楊苗，李英，郭建剛，任海潮，許子怡，李會(huì)平，3

(1 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，河北 保定 071000；2 河北霧靈山國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理中心，河北 承德 067300；3 河北省城市森林健康技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 保定 071000)

美國白蛾(Hyphantriacunea)屬鱗翅目燈蛾科，又稱秋幕毛蟲、網(wǎng)幕毛蟲等，原產(chǎn)于北美洲，是一種外來入侵有害生物，因具有食性雜、繁殖量大、危害嚴(yán)重等特點(diǎn)，被列為重大林業(yè)有害生物[1]。自1979年美國白蛾在我國遼寧省首次發(fā)現(xiàn)，到2020年已危及到我國13個(gè)省級(jí)，598個(gè)縣級(jí)行政區(qū)[2]。目前防治美國白蛾的方法主要有化學(xué)防治、生物防治、生態(tài)防治、人工防治等[3-6]。研究表明農(nóng)藥制劑0.5% 藜蘆堿 WP 對(duì)美國白蛾幼蟲具有良好的致死效果，濃度為10 mg/L藜蘆堿 WP 在施用3 d后美國白蛾幼蟲達(dá)到死亡高峰期[7]。劉子歡等研究了蘇云金桿菌對(duì)美國白蛾的生長發(fā)育影響[8]。李建等試驗(yàn)12種殺蟲劑對(duì)美國白蛾幼蟲的室內(nèi)毒力測(cè)定[9]。但長期使用化學(xué)農(nóng)藥易導(dǎo)致害蟲產(chǎn)生抗藥性，生物防治能有效控制美國白蛾種群數(shù)量，同時(shí)對(duì)環(huán)境安全，是一種維持生態(tài)平衡和實(shí)現(xiàn)可持續(xù)控制美國白蛾的無公害防治措施，因而越來越得到公眾的認(rèn)可和重視[10-11]。

白僵菌屬是目前研究和應(yīng)用于害蟲生物防治最廣泛的一類昆蟲病原真菌，其殺蟲范圍達(dá)700多種，具有致病性強(qiáng)，應(yīng)用范圍廣，對(duì)環(huán)境無明顯污染等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛運(yùn)用于二斑葉螨、煙粉虱和薊馬等農(nóng)林害蟲防治[12-15]。在適宜的條件下，白僵菌分生孢子萌發(fā)后能通過表皮進(jìn)入寄主體腔，產(chǎn)生有毒代謝物導(dǎo)致寄主死亡最終侵入寄主器官，穿出體壁重新產(chǎn)生孢子[16]。目前對(duì)利用寄生菌防治美國白蛾已有不少報(bào)道，如劉永清等篩選出對(duì)美國白蛾致病力達(dá)94.2 %(孢子濃度為1×109孢子/mL)的高致病性球孢白僵菌Bb11，覃豐全等從22株球孢白僵菌菌株中篩選出高致病力的球孢白僵菌菌株FD，并進(jìn)行初步野外防治試驗(yàn)，取得良好防治效果[17-18]。李會(huì)平等測(cè)定來自不同寄主和生境的白僵菌對(duì)美國白蛾的致病力，研究了應(yīng)用白僵菌防治美國白蛾的潛力[19]。但白僵菌侵染美國白蛾的掃描電鏡觀察及其對(duì)美國白蛾卵和不同齡期幼蟲致病性的系統(tǒng)研究還未見報(bào)道。因此，本研究以球孢白僵菌Bb09菌株為研究對(duì)象，采用掃描電鏡觀察其對(duì)美國白蛾幼蟲的致病過程，利用噴霧法研究其對(duì)美國白蛾卵及不同齡期幼蟲的毒力效果，為今后利用球孢白僵菌防治美國白蛾提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

球孢白僵菌Bb09菌株分離自染病柞蠶僵體，并用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)培養(yǎng)和純化，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院林木病理實(shí)驗(yàn)室提供。

供試美國白蛾卵塊采自唐山市灤南縣國有林場(chǎng)，將卵塊置于Φ 9 cm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至孵化幼蟲(培養(yǎng)皿中放置濕棉球，以保證卵發(fā)育時(shí)所需濕度)，將孵化出的幼蟲置于500 mL燒杯中，用新鮮毛白楊葉片進(jìn)行喂養(yǎng)至不同齡級(jí)。

