王子夜，張海劍，路曉月，王瑞東，王志剛，閻愛(ài)華

(1河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，河北 保定 071000；2河北省林木種質(zhì)資源和森林保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071000；3河北省農(nóng)林科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，河北 保定 071000；4河北省農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治工程技術(shù)研究中心，河北 保定 071000；5農(nóng)業(yè)部華北北部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071000; 6河北省城市森林健康技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 保定 071000)

球孢白僵菌(Beauveriabassiana)是重要的昆蟲(chóng)病原真菌，其宿主范圍廣、特異性高、安全性好，在農(nóng)林害蟲(chóng)生物防治中具有良好的應(yīng)用前景。作為生防制劑的主要成分，分生孢子能否在不良環(huán)境脅迫下大量宿存、成功萌發(fā)、高效侵入是決定球孢白僵菌(B.bassiana)防治效果的關(guān)鍵[1-3]。空氣相對(duì)濕度是昆蟲(chóng)病原真菌應(yīng)用的限制性環(huán)境因子之一，RH90%～100%是分生孢子萌發(fā)最適濕度，很少昆蟲(chóng)病原真菌菌株能在低于RH70%的濕度下萌發(fā)[4-5]。探明不同濕度對(duì)白僵菌萌發(fā)的作用機(jī)理，對(duì)于拓展白僵菌的菌種資源，增強(qiáng)對(duì)害蟲(chóng)的防治效果，擴(kuò)大生防制劑的應(yīng)用范圍具有重要意義。

對(duì)白僵菌-昆蟲(chóng)-環(huán)境三者的相互作用機(jī)制已經(jīng)有大量研究，隨著分子生物學(xué)、高通量測(cè)序技術(shù)等廣泛應(yīng)用，海藻糖酶(Beauveriabassiananeutral trehalase，BbNTH1)基因、特異性生長(zhǎng)抑制蛋白(Growth arrest specific protein，GAS1)基因、熱激蛋白70(Heat shock protein，HSP70)基因、絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPK)同源基因slt2和hog1等與白僵菌附著、侵入釘形成、定殖和產(chǎn)孢相關(guān)的一系列信號(hào)傳導(dǎo)、抗逆和形態(tài)建成等功能相關(guān)的基因被克隆和鑒定[6-11]。作為真菌生長(zhǎng)發(fā)育的起始階段，與萌發(fā)相關(guān)基因和調(diào)控機(jī)制的報(bào)道還很少[12-13]。本研究通過(guò)構(gòu)建不同空氣相對(duì)濕度下白僵菌菌株萌發(fā)差異表達(dá)基因(Differently expressed genes,DEGs)轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)，通過(guò)基因通路富集和功能注釋，挖掘可能參與白僵菌低濕萌發(fā)的差異基因及其功能和代謝過(guò)程，為球孢白僵菌的進(jìn)一步廣泛應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)，也為了解其他蟲(chóng)生生防菌萌發(fā)功能基因研究提供了重要線索。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試球孢白僵菌(B.bassiana)菌株WA采自河北省保定市，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林木病蟲(chóng)害無(wú)公害防控實(shí)驗(yàn)室分離自光肩星天牛(Anoplophoraglabripennis)僵蟲(chóng)并進(jìn)行保存。在薩式培養(yǎng)基(葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，酵母膏10 g，瓊脂20 g/L )上28 ℃活化培養(yǎng)15 d，收集分生孢子。

1.2 不同相對(duì)空氣濕度分生孢子萌發(fā)率測(cè)定與文庫(kù)樣品采集

采用小容器空氣濕度調(diào)節(jié)法測(cè)定空氣相對(duì)濕度對(duì)白僵菌孢子萌發(fā)的影響，在2個(gè)口徑210 mm玻璃密閉干燥器中分別注入滅菌飽和NaCl溶液和滅菌水，構(gòu)建RH75%和RH100%的小空間氣候室。載玻片上覆蓋玻璃紙，將20 μL分生孢子懸浮液(約1.03×107個(gè)/mL)滴在玻璃紙上，迅速風(fēng)干后置于密閉小空間氣候室，25 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后取下玻璃紙，鏡檢記錄觀察分生孢子萌發(fā)率和芽管長(zhǎng)度。同時(shí)大量收集不同處理分生孢子，液氮速凍，在零下80 ℃下保存，用于文庫(kù)構(gòu)建。樣品分別命名為WA_75和WA_100，以未經(jīng)處理且未萌發(fā)分生孢子為對(duì)照，命名為WA_S。

