吳坤坤 徐行 季策 任建峰 李偉明 張慶華

（1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；2. 上海海洋大學(xué) 國(guó)家水生動(dòng)物病原庫(kù)，上海 201306；3. 密歇根州立大學(xué)漁業(yè)與野生生物系，東蘭辛 48824，美國(guó)）

Notch分子是一種跨膜的信號(hào)受體，在發(fā)育模式、細(xì)胞命運(yùn)決定、細(xì)胞生存和增殖調(diào)控與免疫等方面都發(fā)揮著重要作用［1-2］。Notch信號(hào)通路調(diào)控著神經(jīng)細(xì)胞增殖、分化和凋亡之間的平衡［1，3］，對(duì)細(xì)胞分化也起著決定性作用，同時(shí)Notch受體還可以通過(guò)調(diào)節(jié)干細(xì)胞及其譜系和其他細(xì)胞過(guò)程，繼續(xù)在成人組織的維持和修復(fù)中發(fā)揮重要作用。notch基因最先在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，該基因突變可造成黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）翅膀邊緣缺刻（notch），故被命名為notch，果蠅中只有一個(gè)notch基因［4］。隨著基因在進(jìn)化過(guò)程中的復(fù)制和多樣性變化，在人體中產(chǎn)生了4個(gè)Notch同源基因（Notch1-4），它們既有重疊的功能，又有各自的功能［5-6］。Notch分子是單次跨膜分子，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體產(chǎn)生，經(jīng)過(guò)Furin蛋白酶切割成熟之后形成一個(gè)以非共價(jià)鍵結(jié)合的單次跨膜蛋白，包括胞內(nèi)段（notch intracellular domain，NICD）、 跨 膜 區(qū)（transmembrane domain，TMD和胞外段（extracellular domain，NECD）3部分［7］。在受到蛋白水解酶切割時(shí)被激活是Notch的一個(gè)基本特征。在被激活時(shí)Notch受體會(huì)被金屬蛋白酶和γ-分泌酶切割加工，隨后釋放的Notch受體胞內(nèi)段NICD進(jìn)入細(xì)胞核，NICD在入核后與DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子CSL組成一個(gè)臨時(shí)的核轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。一旦NICD綁定到CSL上，NICD便會(huì)募集其他激活蛋白包括Mastermind（MAM）/Lag-3形成三元復(fù)合體，進(jìn)而募集ARCL/MED介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物誘導(dǎo)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)［8］。

Notch3作為4個(gè)Notch分子的一員，在生物的發(fā)育、修復(fù)和免疫等過(guò)程中都發(fā)揮著重要作用，特別是在一些疾病中。研究表明，Notch3也有很高的配體非依賴(lài)性特征，這可能與Notch3的功能和病理特征有關(guān)［9］。在T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病（T-ALL）中，通過(guò)鑒定染色體易位，異常的Notch信號(hào)首次與人類(lèi)癌癥聯(lián)系在一起［10］。在很多病例中Notch3的過(guò)度表達(dá)都是引發(fā)疾病的重要原因之一［11-12］。特異性針對(duì)Notch3 結(jié)構(gòu)域的阻斷抗體已被證明具有抗白血病的效果［13］。而且Notch3分子同Notch1分子一樣，能夠調(diào)節(jié)類(lèi)似的下游致癌基因，包括驅(qū)動(dòng)細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子Myc［14］。另有研究發(fā)現(xiàn)，Notch3與NF-κB（nuclear factor-кB）家族關(guān)系密切，Notch3受體表達(dá)的下調(diào)會(huì)抑制NF-κB信號(hào)通路，而NF-κB信號(hào)通路又是免疫學(xué)中的重要通路［15］。以上研究表明Notch3在發(fā)育和免疫方面都有著重要作用，Notch3分子可能具有復(fù)雜的分子調(diào)控機(jī)制，使其表現(xiàn)出不同的生物學(xué)功能。因此，有必要進(jìn)行詳細(xì)的研究。