1.2 方法

1.2.1 球孢白僵菌Bb09孢子懸浮液的制備 將分離得到的球孢白僵菌Bb09接種于PDA平板上，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行產(chǎn)孢培養(yǎng)至分生孢子成熟，用0.5‰ 吐溫-80無菌水在無菌條件下將培養(yǎng)成熟的球孢白僵菌分生孢子沖洗到無菌燒杯中，置于磁力攪拌器上均勻打散，配成球孢白僵菌Bb09孢子懸浮液。之后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，根據(jù)現(xiàn)有濃度，用0.5‰ 吐溫-80溶液稀釋成1×104孢子/mL、1×105孢子/mL、1×106孢子/mL、1×107孢子/mL、1×108孢子/mL以備用。

1.2.2 球孢白僵菌Bb09侵染美國白蛾幼蟲的電鏡觀察 挑取45頭3齡幼蟲，用滅菌小毛筆蘸取無菌水輕輕掃拭幼蟲表面后，用手持小噴壺將濃度為1×108孢子/mL的孢子懸浮液均勻噴于幼蟲表面。將處理后的美國白蛾幼蟲置于250 mL燒杯中于室溫條件下用新鮮毛白楊葉片進(jìn)行喂養(yǎng)。分別于接種后6 h、12 h、18 h、24 h、36 h、48 h、72 h、130 h、192 h進(jìn)行取樣處理，以備掃描電鏡觀察使用。

樣品經(jīng)2.5%戊二醛進(jìn)行48 h固定處理，磷酸緩沖液沖洗4次，10 min/次，以保證固定液沖洗完全。1%鋨酸固定2 h，后用30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%酒精進(jìn)行逐級(jí)脫水，每級(jí)30 min，以乙酸異戊酯置換酒精，30 min/次，共2次。臨界點(diǎn)干燥(臨界點(diǎn)干燥儀型號(hào)：LEICA EM CPD 030)，銀膠黏銅臺(tái)噴金(離子濺射儀型號(hào)：MCIOOO Ion Sputter)，置于掃描電子顯微境 (SU8010)下進(jìn)行觀察、拍照。

1.2.3 球孢白僵菌Bb09對(duì)美國白蛾的致病性 用手持小噴壺將不同濃度(1×104～1×108孢子/mL)的孢子懸浮液分別均勻接種美國白蛾卵、1、2、3、4、5、6齡幼蟲，接種后卵及幼蟲分別置于室溫條件下進(jìn)行保濕培養(yǎng)，并以新鮮毛白楊葉片飼喂各齡幼蟲，逐日觀察，計(jì)算卵的孵化率及各齡幼蟲的死亡率。將死亡各齡幼蟲置于干凈載玻片上，放于培養(yǎng)皿中于25 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)行保濕培養(yǎng)，觀察蟲體上是否有球孢白僵菌長出，并作為判斷是否由球孢白僵菌侵染致死的依據(jù)。以0.5‰ 吐溫-80無菌水作對(duì)照。每個(gè)處理重復(fù)3次。對(duì)卵的致病力測(cè)定，每個(gè)處理接種100粒卵，對(duì)各齡幼蟲的致病力測(cè)定，每個(gè)處理接種30頭幼蟲。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 根據(jù)生物測(cè)定數(shù)據(jù)，分別計(jì)算不同處理卵的孵化率和幼蟲的死亡率，并以Abbott公式進(jìn)行校正，即：

(1)

(2)

(3)

采用SPSS 19.0 軟件對(duì)卵和不同齡期幼蟲的致病力進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，同時(shí)運(yùn)用DPS軟件中時(shí)間—?jiǎng)┝俊劳雎誓Ｐ?TDM)對(duì)1～3齡幼蟲的累計(jì)死亡率進(jìn)行進(jìn)一步分析(注：當(dāng)對(duì)照死亡率<5%時(shí)可忽略不計(jì))。

2 結(jié)果與分析

2.1 球孢白僵菌Bb09侵染美國白蛾幼蟲的電鏡觀察

將處理后不同時(shí)間的美國白蛾3齡幼蟲置于掃描電鏡下(SU8010)觀察。結(jié)果如圖1所示。

圖1 球孢白僵菌在美國白蛾幼蟲體表的生長過程Figure 1 Growth process of B. bassiana on the surface of H.cunea larvae

