)合格證號：98004)。

1.1.2 藥物制備與試劑 (1)化痰除濕湯：由陳皮、半夏、茯苓及蒼術(shù)等組成(由天津中醫(yī)藥大學(xué)門診部藥劑科提供并鑒定)。生藥先以7倍量蒸餾水浸泡2 h后煎煮40 min取濾液，再加5倍量的冷蒸餾水煎煮30 min取濾液，合并2次藥液濃縮至生藥含量為2 g/ml，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?2)維生素E膠丸(天津市中央制藥二廠出品，批號：981210)：用針刺破膠丸,擠出維生素E(vitamin E，VitE),用稱量瓶取6 g,加入吐溫-80 1.2 g，攪拌均勻，然后逐次加入適量蒸餾水并攪拌均勻，使之成為乳狀，最后稀釋至200 ml(含吐溫-80為0.6%)。(3)D-半乳糖(批號：980922，上海試劑二廠)：用生理鹽水配成制成5%溶液備用。T-AOC試劑盒由英國Randox公司提供；LPO檢測試劑盒和LDH檢測試劑盒均由上海長征公司提供。

1.1.3 儀器 754分光光度計、960MC熒光分光光度計和離心機(jī)均由上海第三分析儀器廠生產(chǎn)；Opera全自動生化分析儀由德國Bayer公司生產(chǎn)；Philips EM 400ST電鏡由天津南開大學(xué)電鏡室提供。

1.2 方法

1.2.1 模型制備及分組給藥 衰老大鼠模型制備參照《抗衰老研究實驗方法》[2]。40只一級Wistar大鼠適應(yīng)性普通飼料喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)取30只大鼠每日頸背皮下注射D-半乳糖溶液48 mg/kg，連續(xù)注射40 d。余10只作為正常對照組，每日頸背皮下注射等體積的生理鹽水。造模組大鼠隨機(jī)分為衰老組、化痰除濕組及陽性對照組。于造模第1天起，化痰除濕組每日灌胃化痰除濕湯水煎劑20 g/(kg·d)，陽性對照組每日灌胃維生素E溶液0.3 g/(kg·d)，衰老組和正常對照組每日灌胃等體積蒸餾水。體質(zhì)量增長率=(體質(zhì)量41 d-體質(zhì)量0 d)/體質(zhì)量0 d。

1.2.2 血液標(biāo)本采集和血清制備 實驗第41天，股動脈取血1.5 ml,離心取血清，-70 ℃凍存待檢。

1.2.3 血清T-AOC、LDH、LPO檢測 血清T-AOC用英國Randox公司試劑盒(Control No.NX2331，Lot No.091 NX)檢測,原理為以固體過氧化物為底物，在變性肌球蛋白(metamyoglobin)的觸酶作用下，生成新生態(tài)氧，與2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽作用生成藍(lán)綠色；測定A600 nm。在加入標(biāo)本時，血漿的抗氧化力可阻抑此反應(yīng)，使呈色減弱。血清LDH應(yīng)用酶動力法，用Bayer公司Opera全自動生化分析儀檢測；血清LPO應(yīng)用硫代巴比妥酸比色定量法檢測。

1.2.4 胸腺皮質(zhì)電鏡標(biāo)本取材和制備 大鼠頸椎脫臼法處死后，迅速剪開胸腔，取胸腺皮質(zhì)切成1 mm×1 mm×1 mm小塊固定于2% 戊二醛固定液中，反復(fù)洗滌后用1%鋨酸溶液作后固定，酒精系列脫水，環(huán)氧樹脂包埋。LKB-V型超薄切片機(jī)切片，醋酸鈾與檸檬酸鉛雙重染色，作電鏡觀察攝片。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般狀態(tài)觀察

正常對照組大鼠毛色白而有光澤、耳色紅潤、活動靈敏、精神狀態(tài)佳、食量及飲水量正常。衰老組大鼠毛色漸趨枯槁，沒有光澤、易脫落、精神萎靡、倦怠嗜睡、群體喜扎堆及進(jìn)食量減少；2個治療組大鼠上述表現(xiàn)較衰老模型組好轉(zhuǎn)。

2.2 化痰除濕湯對衰老大鼠體質(zhì)量的影響

實驗0、14、28、41 d稱取每只大鼠體質(zhì)量,結(jié)果顯示，實驗前各組大鼠體質(zhì)量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05);實驗14、28、41 d各組大鼠體質(zhì)量均有明顯增長，化痰除濕組體質(zhì)量增長率較其他3組略低，但各組間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05；表1)。

