周 梅,徐成良,王潔茹,李小金,張 威,儲明星,王重龍*

(1 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,豬分子數(shù)量遺傳學(xué)安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院重點實驗室,畜禽產(chǎn)品安全工程安徽省重點實驗室,合肥 230001；2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物遺傳育種與繁殖(家禽)重點實驗室,北京 100193)

產(chǎn)仔數(shù)性狀是豬最重要的經(jīng)濟性狀之一,與豬場的效益直接相關(guān)。然而,涉及產(chǎn)仔數(shù)的生理調(diào)控機制非常復(fù)雜,包括卵泡發(fā)育-排卵-分娩等一系列環(huán)節(jié)[1]。據(jù)報道,排卵數(shù)對豬的產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)具有決定性的影響,而哺乳動物原始卵泡的數(shù)量在出生后就已確定且不再發(fā)生改變,卵泡發(fā)育以一批接著一批卵泡波的形式相繼生長和退化,只有發(fā)育成熟的卵泡才能到達(dá)排卵位置[2-3]。早在1990年,李汝敏等[4]對高產(chǎn)的二花臉豬研究發(fā)現(xiàn),正常的等級卵泡在總卵泡中所占的比例與豬的產(chǎn)仔數(shù)直接相關(guān),但至今豬卵泡發(fā)育的調(diào)控機制仍不夠明晰,故對其調(diào)控通路進行研究對于其機制的闡明至關(guān)重要。

近年來有研究顯示,Hippo 信號通路可能在哺乳動物卵泡發(fā)育中可能發(fā)揮潛在調(diào)控作用,且該通路在物種間高度保守[5]。Xiang 等[6]研究發(fā)現(xiàn),Hippo 通路的核心組分哺乳動物不育系20 樣激酶1(Mammalian sterile 20-like kinase 1,MST1)、大腫瘤抑制激酶2(Large tumor suppressor kinase 1,LATS2)以及YAP的表達(dá)隨著小鼠的卵泡發(fā)育而發(fā)生改變,尤其是在原始卵泡激活前后變化顯著,且與原始卵泡池的大小具有時空相關(guān)性。Sun 等[7]研究發(fā)現(xiàn),小鼠卵母細(xì)胞在排卵前通過抑制Hippo 組分的表達(dá)來誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞增殖,在排卵期間又通過及時激活Hippo 信號傳導(dǎo)活性促進顆粒細(xì)胞分化,說明Hippo 信號通路在小鼠顆粒細(xì)胞的增殖和分化中均發(fā)揮重要作用。有報道稱,Hippo 信號通路成員MST1∕2、LATS1∕2 以及YAP在綿羊睪丸成熟過程中表達(dá)量逐漸增加,且在射出的精子中高度表達(dá),表明該通路在雄性哺乳動物青春期發(fā)育及精子發(fā)生過程中也發(fā)揮著重要作用[8]。Hippo 信號通路影響小鼠卵泡發(fā)育,但是其確切作用仍然未知,在體外或體內(nèi)滅活小鼠顆粒細(xì)胞中的LATS1∕2 會導(dǎo)致顆粒細(xì)胞形態(tài)、功能和基因表達(dá)的喪失[9]。本試驗以大白豬為對象,研究Hippo 信號通路在其不同直徑卵泡中的表達(dá)特征,以期為闡明豬的卵泡發(fā)育調(diào)控機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和處理

從長豐農(nóng)牧屠宰場現(xiàn)場采集大白豬新鮮卵巢組織,置于4 ℃無菌的PBS 溶液中盡快帶回實驗室,清洗處理后置于無菌的0.9% NaCl 溶液中。用10 mL 無菌注射器抽取不同直徑卵泡液(小卵泡,＜3 mm；中卵泡,3—5 mm；大卵泡,＞5 mm),經(jīng)400 目(孔徑425 μm)篩網(wǎng)過濾后收集細(xì)胞混合液,800 r∕min 離心5 min 后取細(xì)胞沉淀,用TRizol 和試劑盒法對不同直徑卵泡細(xì)胞進行總RNA 提取,用Nanodrop 2000 核酸測定儀對各RNA 樣品的純度和濃度進行測定,然后置于-80 ℃冰箱備用。

1.2 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank 提供的豬LATS1、LATS2、MOB1、MST1、MST2、SAV1 以及YAP基因mRNA 序列(登錄號依次為XM_005659149.3、XM_021065128.1、NM_001179454.1、XM_003132215.4、NM_001019167.2、XM_001927720.7 和XM_021062706.1)為模板,利用Primer 3 在線軟件進行跨外顯子引物設(shè)計,以β-actin(登錄號為NM_001009784)作為內(nèi)參基因。引物由合肥欣捷智生物技術(shù)有限公司合成,具體信息見表1。

1.3 反轉(zhuǎn)錄和qPCR 反應(yīng)