1.3 cDNA文庫(kù)構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組序列測(cè)定

cDNA文庫(kù)構(gòu)建由諾和致源生物信息技術(shù)有限公司完成，獲得的序列在 Illumina HiSeqTM2000測(cè)序儀進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。測(cè)序所得的原始片段(Raw reads)經(jīng)過(guò)過(guò)濾，得到純凈片段(Clean reads)。純凈片段經(jīng)Trinity軟件進(jìn)行Denovo 從頭合成拼接，組裝去冗余后得到Unigenes進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4 差異表達(dá)Unigenes數(shù)據(jù)注釋與分析

差異Unigenes的表達(dá)豐度用FPKM值表示[q value<0.05 & |log2(fold change)|>1]，序列信息分別在Nr數(shù)據(jù)庫(kù)、NT數(shù)據(jù)庫(kù),Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)、COG數(shù)據(jù)庫(kù)和GO數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)和檢索，獲得與Unigenes對(duì)應(yīng)的蛋白功能注釋及功能分類(lèi)統(tǒng)計(jì)。差異基因表達(dá)熱圖采用歐易云在線軟件(https://cloud.oebiotech.com)進(jìn)行。

1.5 差異表達(dá)基因?qū)崟r(shí)熒光定量檢測(cè)

為驗(yàn)證不同濕度白僵菌萌發(fā)轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)構(gòu)建質(zhì)量，以白僵菌18SrRNA基因?yàn)閮?nèi)參基因，隨機(jī)挑選了文庫(kù)中5個(gè)DEGs序列，用Probegene設(shè)計(jì)RT-qPCR引物(表1)，驗(yàn)證差異基因表達(dá)趨勢(shì)[14]。按照材料與方法1.2收集萌發(fā)的WA孢子，經(jīng)過(guò)RNA提取并反轉(zhuǎn)錄各樣品的cDNA，每處理3個(gè)重復(fù)，按2-ΔΔCt相對(duì)定量法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 RT-qPCR引物Table 1 RT-qPCR primers

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS 17.0進(jìn)行單因素ANOVA檢驗(yàn)分析，滿足P<0.05,再進(jìn)行方差分析和多重比較，并用Origin 2021軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濕度下菌株萌發(fā)情況測(cè)定

不同濕度下菌株萌發(fā)情況測(cè)定，見(jiàn)圖1。

圖1 不同空氣相對(duì)濕度下分生孢子萌發(fā)率和萌發(fā)芽管平均長(zhǎng)度

如圖1所示，WA菌株具有較強(qiáng)的耐低濕萌發(fā)能力，在RH100%和RH75%時(shí)，菌株WA的分生孢子萌發(fā)率和萌發(fā)芽管長(zhǎng)度沒(méi)有顯著差異(P<0.05)。

2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析與注釋

各樣品數(shù)據(jù)質(zhì)量分析，見(jiàn)表2。

表2 樣品數(shù)據(jù)質(zhì)量分析Table 2 Summery of sample sequence data output quality

如表2所示，WA_S、WA_100和WA_75轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估去除不可靠數(shù)據(jù)后，3個(gè)樣品各獲得純凈片段為43 016 924條，44 723 918條和43 537 642條，Q30達(dá)到92%以上，錯(cuò)配率控制在1%以下，堿基A、T、C和G之間沒(méi)有明顯的偏差。組裝的轉(zhuǎn)錄本和Unigene平均長(zhǎng)度分別為547 bp和445 bp，測(cè)序和Unigene的拼接質(zhì)量較好。序列分別在Nr、GO、KOG、Swiss-Prot、KEGG、Nt 6個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋，共注釋到89 903個(gè)Unigenes，其中27 786個(gè)Unigenes可以注釋到至少1個(gè)文庫(kù)中，數(shù)據(jù)庫(kù)成功匹配率達(dá)到50.43%。

2.3 不同空氣相對(duì)濕度下不同菌株DEGs分析

差異基因韋恩圖分析，見(jiàn)圖2。

圖2 差異基因韋恩圖分析Figure 2 Representing and Venn diagram of DEGs in response to different humidity

如圖2所示，與未萌發(fā)孢子相比，不同空氣相對(duì)濕度下WA菌株DEGs數(shù)量如圖，WA_75與WA_S共有差異表達(dá)基因767個(gè)，其中上調(diào)342個(gè)，下調(diào)425個(gè)，WA_100與WA_S共有差異表達(dá)基因822個(gè)，上調(diào)400個(gè)，下調(diào)422個(gè)。393個(gè)DEGs在WA_75與WA_S和WA_100與WA_S中共同表達(dá)，其中上調(diào)114個(gè)，下調(diào)279個(gè)。