由圖1可知，6 h后，白僵菌孢子成功附著在美國白蛾蟲體表面，主要以蟲體表面節(jié)間褶皺(a)、棘狀突起(b)及剛毛基部側(cè)面氣孔部位(c)為主，而美國白蛾頭部(d)及剛毛部位附著孢子較少(e)；接種18 h后，孢子開始萌發(fā)，長出芽狀突起(f，g)；24 h后，隨著時(shí)間的增加，萌發(fā)的孢子數(shù)量不斷增加(h)；接種36 h后，有些芽管指向表皮生長，末端表現(xiàn)出侵入趨勢(shì)(i)，有些則直接侵入(j)；分生孢子在接種后的48～72 h內(nèi)進(jìn)入萌發(fā)生長活躍期，在侵入體壁之前，部分芽管會(huì)在體表平行生長，遇到合適侵入點(diǎn)便進(jìn)行入侵，也有部分孢子萌發(fā)形成菌絲后再由合適侵入點(diǎn)侵入(k，l)；130 h后，蟲體表面布滿白色菌絲(m)；192 h體表菌絲形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并長出新的分生孢子束(n，o)。

(a) 卵

(b) 1齡幼蟲

(c) 2齡幼蟲

(d) 3齡幼蟲

(e) 4齡幼蟲

(f) 5齡幼蟲

(g) 6齡幼蟲圖2 不同濃度球孢白僵菌Bb09孢子懸浮液下美國白蛾卵及幼蟲逐日累計(jì)死亡率Figure 2 The daily accumulative mortality of the eggs and larvae of H.cunea after treatment with different spore suspension of B.Bassiana Bb09

2.2 球孢白僵菌Bb09對(duì)美國白蛾的致病性

2.2.1 球孢白僵菌Bb09對(duì)美國白蛾卵及不同齡期幼蟲致病力 美國白蛾卵的孵化情況及不同齡期幼蟲死亡情況見圖2。

由圖2可知，球孢白僵菌Bb09對(duì)美國白蛾卵的致病力極差，接種7 d后，各濃度下美國白蛾卵的累計(jì)孵化率均達(dá)到了90%以上。但球孢白僵菌Bb09對(duì)美國白蛾不同齡期幼蟲均表現(xiàn)出不同的致病力。同一濃度下，其致病力隨著蟲齡的增加而減小；同一齡期美國白蛾幼蟲的死亡率隨著孢子濃度的減小而減小。如3齡幼蟲在濃度為1×108孢子/mL、1×107孢子/mL、1×106孢子/mL、1×105孢子/mL、1×104孢子/mL孢子懸浮液下第7天的累計(jì)死亡率分別達(dá)到 87.78%、70.00%、62.22%、42.22%、26.67%。綜合分析表明白僵菌Bb09對(duì)美國白蛾1、2、3齡幼蟲的致病力較好，4齡次之，齡期越小，白僵菌孢子懸浮液的致病力越大且各個(gè)濃度下的累計(jì)死亡率差異越大。

2.2.2 球孢白僵菌Bb09對(duì)不同齡期美國白蛾幼蟲的致死中濃度 美國白蛾各齡幼蟲的致死中濃度對(duì)數(shù)值見表1。由于5齡幼蟲和6齡幼蟲多數(shù)死亡率未達(dá)到50%，所以未對(duì)5齡，6齡幼蟲進(jìn)行LD50計(jì)算。

表1 球孢白僵菌Bb09對(duì)各齡美國白蛾幼蟲的致死中濃度對(duì)數(shù)值Table 1 Logarithmic value of the median lethal dose of B.Bassiana Bb09 on different larvae of H.cunea

由表1可知，同齡期幼蟲在接種不同天數(shù)后的LD50對(duì)數(shù)值隨著時(shí)間的增加而不斷減少，毒力作用不斷增加；在同一作用天數(shù)下隨著幼蟲齡期的增加LD50對(duì)數(shù)值逐漸增加。接種后第2天、第3天只有1、2齡幼蟲實(shí)際算出LD50，而對(duì)3、4齡幼蟲的致死劑量效應(yīng)值LD50理論上可計(jì)算，但會(huì)高于1、2齡幼蟲的實(shí)際致死對(duì)數(shù)值，實(shí)際應(yīng)用意義不大。

2.2.3 球孢白僵菌Bb09對(duì)不同齡期美國白蛾幼蟲的致死中時(shí) 球孢白僵菌Bb09對(duì)不同齡期美國白蛾幼蟲的致死時(shí)間效應(yīng)見表2。由于1×104孢子/mL孢子懸浮液濃度下各齡期幼蟲死亡率均未達(dá)到50%，1×105孢子/mL 除1齡幼蟲外其他齡期幼蟲的死亡率均未達(dá)到50%，所以對(duì)濃度為1×105孢子/mL、1×104孢子/mL的孢子懸浮下各齡期幼蟲LT50未進(jìn)行計(jì)算。