2.3 化痰除濕湯對衰老大鼠血清T-AOC、LDH及LOP水平影響

治療第41天，與正常對照組比較，衰老組大鼠血清T-AOC水平顯著降低，血清LDH、LPO水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)。與衰老組比較，化痰除濕組和陽性對照組血清T-AOC水平均升高，血清LDH水平顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；化痰除濕組血清LPO水平顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；陽性對照組血清LPO水平也有降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與陽性對照組比較，化痰除濕組血清T-AOC水平顯著較高，血清LPO水平顯著較低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)；2治療組血清LDH比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05；表2)。

表2 化痰除濕湯對衰老大鼠血清T-AOC、LHD及LPO影響

2.4 化痰除濕湯對衰老模型大鼠胸腺皮質(zhì)超微結(jié)構(gòu)的影響

2.4.1 正常對照組 胸腺皮質(zhì)上皮細(xì)胞形體大，多突起，細(xì)胞核較大，沿核周邊有薄層異染色質(zhì)，分布均勻；胞質(zhì)內(nèi)線粒體豐富而完整，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)也較發(fā)達(dá)(圖1A)；胸腺皮質(zhì)可見較多的淋巴細(xì)胞，細(xì)胞連接緊密，幾乎沒有間隙，淋巴細(xì)胞呈圓形或橢圓形，細(xì)胞核大，約為細(xì)胞體積的4/5，細(xì)胞核居中，染色質(zhì)分布均勻，核仁清楚；胞質(zhì)少，胞質(zhì)內(nèi)可見線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富(圖2A)。

圖1 電子顯微鏡觀察各組大鼠胸腺上皮細(xì)胞Figure 1 Thymus epithelial cells of all groups under electromicroscopeA: normal control group(×7 000); B: aging group(×7 000); C: decoction group(×7 000); D: positive control group(×14 500).

2.4.2 衰老組 胸腺皮質(zhì)上皮細(xì)胞核膜間隙擴(kuò)張，細(xì)胞核固縮變形，核內(nèi)電子致密物增多，核染色質(zhì)呈斑塊狀和條索狀凝集。胞質(zhì)內(nèi)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器減少，溶酶體增多，細(xì)胞邊界不清(圖1B)。胸腺皮質(zhì)淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞間隙明顯增大，正常連接受損。細(xì)胞核固縮，核膜間隙增大，可見凋亡細(xì)胞胞體皺縮和電子密度較高的凋亡小體存在；胞質(zhì)內(nèi)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器減少(圖2B)。

2.4.3 化痰除濕組 胸腺皮質(zhì)上皮細(xì)胞核形態(tài)基本正常，核染色質(zhì)凝集，核膜間隙增大，線粒體結(jié)構(gòu)基本完整,周圍可見形態(tài)基本正常的淋巴細(xì)胞(圖1C)；胸腺皮質(zhì)淋巴細(xì)胞損傷較模型組減輕，淋巴細(xì)胞數(shù)量較模型組增多，胞質(zhì)內(nèi)線粒體等細(xì)胞器較模型組豐富(圖2C)。

圖2 電子顯微鏡觀察各組大鼠胸腺淋巴細(xì)胞Figure 2 Thymus lymphocytes of all groups under electromicroscope(×7 000)A: control group; B: aging group; C: decoction group; D: positive control group.

2.4.4 陽性對照組 胸腺皮質(zhì)上皮細(xì)胞核染色質(zhì)呈斑塊狀分布不均勻，核內(nèi)電子致密物增多；胞漿內(nèi)可見線粒體，但線粒體腫脹，空泡化，胞漿空泡化(圖1D)。胸腺皮質(zhì)淋巴細(xì)胞損傷較模型組減輕，淋巴細(xì)胞數(shù)量較模型組增多，胞質(zhì)內(nèi)線粒體等細(xì)胞器較模型組豐富。細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，可見凋亡小體、溶酶體和脂褐素(圖2D)。

3 討 論

衰老是腫瘤、動脈粥樣硬化性心血管病、血管性癡呆、腦卒中、高血壓、慢性阻塞性肺病、糖尿病、腎臟病、血脂異常和神經(jīng)功能退化疾病等疾病的獨(dú)立危險因素[3，4]。中醫(yī)在防治衰老性疾病中總結(jié)了豐富的經(jīng)驗?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》十三方中，治療內(nèi)科性疾病10個方劑中有6個方劑有除濕化痰飲作用,以蘭草湯、半夏湯和澤瀉白術(shù)湯為代表。痰濕是冠心病、心律失常、高血壓、高脂血癥[5]、腫瘤[6]、慢性腎臟病[8]、癡呆[9]及慢性阻塞性肺病[10]等多種老年性疾病的主要病機(jī)和證型。故有“百病都由痰作祟”之說?？梢娞禎裰虏〉膹V泛性和古人祛病延年重視除痰濕的治療思想?；党凉駵怯啥悳推轿干⒒枚鴣?二陳湯和平胃散均來源北宋神宗元豐年間(1078-1085)成書的《太平惠民和劑局方》，可以調(diào)脾胃，化宿食，消痰飲，除寒、濕、風(fēng)、冷[11]。臨床用于治療痰飲濕濁引起的多種慢性病和老年性疾病有良好療效。