2.4 分生孢子萌發(fā)差異表達(dá)基因GO注釋結(jié)果

差異最顯著30條GO功能注釋通路，見(jiàn)圖3。

如圖3所示，不同濕度下孢子萌發(fā)差異表達(dá)基因在GO文庫(kù)注釋到細(xì)胞組分(Cellular component，CC)，生物進(jìn)程(Biological process，BP)，分子功能(Molecular function，MF)3個(gè)大類(lèi)44個(gè)亞類(lèi)。與未萌發(fā)的孢子相比，不同濕度條件下萌發(fā)孢子的DEGs在氧化還原進(jìn)程(Oxidation-reduction process)、真菌細(xì)胞壁組分(Fungal-type cell wall)、核糖體合成(Ribosome biogenesis)等亞類(lèi)中顯著富集(圖3-a、圖3-b)，而與WA_100相比，WA_75差異基因功能差異顯著(圖3-c)，主要集中在BP大類(lèi)中，在單羧酸代謝進(jìn)程(Monocarboxylic acid metabolic process，65)，分解代謝進(jìn)程(Catabolic process，72)，有機(jī)物分解代謝進(jìn)程(Organic substance catabolic process，65)，有機(jī)酸代謝進(jìn)程(Organic acid metabolic process，107)，酮酸代謝進(jìn)程(Oxoacid metabolic process，106)等方面差異顯著，MF大類(lèi)中異檸檬酸裂解酶活性(Isocitrate lyase activity，7)差異顯著(P<0.05)。

注：A是WA_75與WA_S；B是WA_100與WA_S；C是WA_75與WA_100。

2.5 分生孢子萌發(fā)差異表達(dá)基因KEGG通路富集分析

WA_75與WA_100差異DEGs富集最多的20條KEGG通路，見(jiàn)圖4。

圖4 WA_75與WA_100差異DEGs富集最多的20條KEGG通路Figure 4 WA_75vsWA_100 differential DEGs enriched the 20 most KEGG pathways

如圖4所示，利用超幾何檢驗(yàn)獲得差異基因顯著富集的Pathway，確定不同基因間互作參與的生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。文庫(kù)中共有23 549條DEGs注釋到KEGG代謝通路中，分為細(xì)胞過(guò)程(Cellular processes)，環(huán)境信息處理(Environmental information processing)，遺傳信息處理(Genetic information processing)，代謝(Metabolism)，有機(jī)系統(tǒng)(Organismal systems) 5大類(lèi)20個(gè)亞類(lèi)297條代謝途徑。與WA_100相比，WA_75中365條差異DEGs富集，富集顯著的前20條通路，在糖酵解與糖代謝(Glycolysis / Gluconeogenesis，31)，賴氨酸降解(Lysine degradation，12)，果糖與甘露糖代謝(Fructose and mannose metabolism，10)，酪氨酸代謝(Tyrosine metabolism，11)，甘油酯代謝(Glycerolipid metabolism，9)等方面數(shù)量最多(P<0.05)。

2.6 分生孢子萌發(fā)差異基因表達(dá)模式分析

2.6.1 呼吸作用相關(guān)基因 呼吸作用相關(guān)基因表達(dá)模式，見(jiàn)圖5。

圖5 呼吸作用相關(guān)基因表達(dá)模式Figure 5 Expression patterns of respiration related DEGs

如圖5所示，在有氧條件下，白僵菌萌發(fā)時(shí)呼吸作用劇烈，聚類(lèi)分析結(jié)果表明，氧化磷酸化相關(guān)基因在WA_75和WA_100中表達(dá)模式相似，但ATP 合成酶(ATP synthase)、NADH脫氫酶(NADH dehydrogenase，NADH-CoQ)、琥珀酸脫氫酶(Succinate dehydrogenase，SDH)、NADH-泛醌氧化還原酶(NADH-ubiquinone oxidoreductase，NDH)和細(xì)胞色素c氧化酶(Cytochromecoxidase，COX)相關(guān)序列在WA_75中上調(diào)。

2.6.2 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白激酶基因表達(dá)模式分析 蛋白激酶基因表達(dá)模式分析，見(jiàn)圖6。

