周健，杜克久，才滿(mǎn)

(1河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，河北 保定 071000;2河北林木種質(zhì)資源與森林保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071000)

隨著環(huán)境污染和生態(tài)破壞，土壤污染問(wèn)題日趨嚴(yán)重，其中重金屬污染以及有機(jī)污染物的土壤面積在不斷增加，使土壤肥力退化，降低農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)和產(chǎn)量，并通過(guò)食物鏈危及人類(lèi)的生命健康[1]。重金屬鎘(Cd)被廣泛應(yīng)用于塑料穩(wěn)定劑、橡膠等產(chǎn)品的加工和制造，全球土壤中Cd的平均含量約為0.41 mg/ kg，在一些地區(qū)達(dá)到2.0～8.9 mg/kg[2-5]。研究表明高濃度的Cd2+處理抑制了煙草葉綠素的合成，葉綠素含量和光合強(qiáng)度隨Cd含量的上升而逐漸下降[6]。較低濃度的Cd對(duì)人體就有顯著生物毒性,過(guò)量積累會(huì)導(dǎo)致腎功能不全、骨質(zhì)疏松和癌癥等疾病[7]。鉻(Cr)一般通過(guò)自然活動(dòng)進(jìn)入環(huán)境，大氣中Cr含量很低，僅為0.4 μg/m3，淡水中Cr的濃度0.1～117 mg/L，，有研究發(fā)現(xiàn)土壤中高濃度的Cr可顯著降低小麥和高粱的種子萌發(fā)[8]。Cr同樣可通過(guò)食物鏈在人體內(nèi)富集，引發(fā)癌癥和其它疾病[9]。除重金屬外，有機(jī)污染物也是備受關(guān)注的環(huán)境污染物，笨并芘被世界衛(wèi)生組織認(rèn)定為三大致癌物之一，在我國(guó)6大類(lèi)地區(qū)土壤中均被檢測(cè)出，其中東北、華北地區(qū)質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過(guò)1 500 μg/kg[10-12]。有研究顯示PAHs對(duì)植物的毒害效應(yīng)與PAHs的濃度呈正相關(guān)[13]。多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)作為環(huán)境 持久性有機(jī)污染物也具有較高的環(huán)境本底，我國(guó)廣東貴嶼土壤中PBDEs污染物的含量為0.26～824 ng/g，PBDEs毒理學(xué)及生物修復(fù)研究亦備受關(guān)注[15-17]。4-溴帶聯(lián)苯醚(4-bromodiphenyl ether，BDE-3)作為多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)脫溴反應(yīng)的終產(chǎn)物之一，多被用于PBDEs的環(huán)境行為及生物修復(fù)研究。 PBDEs及其衍生物可顯著抑制植物的種子萌發(fā)和幼苗的生長(zhǎng)，誘發(fā)植物細(xì)胞膜質(zhì)過(guò)氧化[18-19]。植物修復(fù)技術(shù)利用綠色植物與相關(guān)的微生物來(lái)降低環(huán)境中潛在污染物的毒性，是目前修復(fù)重金屬和有機(jī)污染物污染的重要研究方向[20-21]。目前有關(guān)環(huán)境重金屬及有機(jī)污染物的修復(fù)研究多集中在單一污染物，而微生物及植物對(duì)重金屬與有機(jī)污染物復(fù)合污染的生物響應(yīng)及機(jī)制研究尚少報(bào)道。

早期研究發(fā)現(xiàn)毛白楊葉際異常維克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)對(duì)BDE-3具有較高的耐受性[22]。本研究擬通過(guò)觀察Cd、Cr、Bap和BDE-3單獨(dú)或復(fù)合暴露條件下毛白楊葉際酵母生長(zhǎng)響應(yīng)情況，分析酵母對(duì)4種污染物單獨(dú)及復(fù)合脅迫的解毒、耐受能力，為研究植物和微生物協(xié)同修復(fù)重金屬及有機(jī)污染物提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