斑馬魚(yú)（Danio rerio）是一種新興的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，其易于飼養(yǎng)和繁殖，具有透明的胚胎，適合于胚胎發(fā)育、神經(jīng)生成和高通量毒理學(xué)等研究。斑馬魚(yú)胚胎的透明性允許在發(fā)育的所有階段應(yīng)用高分辨率成像技術(shù)。受精后5 d（5 days post fertilization，5 dpf）以?xún)?nèi)的斑馬魚(yú)胚胎被歐盟指令（2010/63/EU）以及美國(guó)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)（Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC）視為不受保護(hù)的生命階段。因此，斑馬魚(yú)胚胎是能夠很好代替其他成年動(dòng)物的模式生物［16］。在一些微生物感染的實(shí)驗(yàn)中，斑馬魚(yú)作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的優(yōu)勢(shì)尤為明顯［17］。同時(shí)，作為一種脊椎動(dòng)物，與線蟲(chóng)和果蠅相比，斑馬魚(yú)在進(jìn)化上與哺乳動(dòng)物的關(guān)系更密切，在一些藥物研究中可以更容易地推斷出在人類(lèi)中應(yīng)用的效果［18］。因此，斑馬魚(yú)模型具有更強(qiáng)的研究潛力。為了進(jìn)一步研究Notch3分子在發(fā)育、炎癥和天然免疫方面的作用機(jī)制，本研究克隆了斑馬魚(yú)notch3基因的胞內(nèi)段（notch3 intracellular domain，N3ICD），并構(gòu)建了真核表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中。亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)重組的真核表達(dá)載體可以在細(xì)胞核中表達(dá)，同時(shí)蛋白質(zhì)印跡（Western blot，WB）結(jié)果顯示N3ICD蛋白能夠正常表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)用魚(yú) 實(shí)驗(yàn)用AB品系斑馬魚(yú)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所斑馬魚(yú)平臺(tái)，參照WESTERFIELD要求［19］，飼養(yǎng)于本實(shí)驗(yàn)室的斑馬魚(yú)養(yǎng)殖系統(tǒng)中。實(shí)驗(yàn)按照上海海洋大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查委員會(huì)（SHOU-DW-2016-002）的要求進(jìn)行。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)所用HEK293T細(xì)胞（人胚腎細(xì)胞）由海軍軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)免疫學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)，本實(shí)驗(yàn)室按照ATCC數(shù)據(jù)庫(kù)方法將細(xì)胞進(jìn)行保種和培養(yǎng)。

1.1.3 主要試劑 普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒（TIANGEN，DP204-02），胰蛋白酶TrypLETMExpress（Gibco，1950685），快速質(zhì)粒小提試劑盒（BIOMIGA，PD1222-01 50）， 簡(jiǎn) 單 培 養(yǎng) 基 Opti-MEM（Gibco，1894141），DMEM培養(yǎng)基（HyClone，AD24464275），轉(zhuǎn)染試劑FuGENE HD Transfection Reagent（Promega，0000352595），哺乳動(dòng)物表達(dá)載體p3XFLAG-CMV-7（SIGMA），同源重組試劑2×ClonExpress Mix（諾唯贊，C115-02-AA），Bovine Serum Albumin（SIGMA，WXBC7961V），20×PBS（ 生 工，D609KA5801），TritonTMx-100（SIGMA，053K00262V），多聚甲醛（ 生 工，CB05BA0005），Alexa FluorTM488goat antimouse lgG9（H+L）（Invitrogen，1834337）， 小 鼠 抗FLAG-tag單克隆抗體（YSASEN，30503ES60），Goat anti-Mouse IgG（H+L）Secondary Antibody，HRP（Invitrogen，31430），β-actin，Rabbit pAb（YSASEN，30102ES40），Peroxidase-Conjugated Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）（YSASEN，33101ES60）引物合成及菌液測(cè)序均在生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行。Dual-Luciferase? Reporter Assay System 及 FuGENE Hd均購(gòu)于Promega公司。實(shí)驗(yàn)涉及NF-κB家族rela和nfκb1基因啟動(dòng)子報(bào)告基因載體 pGL3-rela-promoter-Enhancer和 pGL3-nfκb1-promoter-Enhancer均由本實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建。