圖6 蛋白激酶基因表達(dá)模式分析Figure 6 Expression patterns of protein kinase

如圖6所示，蛋白激酶催化蛋白磷酸化，是多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要環(huán)節(jié)。聚類(lèi)熱圖分析表明，低濕萌發(fā)過(guò)程中，WA_75文庫(kù)中大量絲氨酸和蘇氨酸蛋白激酶基因表達(dá)上調(diào)，包括BR激酶(BR Serine/threonine-protein kinase,BRSK)、DBF20激酶(Serine/threonine-protein kinase，DBF20)、GCN2激酶(Serine/threonine-protein kinase，GCN2)、鈣依賴性蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinases,CDPKs)、生發(fā)中心激酶(Germinal center kinase，GCKs)、酪蛋白激酶I(Casein kinase I，CKI)；磷酸肌醇3激酶(Phosphoinositide 3-kinase，PK3)、二酰甘油激酶(Diacylglycerol kinase)等；參與細(xì)胞周期調(diào)控的MPS1激酶(Serine/threonine-protein kinase，MPS1)、plo1激酶、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(Cyclin-dependent kinase，CDKs)、雷帕霉素靶蛋白(TOR)激酶等。

2.7 差異表達(dá)基因的實(shí)時(shí)熒光定量驗(yàn)證

DEGs表達(dá)量的差異變化，見(jiàn)圖7。

圖7 DEGs表達(dá)量的差異變化Figure 7 Changes of DEGs expression

如圖7所示，利用qRT-PCR技術(shù)驗(yàn)證隨機(jī)挑選的5個(gè)DEGs表達(dá)量的差異，各基因FPKM值和相對(duì)表達(dá)量雖然在變化程度上有差異，但不同基因均呈上升趨勢(shì)。細(xì)胞壁脅迫響應(yīng)組份蛋白(WSC domain-containing protein)、假定泛素蛋白連接酶(Putative RING-H2 finger protein)和Zn (II)2Cys6鋅簇蛋白[Zn (II)2Cys6 transcription factor]的FPKM值變化程度較大，鋅指和BTB結(jié)構(gòu)域蛋白(Zinc finger and BTB domain-containing protein)和假定泛素蛋白連接酶(Putative RING-H2 finger protein)FPKM值變化程度較?。患俣ㄍ馇芯哿姿崦赶鄬?duì)表達(dá)量變化程度最大，其他4個(gè)基因變化差異較小。

3 討論與結(jié)論

盡管溫度、光照、濕度都被認(rèn)為是影響孢子萌發(fā)的關(guān)鍵環(huán)境因素，但實(shí)踐應(yīng)用證明，濕度是限制白僵菌使用范圍和效果的決定性因子[15]。本研究中球孢白僵菌孢子在不同濕度下萌發(fā)時(shí)都有大量差異基因表達(dá)。分生孢子生理活性狀態(tài)由自身的養(yǎng)分狀況決定，完全成熟的分生孢子在靜止?fàn)顟B(tài)時(shí)仍存在轉(zhuǎn)錄活性，能夠感受環(huán)境條件以進(jìn)行主動(dòng)的萌發(fā)決策[16]。利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)探討球孢白僵菌孢子在不同空氣濕度條件下萌發(fā)差異基因表達(dá)模式，不僅可以揭示白僵菌相應(yīng)水分脅迫的調(diào)控機(jī)制，而且為蟲(chóng)生真菌進(jìn)一步擴(kuò)大應(yīng)用研究提供了良好的切入點(diǎn)。

侵染早期基因表達(dá)模式的差異是導(dǎo)致球孢白僵菌不同菌株致病性差異的原因，Wang等研究表明毒力與白僵菌的粘附、角質(zhì)層降解相關(guān)功能基因的高表達(dá)密切相關(guān)[17]。萌發(fā)出芽管是真菌生長(zhǎng)發(fā)育的開(kāi)端，是菌落形態(tài)建成中第一個(gè)重大變化，在本研究中，不同濕度下孢子萌發(fā)時(shí)氧化還原進(jìn)程，真菌細(xì)胞壁組份合成和蛋白質(zhì)翻譯進(jìn)程被顯著富集，為白僵菌快速萌發(fā)提供物質(zhì)基礎(chǔ)。同時(shí)，比WA_100，不利的水分條件WA_75抑制了有機(jī)氮化物、一元羧酸和氨基酸代謝進(jìn)程等，但增強(qiáng)了對(duì)自身營(yíng)養(yǎng)和資源的利用效率。單羧酸代謝進(jìn)程、有機(jī)物分解代謝進(jìn)程、有機(jī)酸代謝進(jìn)程、酮酸代謝進(jìn)程等相關(guān)生物學(xué)進(jìn)程基因表達(dá)活躍，在不利條件下維持正常萌發(fā)。這個(gè)結(jié)果與紅色毛癬菌(Trichophytonrubrum)的萌發(fā)過(guò)程相似[18]。