毛白楊葉際異常維克漢姆酵母由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物修復(fù)實(shí)驗(yàn)室保存，BDE-3(4-Bromodiphenyl Ether，Lot NDKEK-KN，純度>98%)購(gòu)自于東京化成工業(yè)株式會(huì)社。鎘(CdCl2·2.5H2O相對(duì)分子質(zhì)量228.35)購(gòu)自于天津市永大化學(xué)試劑有限公司。鉻(Cr)購(gòu)自于國(guó)家有色金屬及電子材料測(cè)試中心。Bap(純度96%)，購(gòu)自于北京百靈威科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 毛白楊葉際酵母對(duì)Cd、Cr、Bap和BDE-3脅迫的耐受性分析 將-80 ℃凍存酵母菌株接種于PDB固體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)16 h。挑取單菌落接種于液體YPD培養(yǎng)基中28 ℃ 200 rpm培養(yǎng)16 h，生長(zhǎng)達(dá)到對(duì)數(shù)期，稀釋菌液OD600值為1，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

采用平板劃線法將酵母菌液涂在含有污染物的PDB固體培養(yǎng)基上，設(shè)置不同污染物的濃度梯度，Cd(10 mg/L、100 mg/L、500 mg/L、1 000 mg/L)，Cr(1 mg/L、10 mg/L、30 mg/L、50 mg/L)，Bap(0.25 mg/L、2.5 mg/L、25 mg/L、250 mg/L)，BDE-3(3 mg/L、30 mg/L、300 mg/L)，28 ℃培養(yǎng)36 h后觀察酵母生長(zhǎng)狀況，每個(gè)處理均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，初步分析酵母對(duì)幾種污染物是否具有耐受性。

1.2.2 不同劑量Cd、Cr、Bap和BDE-3脅迫對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響 相同體積YPD液體培養(yǎng)基中分別添加Cd、Cr、Bap和BDE-3,設(shè)置濃度梯度分別為，Cd(10 mg/L、100 mg/L、500 mg/L、1 000 mg/L)，Cr(1 mg/L、10 mg/L、30 mg/L、50 mg/L)，Bap(0.25 mg/L、2.5 mg/L、25 mg/L)，BDE-3(3 mg/L、30 mg/L、300 mg/L)。取稀釋后OD600值為1的菌液100 μL加入含有污染物的YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃ 200 rpm條件下培養(yǎng)。分別在12 h、24 h、48 h和72 h 檢測(cè)菌液OD600，每個(gè)處理均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.3 不同劑量Cd、Cr、Bap和BDE-3復(fù)合脅迫對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響 相同體積YPD液體培養(yǎng)基和無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中分別添加Cd、Cr、Bap和BDE-3,設(shè)置不同處理組合：BDE-3(3 mg/L)+Cd(10 mg/L)、BDE-3(30 mg/L)+Cd(10 mg/mL)、BDE-3(3 mg/L)+Cr(10 mg/L)、BDE-3(30 mg/L)+Cr(10 mg/L)、Bap(2.5 mg/L)+Cd(10 mg/L)、Bap(25 mg/L)+Cd(10 mg/L)、Bap(2.5 mg/L)+Cr(10 mg/L)、Bap(25 mg/L)+Cr(10 mg/L)。取稀釋后OD600值為1的菌液100 μL加入含有污染物的YPD及無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，28 ℃ 200 rpm條件下培養(yǎng)。分別12 h、24 h、48 h和72 h檢測(cè)菌液OD600，每個(gè)處理均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS analysis 20軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)中Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，P<0.05表示顯著差異。通過(guò)OriginPro 8.5軟件繪制圖表，圖點(diǎn)頂部中“*”表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛白楊葉際酵母對(duì)Cd、Cr、Bap和BDE-3脅迫的耐受性分析

平板劃線試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 4種污染物不同濃度處理?xiàng)l件下酵母生長(zhǎng)狀況Figure 1 Yeast growth under different concentrations of four kinds of pollutants