表2 同一孢子懸浮液濃度下球孢白僵菌Bb09對(duì)美國白蛾幼蟲的致死中時(shí)Table2 The median lethal time of the same spore suspension of B.Bassiana Bb09 on larvae of H.cunea

由表2可知，隨著孢子懸浮液濃度的增大，同齡幼蟲的致死中時(shí)(LT50)縮短。在1×104～1×108孢子/mL范圍內(nèi)，1齡幼蟲的LT50值由3.93下降到1.32。在相同濃度下，隨著幼蟲齡期的增加其LT50值也逐漸升高，1×108孢子/mL下，5齡幼蟲的LT50為6.29，而1齡幼蟲僅為1.32。球孢白僵菌Bb09對(duì)5齡、6齡幼蟲的致病力較差。

2.2.4 球孢白僵菌Bb09對(duì)不同齡期美國白蛾幼蟲TDM模型分析 以上結(jié)果表明球孢白僵菌Bb09對(duì)美國白蛾1～3齡幼蟲表現(xiàn)出良好致病力。為探討劑量效應(yīng)與時(shí)間效應(yīng)之間的相互關(guān)系，用TDM (時(shí)間—?jiǎng)┝俊劳雎?模型對(duì)測(cè)得的球孢白僵菌Bb09對(duì)美國白蛾1～3齡幼蟲的毒力測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行下一步分析,更好反映菌株應(yīng)用潛力。測(cè)定的TDM模型各參數(shù)估計(jì)結(jié)果見表3。

表3 球孢白僵菌Bb09對(duì)美國白蛾1～3齡幼蟲的TDM模型模擬與參數(shù)估計(jì)Table 3 Parameters estimated by fitting the time-dose-mortality (TDM)model to assay data of B.Bassiana Bb09 against the 1～3 instars larvae of H.cunea

由從表3可知，根據(jù)美國白蛾1、2、3齡幼蟲劑量效應(yīng)的斜率β來看，2齡幼蟲對(duì)孢子懸浮液濃度的變化最為敏感，β值為0.515 9。不同蟲齡下τj值隨作用時(shí)間的增加而增加，試驗(yàn)后期增加幅度減小，說明幼蟲的累計(jì)死亡率受到劑量與時(shí)間雙重因素的影響，在試驗(yàn)后期美國白蛾幼蟲的死亡率呈逐漸上升趨勢(shì)并趨于穩(wěn)定。各處理劑量與時(shí)間效應(yīng)參數(shù)的t測(cè)驗(yàn)值均達(dá)到極顯著水平(P<0.000 1),說明供試球孢白僵菌Bb09菌株的劑量效應(yīng)與時(shí)間效應(yīng)極顯著。在條件死亡概率模型中，γi最大值出現(xiàn)的天數(shù)與試驗(yàn)中所觀察到的死亡高峰期相吻合。

各齡期所建TDM模型均通過Hosmer-Lemeshow擬合異質(zhì)性檢驗(yàn)，所建各處理模型均不存在異質(zhì)性,能夠無偏描述各濃度下球孢白僵菌孢子懸浮液與美國白蛾幼蟲死亡率的相互作用關(guān)系。

2.2.5 球孢白僵菌Bb09對(duì)不同齡期美國白蛾幼蟲致死作用的劑量效應(yīng) 關(guān)于白僵菌Ba09對(duì)美國白蛾1～3齡幼蟲的致死劑量對(duì)數(shù)值見圖3。

(a)1齡幼蟲

(b)2齡幼蟲

(c)3齡幼蟲

由圖3可知，根據(jù)TDM模型估計(jì)出球孢白僵菌Bb09侵染不同齡期幼蟲不同時(shí)間的劑量效應(yīng)。隨著試驗(yàn)后接種天數(shù)的增加，LD50、LD90的劑量對(duì)數(shù)值不斷減少，劑量效應(yīng)不斷增強(qiáng)。球孢白僵菌Bb09對(duì)1、2、3齡幼蟲的劑量效應(yīng)在試驗(yàn)接種后的前4 d變化較明顯，說明這期間各齡期幼蟲的死亡率變化較大，之后趨于平穩(wěn)。由于3齡幼蟲在接種3 d時(shí)未出現(xiàn)大量死亡，累積死亡未達(dá)到90%，所以模型估計(jì)的LD50，LD90偏大。