1.2 方法

1.2.1 斑馬魚(yú)notch3胞內(nèi)段真核表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)NCBI網(wǎng)站上登錄的斑馬魚(yú)notch3基因（NM_131549.2）的CDS區(qū)設(shè)計(jì)的引物如表1所示。以1 dpf的野生型斑馬魚(yú)的cDNA為模板，利用高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的體系為：PrimeSTAR?Max DNA Polymerase 12.5 μL，DNA Template 20 ng，F(xiàn)orward Primer 1 μL，Reverse Primer 1 μL，ddH2O 9.5 μL，擴(kuò)增的程序?yàn)?8℃預(yù)變性20 s，98℃變性30 s、65℃退火30 s、72℃延伸1.5 min，共34個(gè)循環(huán)，72℃終延伸5 min，4℃保存。將PCR產(chǎn)物純化回收，使用限制性?xún)?nèi)切酶PstⅠ和BamHⅠ對(duì)質(zhì)粒載體p3xFLAG-CMV-7進(jìn)行雙酶切。載體p3xFLAGCMV-7的質(zhì)粒圖譜請(qǐng)見(jiàn)http：//www.biofeng.com/zaiti/buru/p3XFLAG-CMV-7.html，將切開(kāi)的載體用DNA純化試劑盒純化。純化之后用同源重組連接酶2×ClonExpress Mix將PCR純化產(chǎn)物和酶切后的載體p3xFLAG-CMV-7相連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布含有氨芐抗性的平板，12 h后挑單克隆并搖菌，3 h后將部分陽(yáng)性克隆送測(cè)序，另一部分進(jìn)行保存，將測(cè)序成功的菌液提取質(zhì)粒。

表1 N3ICD引物擴(kuò)增序列Table 1 N3ICD primer amplification sequence

1.2.2 Notch3氨基酸序列生信分析 利用SMART在線分析斑馬魚(yú)Notch3結(jié)構(gòu)域，通過(guò)DNAMAN將斑馬魚(yú)Notch3氨基酸序列與人（Homo spaiens）、小鼠（Mus musculus）和鯉魚(yú)（Cyprinus carpio）的Notch3氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。基于各物種Notch3的氨基酸序列使用MEGA7.0軟件利用鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.3 pCMV-N3ICD亞細(xì)胞定位 將構(gòu)建好的pCMV-N3ICD質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染前，將細(xì)胞接種到35 mm玻璃底培養(yǎng)皿中，融合率達(dá)到70%-80% 時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在培養(yǎng)皿用HD轉(zhuǎn)染試劑將pCMV-N3ICD和pCMV載體質(zhì)粒各自轉(zhuǎn)染500 ng。轉(zhuǎn)染24 h后，將細(xì)胞用4%多聚甲醛固定15 min，用1×PBS漂洗3次，并在-20℃下用100%甲醇透化10 min，然后用1×PBS漂洗3次。在封閉緩沖液（1×PBS / 5% 正常山羊血清/0.3% Triton X-100）中將樣品孵育1 h。封閉后，添加抗體緩沖液（1×PBS/1% BSA/0.3% TritonX-100/1∶1 000小鼠抗FLAG-tag單克隆抗體）4℃下孵育12-16 h。再用1×PBS漂洗3次，加入包含偶聯(lián)熒光素二抗并室溫下避光孵育1-2 h，1×PBS漂洗3次，添加DAPI，并將樣品在黑暗中孵育1-2 h。用1×PBS沖洗3次后，在共聚焦顯微鏡下觀察標(biāo)本并拍照。