在這種萌發(fā)策略下，提高孢子產(chǎn)能利用效率極為重要，與糖酵解與糖代謝，賴氨酸代謝，果糖與甘露糖代謝，酪氨酸代謝,甘油酯代謝等途徑相關(guān)的基因均被顯著富集。糖類(lèi)是最重要的生物大分子之一，不僅是細(xì)胞壁的組成成分，生命體重要的產(chǎn)能物質(zhì)，還廣泛參與生命體對(duì)溫度、水分、鹽分、紫外光和磷脅迫等非生物脅迫。對(duì)禾谷鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和馬鈴薯粉痂菌(Spongosporasubterranea)轉(zhuǎn)錄組研究都表明真菌萌發(fā)時(shí)糖代謝活性變化十分劇烈[13,19]。在本研究中，低濕萌發(fā)的孢子果糖與甘露糖代謝顯著增強(qiáng)，糖酵解/糖異生代謝途徑的關(guān)鍵酶pfkA、PGK和PK基因全部上調(diào)表達(dá)，通過(guò)一系列酶促反應(yīng)，催化單糖產(chǎn)生ATP和丙酮酸，為孢子萌發(fā)提供能量。有氧條件下，ATP合酶、NADH-CoQ、SDH、NDH和COX等呼吸作用關(guān)鍵酶基因進(jìn)一步上調(diào)表達(dá)，通過(guò)呼吸作用徹底氧化丙酮酸為二氧化碳和水，并釋放能量，增強(qiáng)了水分與能量的供給。

WA_75文庫(kù)中有大量絲氨酸和蘇氨酸蛋白激酶基因表達(dá)上調(diào)，通過(guò)復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)感受環(huán)境變化，對(duì)細(xì)胞的代謝和轉(zhuǎn)錄進(jìn)行多靶向多層次調(diào)控，保證低濕萌發(fā)細(xì)胞活動(dòng)的有序進(jìn)行。本研究中發(fā)現(xiàn)的MPS1激酶是一種MAP-kinase，該基因喪失影響細(xì)胞壁完整性，CDKs、plo1激酶、DBF20激酶參與調(diào)控酵母等真核生物細(xì)胞有絲分裂等細(xì)胞周期活動(dòng)，二酰甘油激酶家族(DGKs)調(diào)節(jié)脂肪代謝中甘油二酯和磷脂酸之間的平衡，在小麥抗脅迫鹽中起到了重要作用[20-22]。GCN2激酶(GCN2)是蛋白質(zhì)代謝關(guān)鍵調(diào)控因子，在細(xì)胞缺乏營(yíng)養(yǎng)時(shí)調(diào)節(jié)氨基酸的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，維持細(xì)胞存活[23]。鈣依賴性蛋白激酶(CDPKs)通過(guò)對(duì)逆境早期鈣信號(hào)的感應(yīng)和傳導(dǎo)，廣泛參與生物對(duì)非生物脅迫抗逆性反應(yīng)[24]。酪蛋白激酶I(CKI)廣泛分布在各種類(lèi)型的細(xì)胞中，參與膜轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞周期、染色體分離、細(xì)胞凋亡等生命活動(dòng)，有報(bào)道該激酶在水稻根系發(fā)育和激素調(diào)節(jié)中起到重要作用[25]。磷脂酰肌醇3-激酶和雷帕霉素靶蛋白(PI3K/mTOR)信號(hào)通路是免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，能量缺乏、營(yíng)養(yǎng)不足、環(huán)境脅迫均可刺激該通路的信號(hào)傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝，調(diào)控細(xì)胞凋亡[26]。

本研究采用RNA-Seq 技術(shù)分別構(gòu)建了球孢白僵菌WA菌株(B.bassianaWA)未萌發(fā)分生孢子、相對(duì)濕度100%和相對(duì)濕度75%萌發(fā)分生孢子轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)WA_S、WA_100，WA_75，序列生物信息學(xué)分析結(jié)果表明：與WA_S相比，WA_100和WA_75孢子萌發(fā)過(guò)程中分別有822個(gè)和767個(gè)差異表達(dá)基因(DEGs)；經(jīng)GO功能富集分析，WA_75與WA_100的差異DEGs集中在單羧酸代謝進(jìn)程(65)，分解代謝進(jìn)程(72)，有機(jī)物分解代謝進(jìn)程(65)，有機(jī)酸代謝進(jìn)程(107)，酮酸代謝進(jìn)程(106)等方面；KEGG功能富集在糖酵解與糖代謝(31), 賴氨酸代謝(12)，果糖與甘露糖代謝(10)，酪氨酸代謝(11),甘油酯代謝(9)等途徑。與WA_100相比，WA_75大量參與糖酵解、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的絲蘇氨酸蛋白激酶基因表達(dá)上調(diào)。本研究為闡明球孢白僵菌孢子耐低濕萌發(fā)的機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。