2.2.6 球孢白僵菌Bb09對(duì)不同齡期美國白蛾幼蟲致死時(shí)間效應(yīng) 球孢白僵菌Bb09對(duì)不同齡期美國白蛾幼蟲致死作用的時(shí)間效應(yīng)見表4。

表4 球孢白僵菌Bb09對(duì)美國白蛾1～3齡幼蟲的LT50和LT90Table 4 The values of LT50 and LT90 for B.Bassian Bb09 against the 1～3 instars larvae of H.cuneaa

由表4可知，1、2、3齡幼蟲的LT50值與孢子懸浮液濃度呈反比，即隨著孢子懸浮液濃度的增加，各齡期LT50值減少。LT90值只有1、2齡幼蟲在1×108孢子/ mL高濃度孢子懸浮液下才能達(dá)到，分別為3.97 d、4.88 d。以上結(jié)果表明1齡幼蟲致死所需時(shí)間最短。

3 討論與結(jié)論

通過觀察被球孢白僵菌Bb09侵染的美國白蛾體表特征，并詳細(xì)分析其致病性，利用TDM模型分析時(shí)間與劑量之間的相互作用，為防治美國白蛾提供依據(jù)。本研究在觀察球孢白僵菌Bb09對(duì)美國白蛾侵入過程中發(fā)現(xiàn)，分生孢子在美國白蛾體表的附著、萌發(fā)、侵入等過程存在時(shí)間和狀態(tài)上的不同。有的孢子在表面萌發(fā)較快，有的較慢，有的孢子萌發(fā)后即可侵入，有的則在體表進(jìn)行平行生長遇到合適的侵入點(diǎn)再侵入，出現(xiàn)這些現(xiàn)象的原因可能與美國白蛾體表結(jié)構(gòu)、特殊部位的物質(zhì)含量有關(guān)。這和前人的研究有很大的相似性，王音等發(fā)現(xiàn)綠僵菌孢子侵染小菜蛾前的生長狀態(tài)與小菜蛾體表形狀存在著關(guān)系[20]；本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌分生孢子以芽管或菌絲形式入侵美國白蛾表皮，這和前人研究結(jié)果稍有不同。這可能和美國白蛾幼蟲體表營養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)，當(dāng)寄主表皮分泌的營養(yǎng)物質(zhì)利于孢子生長時(shí)，孢子便可萌發(fā)形成芽管或生長為菌絲。

真菌侵染宿主卵的研究報(bào)道相對(duì)較少，在已有少數(shù)研究報(bào)道中發(fā)現(xiàn)，真菌對(duì)卵侵染力大小也存著較大差異性。如彭軍測(cè)定了球孢白僵菌對(duì)朱砂葉螨卵的侵染率達(dá)到50%[21]；Shi等研究發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌對(duì)害螨卵的侵染毒力則達(dá)67.4%[22]；本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌Bb09對(duì)美國白蛾卵無致病力。分析原因可能是因?yàn)楦采w在蟲卵表面的雌蛾鱗片阻礙了芽管的穿透；也可能是蟲卵表面所特有的保護(hù)結(jié)構(gòu)或分泌物質(zhì)阻礙或抑制了孢子的萌發(fā)、侵染。但試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)菌液侵染卵雖未大量死亡，遺留于卵體表或培養(yǎng)皿上的白僵菌孢子對(duì)剛孵化幼蟲仍具有侵染致病力，這就為林間實(shí)際應(yīng)用提供了參考，可在卵孵化后期進(jìn)行防治，這對(duì)控制美國白蛾幼蟲的后期繁殖數(shù)量意義重大。

通過致病性測(cè)定發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌Bb09對(duì)美國白蛾1～3齡幼蟲的毒力較好，在1×108孢子/mL高濃度下， 1～3齡幼蟲累計(jì)死亡率均高達(dá)90%左右。通過TDM模型分析球孢白僵菌Bb09對(duì)美國白蛾1～3齡幼蟲的毒力，2齡幼蟲對(duì)球孢白僵菌Bb09孢子懸浮液濃度變化的敏感度最高。模型分析同時(shí)考慮了時(shí)間和劑量之間的相互效應(yīng)，體現(xiàn)生物特定的完整性和客觀性。雖然室內(nèi)測(cè)定表明球孢白僵菌對(duì)美國白蛾具有很好的防治效果，但為更好的在實(shí)際中應(yīng)用，可以進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶镩g試驗(yàn)，并可嘗試和一些植物源農(nóng)藥進(jìn)行相容性研究，為今后防治美國白蛾提供更好更環(huán)保的方法。