1.2.4 斑馬魚(yú)N3ICD的蛋白表達(dá)分析 將重組質(zhì)粒pCMV-N3ICD脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞24 h后提取蛋白。根據(jù)BCA 法對(duì)蛋白進(jìn)行定量。取25 μg樣品進(jìn)行SDS-PAGE聚丙烯胺凝膠電泳，將樣品轉(zhuǎn)至NC膜上，封閉10 h，PBST漂洗濾膜3次，每次5 min，以鼠源FLAG-tag抗體為一抗（1∶3 000倍稀釋?zhuān)┎⒎跤? h，然后PBST漂洗濾膜3次，每次5 min，以山羊抗鼠為二抗（1∶3 000倍稀釋?zhuān)┓跤? h，再用PBST漂洗濾膜3次，每次5 min，ECL顯色，發(fā)光，分析Western blot結(jié)果。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因活性分析及功能驗(yàn)證 HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)于10% FBS-DMEM培養(yǎng)液中，置于5% CO2，37℃無(wú)菌培養(yǎng)箱中，每48 h傳代1次。HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染前24 h接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，接種的細(xì)胞密度約5.0×104/孔，匯合率達(dá)到80%。具體步驟為：用10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)HEK293T細(xì)胞，待細(xì)胞匯合度80%-90%時(shí)吸出舊培養(yǎng)基，貼壁加入2 mL DPBS緩沖液，輕輕晃動(dòng)后吸除DPBS，重復(fù)清洗2次。加入500 μL細(xì)胞消化胰酶，于37℃培養(yǎng)箱消化1 min，輕敲培養(yǎng)皿底部使貼壁細(xì)胞完全脫落，加入10倍體積的DMEM完全培養(yǎng)基（含有10% FBS）終止消化，并轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中800 r/min離心3 min。吸去上清，加入適量DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。24孔板中每孔鋪1×105個(gè)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)。

將斑馬魚(yú)真核表達(dá)載體pCMV- notch3、NF-κB家族基因啟動(dòng)子重組質(zhì)粒pGL3-rela-promoter-Enhancer或 pGL3-nfκb1-promoter-Enhancer和 TK 內(nèi)參熒光報(bào)告基因載體共轉(zhuǎn)至HEK293T細(xì)胞中，檢測(cè)過(guò)表達(dá)notch3基因?qū)ο掠蜰F-κB家族rela和nfκb1基因啟動(dòng)子活性的影響。轉(zhuǎn)染體系中對(duì)照組為：pCMV-Tag2B 400 ng、pCMV- notch3 0 ng、pGL3-relapromoter-Enhancer/pGL3-nfκb1-promoter-Enhancer 100 ng、pRL-TK 10 ng；實(shí)驗(yàn)組為：pCMV-Tag2B 100 ng、pCMV- notch3 300 ng、pGL3-rela-promoter-Enhancer/pGL3-nfκb1-promoter-Enhancer 100 ng、pRL-TK 10 ng。轉(zhuǎn)染24 h后按照Dual-Luciferase? Reporter Assay System說(shuō)明書(shū)并用多功能酶標(biāo)儀（FlexStation3）進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)。每組3次技術(shù)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示，用Prism 6軟件進(jìn)行顯著性差異分析，P＜0.05表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 Notch3氨基酸序列生物信息學(xué)分析

生信分析結(jié)果顯示斑馬魚(yú)Notch3編碼2 468個(gè)氨基酸，主要由6個(gè)部分構(gòu)成，23-1 379位點(diǎn)為35個(gè)EGF重復(fù)序列，1 385-1 503位點(diǎn)為3個(gè)NL區(qū)域，1 507-1 563位點(diǎn)為NOD結(jié)構(gòu)域，1 575-1 637位點(diǎn)為NODP結(jié)構(gòu)域，1 791-2 003位點(diǎn)為6個(gè)ANK結(jié)構(gòu)域，以及2383-2446位點(diǎn)為DUF功能未知的結(jié)構(gòu)域。斑馬魚(yú)與鯉魚(yú)Notch3氨基酸一致性最高為92.64%，與人和小鼠一致性分別為54.85%和54.15%。用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果表明，哺乳動(dòng)物Notch3聚為一大支，兩棲類(lèi)和魚(yú)類(lèi)Notch3聚為另一大支，而斑馬魚(yú)的Notch3又與硬骨魚(yú)類(lèi)聚為一支，而哺乳動(dòng)物各自聚為一個(gè)分支（圖1）。