利用TAKARA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒先去除基因組DNA 后再進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),去除基因組DNA 的體系(50 μL)和反應(yīng)條件為:5 ×gDNA Eraser Buffer 10.0 μL,gDNA Eraser 5.0 μL,Total RNA 2.5 μg,再用RNase Free dH2O 補至總體積50 μL,42 ℃反應(yīng)2 min；反轉(zhuǎn)錄體系(100 μL)和反應(yīng)條件為去除gDNA 的反應(yīng)液(50.0 μL),PrimeScript RT Enzyme Mix I 5 μL,RT Primer Mix 5 μL,5 ×PrimeScript Buffer 2 20 μL,RNase Free dH2O 20 μL；37 ℃15 min,85 ℃5 s,4 ℃保存。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行5 倍稀釋后用于qPCR 反應(yīng),反應(yīng)在Roche Light Cycler?R480 Ⅱ型熒光定量PCR 儀中進行,每個樣品重復(fù)檢測3 次。qPCR 體系(25.0 μL)和反應(yīng)條件為:SYBR Premix Ex Taq II 12.5 μL,PCR Forward Primer 1.0 μL,PCR Reverse Primer 1.0 μL,cDNA 2.0 μL,dH2O 8.5 μL；95 ℃預(yù)變性5 s,95 ℃變性5 s,60 ℃30 s,40 個循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后對熔解曲線進行分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用2-ΔΔCt法[10]對qPCR 結(jié)果中目的基因的相對表達(dá)量進行計算,利用SPSS 20 統(tǒng)計軟件按照分析-比較均值-單因素ANOVA 的方法對不同直徑卵泡之間各基因的表達(dá)量進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn),提取的不同直徑卵泡總RNA 完整性良好,無明顯降解,且濃度和純度均符合要求,可直接進行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄成cDNA 后,同時用各基因?qū)?yīng)的引物和β-actin引物進行qPCR 擴增,熔解曲線均為單峰,表明引物特異性很好,可用于后續(xù)的qPCR 試驗。根據(jù)qPCR 檢測結(jié)果對Hippo 信號通路(LATS1∕2、MOB1、MST1∕2、SAV1 和YAP)在不同直徑卵泡中的表達(dá)進行分析,具體結(jié)果見圖1。

圖1 Hippo 信號通路核心因子在不同直徑卵泡中的表達(dá)Fig.1 Expression of core factors of Hippo signaling pathway in follicles with different diameters

從圖1 可以看出,Hippo 信號通路的7 個核心因子在不同直徑豬卵泡中的表達(dá)均達(dá)到了差異顯著水平,其中LATS2 的表達(dá)量隨著卵泡直徑的增大極顯著增加(P＜0.01),而MOB1、MST1、MST2 以及YAP的表達(dá)量則隨著卵泡直徑的增大顯著(P＜0.05)或極顯著(P＜0.01)下降。另外,LATS1 和SAV1 都是在中卵泡中表達(dá)量最高,顯著高于小卵泡和大卵泡(P＜0.05)。

3 討論與結(jié)論

哺乳動物卵泡發(fā)育過程受多條信號通路調(diào)控,如雌激素受體信號通路[11]、轉(zhuǎn)化生長因子β(Transforming growth factor β,TGFβ) 信 號 通 路[12]、TGFβ∕SMAD 信 號 通 路[13]、骨 形 成 蛋 白(Bone morphogenetic protein,BMP)∕SMAD 信號通路[14]、磷脂酰肌醇3 激酶(Phosphatidylinositol 3 kinase,PI-3K)∕蛋白激酶B(Protein kinase B,PKB)信號通路[15]以及Wnt 信號通路[16]等。Hippo 信號通路處于一個復(fù)雜的調(diào)控通路網(wǎng)絡(luò)之中,與TGFβ、BMP∕SMAD 以及Wnt 信號通路間均存在相互作用,暗示該通路可能在哺乳動物卵泡發(fā)育中也發(fā)揮著潛在的重要作用。目前,關(guān)于Hippo 信號通路在卵泡發(fā)育中作用的報道多集中在小鼠上[17],本研究是初次對Hippo 信號通路核心因子在豬卵泡發(fā)育過程中的表達(dá)特征進行分析,旨在探索影響卵泡發(fā)育的因素及可能的作用方式。

qPCR 結(jié)果表明,LATS1∕2、MOB1、MST1∕2、SAV1 以及YAP基因在豬不同直徑卵泡中的表達(dá)均達(dá)到了差異顯著水平,其中LATS2 基因在大、中、小卵泡之間的表達(dá)量差異均達(dá)到極顯著水平,且表達(dá)量隨著卵泡直徑的增大而增加,表明其可能通過增加自身的表達(dá)量來促進卵泡的生長。這與牛小天[18]在雞上報道的研究結(jié)果不太一致,可能是因為哺乳動物與家禽在生理生殖調(diào)控中存在較大差異有關(guān)。MOB1 基因在不同直徑卵泡中幾乎不表達(dá),推測其可能在豬卵泡發(fā)育中作用不是最關(guān)鍵的。而MST1、MST2 以及YAP基因的表達(dá)特征均與LATS2 基因相反,推測它們表達(dá)的增加可能會抑制卵泡的生長。通過以上結(jié)果,可以推測Hippo 信號通路的LATS2、MOB1、MST1、MST2 以及YAP基因與豬的卵泡發(fā)育密切相關(guān),但各核心因子的調(diào)控方式與在雞[18]和小鼠[19]等物種中的調(diào)控模式并不完全一致,具體的調(diào)控機制還需要進一步的驗證。下一步計劃將在體外培養(yǎng)的豬卵泡顆粒細(xì)胞中驗證各基因敲除或過表達(dá)對細(xì)胞增殖或凋亡等的影響,以明確其作用的分子機制。

本研究初步得出以下結(jié)論:Hippo 信號通路核心因子LATS2 在豬卵泡發(fā)育中發(fā)揮正調(diào)控作用,而MOB1、MST1、MST2 以及YAP則發(fā)揮著負(fù)調(diào)控作用。