由圖1可知，和空白對(duì)照相比，在試驗(yàn)設(shè)計(jì)的濃度范圍內(nèi)，10 mg/L Cr和Cd處理均對(duì)酵母生長(zhǎng)有一定的抑制效應(yīng)，但抑制效果不顯著。Cr對(duì)毛白楊葉際異常維克漢姆生長(zhǎng)顯著抑制的處理濃度為30 mg/L，Cd為100 mg/L。PDB固體培養(yǎng)基中添加3 mg/L BDE-3條件下的酵母生長(zhǎng)狀況與空白相比并無(wú)顯著差異差異，30 mg/L及300 mg/L處理下，酵母生長(zhǎng)均受到一定程度的抑制。0.25 mg/L及2.5 mg/L Bap處理?xiàng)l件下，酵母生長(zhǎng)狀況與空白對(duì)照相比并無(wú)差異，25 mg/L、250 mg/L處理?xiàng)l件下酵母生長(zhǎng)受到一定程度的抑制。綜上所述，酵母對(duì)Cd、Cr、BDE-3和Bap具有較高的耐受性，而且對(duì)BDE-3及Bap的耐受性明顯高于對(duì)Cr和Cd。

2.2 YPD培養(yǎng)基添加不同劑量Cd、Cr、Bap和BDE-3脅迫對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響

YPD營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基條件下，不同濃度Cd處理對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度Cd處理?xiàng)l件下酵母生長(zhǎng)狀況Figure 2 Yeast growth under different concentrations of Cd

由圖2可知，和對(duì)照處理相比，10 mg/L以及100 mg/L Cd處理對(duì)酵母生長(zhǎng)無(wú)影響，但10 mg/L Cd處理下48 h可顯著促進(jìn)酵母生長(zhǎng)(P<0.05)。500 mg/L 以及1 000 mg/L Cd 可顯著機(jī)制酵母生長(zhǎng)(P<0.05)。結(jié)果顯示酵母對(duì)Cd的單獨(dú)脅迫具有一定耐受性。Cd在10 mg/L處理?xiàng)l件下48 h顯著促進(jìn)酵母生長(zhǎng)(P<0.05)，可能是毒物興奮效應(yīng)所致。

YPD營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基條件下，不同濃度Cr處理下酵母生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖3。

圖3 不同濃度Cr處理?xiàng)l件下酵母生長(zhǎng)狀況Figure 3 Yeast growth under different concentrations of Cr

由圖3可知，Cr在1 mg/L、10 mg/L處理下，對(duì)酵母生長(zhǎng)沒(méi)有影響。在30 mg/L、50 mg/L處理下顯著抑制酵母的生長(zhǎng)(P<0.05)，但30 mg/L處理下72 h處對(duì)酵母生長(zhǎng)和對(duì)照處理沒(méi)有顯著差異。結(jié)果顯示酵母對(duì)Cr的單獨(dú)脅迫具有一定耐受性。

YPD營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基條件下，不同濃度Bap處理下酵母生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖4。

圖4 不同濃度Bap處理?xiàng)l件下酵母生長(zhǎng)狀況Figure 4 Yeast growth under different concentrations of Bap

由圖4可知，Bap在0.25 mg/L、2.5 mg/L 2個(gè)濃度處理下，對(duì)酵母生長(zhǎng)無(wú)影響。在2.5 mg/L處理下12 h和25 mg/L處理下12 h，48 h處理下吸光度顯著高于空白對(duì)照(P<0.05)，表現(xiàn)出促進(jìn)效應(yīng)，在25 mg/L處理下24 h、72 h處Bap處理下對(duì)酵母生長(zhǎng)無(wú)顯著影響，結(jié)果顯示酵母對(duì)Bap單獨(dú)脅迫具有一定耐受性。

YPD營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基條件下，不同濃度BDE-3處理下酵母生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖5。

圖5 不同濃度BDE-3處理?xiàng)l件下酵母生長(zhǎng)狀況Figure 5 Yeast growth under different concentrations of BDE-3

由圖5可知，和對(duì)照相比，BDE-3在3 mg/L處理下12 h，30 mg/L、300 mg/L處理12 h、24 h顯著抑制酵母生長(zhǎng)(P<0.05)，48 h、72 h對(duì)酵母生長(zhǎng)無(wú)影響。綜上所述，BDE-3在3 mg/L處理下，對(duì)酵母的生長(zhǎng)無(wú)影響，結(jié)果顯示酵母對(duì)BDE-3的單獨(dú)脅迫具有一定耐受性，30 mg/L、300 mg/LBDE-3初期對(duì)酵母生長(zhǎng)有顯著抑制作用，后期沒(méi)有影響，推測(cè)可能是因?yàn)殡S著時(shí)間延長(zhǎng)，培養(yǎng)基中BDE-3被酵母修復(fù)而是濃度降低。