圖1 NJ法構(gòu)建Notch3進(jìn)化樹(shù)Fig. 1 Construction of Notch3 evolutionary tree by NJ method

2.2 斑馬魚(yú)notch3基因胞內(nèi)段的擴(kuò)增以及真核表達(dá)載體的構(gòu)建

以1 dpf大小野生型斑馬魚(yú)的cDNA為模板，設(shè)計(jì)引物克隆notch3基因的胞內(nèi)段。電泳結(jié)果顯示，在約2 500 bp處出現(xiàn)單一條帶（圖2），與預(yù)測(cè)的目的片段大小一致。然后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化之后將其與雙酶切后的載體p3xFLAG-CMV用同源重組的方式連接，并經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化和菌液PCR篩選出陽(yáng)性克隆。將構(gòu)建的真核表達(dá)載體命名為pCMVN3ICD，并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證其與預(yù)測(cè)信息一致。

圖2 notch3基因胞內(nèi)段的克?。ˋ）及重組質(zhì)粒的構(gòu)建（B）Fig. 2 Cloning of notch3 gene Intracellular domain（A）and construction of recombinant plasmid（B）

2.3 重組質(zhì)粒亞細(xì)胞定位

為了驗(yàn)證構(gòu)建好的重組質(zhì)粒的表達(dá)位置，進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)。我們用DAPI試劑標(biāo)記細(xì)胞核（藍(lán)色熒光），F(xiàn)LAG抗體標(biāo)記pCMV-N3ICD（綠色熒光），并進(jìn)行了明場(chǎng)觀察，pCMV質(zhì)粒用作對(duì)照。在共聚焦顯微鏡下，pCMV-N3ICD聚集在HEK293T細(xì)胞核中，這說(shuō)明成功構(gòu)建了pCMV-N3ICD真核表達(dá)載體（圖 3）。

圖3 pCMV-N3ICD在HEK293T細(xì)胞中的定位Fig. 3 Localization of pCMV-N3ICD in HEK293T cells

2.4 利用Western blot分析N3ICD蛋白的表達(dá)

為了驗(yàn)證重組質(zhì)粒在HEK293T細(xì)胞中的表達(dá)情況，我們采用了蛋白質(zhì)免疫印跡法分析。轉(zhuǎn)染pCMV-N3ICD質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組使用Flag抗體出現(xiàn)了明顯的特異性條帶，而轉(zhuǎn)染p3×FLAG-CMV的載體質(zhì)粒的對(duì)照組中未見(jiàn)相關(guān)條帶，表明實(shí)驗(yàn)組有N3ICD目的蛋白的表達(dá)（圖4）。

圖4 Western blot檢測(cè)N3ICD蛋白的表達(dá)（通過(guò)Flag標(biāo)簽顯示）Fig. 4 Expression of N3ICD protein was detected by Western blot（shown by Flag tag）

2.5 過(guò)表達(dá)斑馬魚(yú)notch3基因?qū)F-κB家族基因啟動(dòng)子活性的影響

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pCMV-notch3分別與NF-κB家族rela和 nfκb1啟動(dòng)子報(bào)告基因共轉(zhuǎn)至HEK293T細(xì)胞，即在HEK293T細(xì)胞中過(guò)表達(dá)斑馬魚(yú)notch3基因，利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞中NF-κB家族rela和nfκb1啟動(dòng)子報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)斑馬魚(yú)notch3基因后，pGL3-rela-promoter-Enhancer和 pGL3-nfκb1-Enhancer啟 動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性均顯著升高，rela啟動(dòng)子活性約為對(duì)照組的4.5倍，nfκb1轉(zhuǎn)錄活性約為對(duì)照組活性的7倍（圖5）。