本研究中體質(zhì)量指標(biāo)顯示化痰除濕組大鼠體質(zhì)量及體質(zhì)量增長率低于其他3組,與既往研究相符合[12,13],認(rèn)為化痰除濕湯可能有治療肥胖作用。

T-AOC代表體內(nèi)酶性和非酶性抗氧化物的總水平，可直接反應(yīng)機(jī)體抗氧化能力[14]。LDH存在于機(jī)體所有組織細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，隨著細(xì)胞的破壞、細(xì)胞膜通透性增加可釋放入血。細(xì)胞受損和機(jī)體缺血缺氧越重LDH越高[15]。LDH是機(jī)體病理損傷、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的標(biāo)志。因此，血液中的LDH水平常常作為炎癥[16]、腫瘤[17]、糖尿病[18]、高血壓[19]、心肌缺血[20]、心力衰竭[21]及肺血栓栓塞[22]等疾病的嚴(yán)重程度預(yù)測指標(biāo)，也可以作為疲勞的檢測指標(biāo)[23]。LPO是人體內(nèi)多聚不飽和脂肪酸和氧自由基結(jié)合后的產(chǎn)物，LPO水平升高，可以引起細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸、糖類和脂類過氧化，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不可逆轉(zhuǎn)的改變，最終造成免疫功能失調(diào)、蛋白質(zhì)變性及血栓形成等，與人體疾病如冠心病、心肌梗死、肝硬化、肝癌、肺心病、支氣管哮喘、阿爾茨海默病、帕金森氏病及慢性腎病等多種疾病均有關(guān)系。通過抗脂質(zhì)氧化治療，減少LPO水平，可以降低LPO對組織及器官的損傷[24]。維生素E的抗衰老研究開始較早，研究表明其可以抗自由基和抗氧化,并能提高人體免疫力，從而具有抗衰老作用。因此本研究中以維生素E作為陽性對照藥物。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，衰老模型大鼠血清T-AOC顯著下降，而LDH和LPO明顯增加。與衰老模型組比較，化痰除濕組血清T-AOC明顯升高，LDH、LPO明顯下降，并且在升高T-AOC和降低LPO方面優(yōu)于維生素E。說明化痰除濕湯可以提高衰老大鼠抗氧化能力，減輕氧化損傷，減少脂質(zhì)過氧化物的聚積，有延緩衰老作用。

機(jī)體的衰老與免疫系統(tǒng)功能有密切的關(guān)系，80%以上疾病與免疫失調(diào)相關(guān)[25]。免疫功能的水平,比年齡能更準(zhǔn)確地預(yù)測壽命[26]。胸腺是免疫系統(tǒng)的中樞器官，與壽命相關(guān)。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明，胸腺萎縮，功能減退，機(jī)體也隨之衰老，疾病叢生。胸腺內(nèi)還有自然殺傷細(xì)胞，專門消滅癌細(xì)胞。增加T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞，可以延緩機(jī)體衰老、祛病延年[27]。胸腺上皮細(xì)胞可以調(diào)節(jié)T細(xì)胞在胸腺內(nèi)分化發(fā)育、成熟的過程，減少使自身反應(yīng)性T細(xì)胞輸出，從而預(yù)防自身免疫反應(yīng)的發(fā)生[28]。本研究發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，衰老組胸腺皮質(zhì)中上皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞結(jié)構(gòu)明顯破壞，細(xì)胞核皺縮變形，胞質(zhì)內(nèi)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器明顯減少，溶酶體增多；化痰除濕組和陽性對照組胸腺皮質(zhì)中上皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞較衰老組增多，細(xì)胞結(jié)構(gòu)較衰老組明顯改善。

綜上，本研究證明化痰除濕湯可顯著提高機(jī)體抗氧化力，降低氧化損傷、減少脂質(zhì)過氧化物，增加胸腺皮質(zhì)中上皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量，保護(hù)細(xì)胞形態(tài)和線粒體超微結(jié)構(gòu)。化痰除濕湯有干預(yù)性抗衰老和提高免疫作用。