2.3 YPD培養(yǎng)基中添加不同劑量Cd、Cr、Bap和BDE-3復(fù)合脅迫對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響

YPD培養(yǎng)基中加入Cd與BDE-3和Bap組合處理?xiàng)l件下酵母的生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖6。

圖6 Cd與不同濃度BDE-3、Bap處理?xiàng)l件下酵母生長(zhǎng)狀況Figure 6 Yeast growth under Cd with different concentrations of BDE-3、Bap

由圖6可知，和對(duì)照相比，3 mg/L BDE-3與Cd組合處理對(duì)酵母生長(zhǎng)無(wú)顯著影響，30 mg/L BDE-3與Cd組合處理12 h、24 h、48 h顯著抑制酵母生長(zhǎng)，這與單獨(dú)脅迫試驗(yàn)中BDE-3處理初期對(duì)酵母生長(zhǎng)有抑制作用相符。2.5 mg/L Bap與Cd組合處理12 h吸光度與空白對(duì)照吸光度相比有顯著差異顯著促進(jìn)酵母生長(zhǎng)，剩余3個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)酵母生長(zhǎng)無(wú)影響。25 mg/L Bap與Cd組合處理下對(duì)酵母生長(zhǎng)無(wú)影響。與單獨(dú)脅迫試驗(yàn)結(jié)果一致。根據(jù)圖中數(shù)據(jù)表明酵母對(duì)Cd+BDE-3、Cd+Bap污染物組合污染具有一定耐受性。

YPD培養(yǎng)基中加入Cr與BDE-3和Bap組合處理?xiàng)l件下酵母的生長(zhǎng)狀況見(jiàn)圖7。

圖7 Cr與不同濃度BDE-3、Bap處理下酵母生長(zhǎng)狀況Figure 7 The growth status of yeast under Cr and different concentrations of BDE-3、Bap

由圖7可知，和對(duì)照相比，3 mg/L BDE-3與Cr組合處理12 h顯著抑制酵母生長(zhǎng)，后期對(duì)酵母生長(zhǎng)無(wú)影響。30 mg/L BDE-3與Cr組合處理，顯著抑制酵母生長(zhǎng)。2.5 mg/L、25 mg/L Bap與Cr處理，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)處光度與空白對(duì)照吸光度相比無(wú)顯著差異。表明2.5 mg/L、25 mg/L Bap與Cr的組合對(duì)酵母生長(zhǎng)無(wú)影響，表明酵母對(duì)Cr+BDE-3、Cr+Bap污染物組合污染具有一定耐受性。

2.4 無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基添加不同劑量Cd、Cr、Bap和BDE-3復(fù)合脅迫對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入Cd 與BDE-3和Bap組合處理?xiàng)l件下酵母的生長(zhǎng)狀況見(jiàn)圖8。

圖8 無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基及Cd與不同濃度BDE-3、Bap處理下酵母生長(zhǎng)狀況(吸光度)Figure 8 The growth status of yeast under the treatment of inorganic salt basic medium with Cd and different concentrations of BDE-3、Bap

由圖8可知，和對(duì)照相比，3 mg/L BDE-3與Cd組合處理對(duì)酵母生長(zhǎng)無(wú)顯著影響；30 mg/L BDE-3與10 mg/L Cd組合處理24 h對(duì)酵母生長(zhǎng)無(wú)顯著影響，48 h、72 h可顯著促進(jìn)酵母生長(zhǎng)。2.5 mg/L Bap與10 mg/L的Cd的組合處理在試驗(yàn)設(shè)置的時(shí)間范圍內(nèi)對(duì)酵母生長(zhǎng)不顯著影響，25 mg/L Bap與Cd組合處理下12 h、24 h可顯著促進(jìn)酵母生長(zhǎng)，表明毛白楊葉際異常維克漢姆酵母在無(wú)機(jī)鹽條件下可以利用4-溴代聯(lián)苯醚(BDE-3)和Bap作為碳源維持較低水平的生長(zhǎng)。毛白楊葉際酵母在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基條件下利用BDE-3作為碳源的能力強(qiáng)于Bap。

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入Cr與BDE-3和Bap組合處理?xiàng)l件下酵母的生長(zhǎng)狀況見(jiàn)圖9。

圖9 無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基及Cr與不同濃度BDE-3、Bap處理下酵母生長(zhǎng)狀況Figure 9 Yeast growth under the treatment of inorganic salt basic medium with Cr and different concentrations of BDE-3、Bap

由圖9可知，3 mg/L BDE-3與10 mg/L Cr組合處理下各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的吸光度與空白對(duì)照相比無(wú)顯著差異，對(duì)酵母生長(zhǎng)無(wú)影響。30 mg/L BDE-3與Cr組合處理下24 h處吸光度與空白對(duì)照相比無(wú)顯著差異，12 h、48 h、72 h處吸光度與空白對(duì)照相比有顯著差異，且48 h、72 h處顯著促進(jìn)酵母的生長(zhǎng)。2.5 mg/L、25 mg/L Bap與10 mg/L Cr組合處理下各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的吸光度與空白對(duì)照相比無(wú)顯著差異，對(duì)酵母生長(zhǎng)無(wú)影響，表明酵母在無(wú)機(jī)鹽條件下可以利用4-溴代聯(lián)苯醚(BDE-3)作為碳源維持較低水平的生長(zhǎng)。

3 討論與結(jié)論

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基條件下加入重金屬Cd、Cr單獨(dú)脅迫，酵母無(wú)法正常生長(zhǎng)，無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基條件下，25 mg/L Bap+10 mg/L Cd、30 mg/L BDE-3+10 mg/L Cd、30 mg/L BDE-3+10 mg/L Cr組合處理均可顯著促進(jìn)酵母生長(zhǎng)。莧菜、牛尾草等植物對(duì)5～50 mg/L的BDE-209的暴露有類(lèi)似生物響應(yīng)，表現(xiàn)為一定劑量的BDE-209可以降低重金屬對(duì)植物生長(zhǎng)和發(fā)育產(chǎn)生的毒性作用[23]。

較高濃度CdCl2(50 mg/kg)也可使大豆幼苗發(fā)育不完全[24]，二價(jià)Cd含量在農(nóng)作物中超過(guò)1 mg/kg就會(huì)導(dǎo)致農(nóng)作物中元素失衡，從而產(chǎn)生如細(xì)胞功能缺失，葉綠素含量減少、光合作用降低等一系列不良反應(yīng)[25]。本研究發(fā)現(xiàn)YPD營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基條件下，單獨(dú)低濃度(10 mg/L、100 mg/L) Cd處理對(duì)酵母生長(zhǎng)無(wú)顯著影響，但高劑量500 mg/L Cd處理則顯著抑制酵母的生長(zhǎng)，和高等植物相比酵母對(duì)Cd有較高的耐受，這可能與生物代謝個(gè)體差異有關(guān)。目前環(huán)境中存在的重金屬元素Cr多為三價(jià)和六價(jià)，其中六價(jià)Cr毒性較強(qiáng)，零價(jià)Cr研究較少，有關(guān)內(nèi)容尚需進(jìn)一步研究。

BDE-3脅迫初期對(duì)酵母生長(zhǎng)有顯著抑制作用，后期沒(méi)有影響，推測(cè)可能是因?yàn)殡S著時(shí)間變化，培養(yǎng)基中BDE-3被酵母修復(fù)利用所致。無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基條件下污染物復(fù)合暴露試驗(yàn)表明，BDE-3與Cd、Cr組合脅迫下的酵母生長(zhǎng)情況整體優(yōu)于Bap與Cd、Cr組合脅迫下酵母生長(zhǎng)情況，推測(cè)毛白楊葉際酵母在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基條件下利用BDE-3作為碳源的能力強(qiáng)于Bap，有關(guān)機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

毛白楊葉際異常維克漢姆酵母對(duì)Cd、Cr、Bap和BDE-3單獨(dú)暴露以及Cd+Bap、Cd+BDE-3、Cr+Bap、Cr+BDE-3復(fù)合脅迫均具有較高的耐受特性；同時(shí)毛白楊葉際異常維克漢姆酵母在無(wú)機(jī)鹽條件下可以利用BDE-3和Bap作為碳源維持較低水平的生長(zhǎng)，并且利用BDE-3為碳源能力優(yōu)于利用Bap的能力。