圖5 過(guò)表達(dá)斑馬魚(yú)notch3基因Fig. 5 Overexpression of notch3 gene

3 討論

Notch信號(hào)是胚胎和成年動(dòng)物組織中調(diào)節(jié)細(xì)胞命運(yùn)的重要信號(hào)通路。很多研究都表明了其在發(fā)育中的重要作用，在哺乳動(dòng)物中，Notch和TGF信號(hào)通路的相互調(diào)節(jié)可以延緩腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程［20］。同時(shí)，Notch 信號(hào)通路參與調(diào)控肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡及肺動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的過(guò)程，可以導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓肺血管重構(gòu)的發(fā)生［21］。此外，Notch信號(hào)被認(rèn)為是影響腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）的重要通路之一，Notch 信號(hào)能夠介導(dǎo)許多分子的分泌，從而影響TME 中的細(xì)胞功能［22］。還有研究表明Notch1和Notch3之間的相互作用促進(jìn)了鱗狀細(xì)胞癌的增殖及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤的發(fā)生［23］。最近的研究發(fā)現(xiàn)，Notch3對(duì)發(fā)育和人類(lèi)的健康都十分重要，Notch3也越來(lái)越受到關(guān)注，如Notch3信號(hào)傳導(dǎo)的異常會(huì)促進(jìn)血管的過(guò)度出芽［24］，還能夠影響常染色體顯性遺傳腦動(dòng)脈病以及癌癥等［25］。然而，相較于Notch3，Notch家族的其他成員具有更明顯的多效性作用，所以對(duì)于Notch3的研究還不深入。本研究構(gòu)建了斑馬魚(yú)N3ICD真核表達(dá)載體，對(duì)其序列特征進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并從測(cè)序、亞細(xì)胞定位和Western blot等方面進(jìn)行了驗(yàn)證，旨在進(jìn)一步研究Notch3不同于其他Notch蛋白的獨(dú)特調(diào)控方式，為探究Notch3在發(fā)育和免疫中的功能打下基礎(chǔ)。同時(shí)為Notch3的異常表達(dá)和調(diào)控而導(dǎo)致的疾病，開(kāi)發(fā)出更具針對(duì)性的治療方案提供幫助。

近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)表明，Notch信號(hào)參與了天然免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)，特別是巨噬細(xì)胞活化和極化的調(diào)控。在過(guò)去的幾年中，多項(xiàng)研究表明，Notch信號(hào)在髓樣細(xì)胞（尤其是巨噬細(xì)胞）的分化和激活中具有關(guān)鍵作用［26］，并參與炎癥性相關(guān)疾病的發(fā)生。在不同的炎癥疾病模型中，Notch受體表達(dá)的增加能夠引起病理性炎癥［27］。Notch3通過(guò)其活性、表達(dá)改變或錯(cuò)誤調(diào)節(jié)與人類(lèi)疾病密切相關(guān)。在大腸癌患者中，Notch3表達(dá)與腫瘤分級(jí)，淋巴結(jié)的存在以及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，并且在間質(zhì)大腸癌腫瘤中特異上調(diào)［28］。同時(shí)在哺乳動(dòng)物中Notch3在炎癥控制時(shí)也起重要作用，有報(bào)道顯示Notch3能夠影響NF-κB活化和促炎巨噬細(xì)胞的發(fā)育，Notch3可以促進(jìn)NF-κB的激活并能夠促進(jìn)由TLR-4激活的巨噬細(xì)胞中促炎基因的表達(dá)［29］。在上述結(jié)果中，我們所構(gòu)建的N3ICD真核表達(dá)載體能夠明顯增強(qiáng)NF-κB家族中rela和nfκb1啟動(dòng)子的活性。這不僅說(shuō)明了我們構(gòu)建的真核表達(dá)載體能夠正常表達(dá)并行使功能，也進(jìn)一步證明了Notch3與NF-κB家族密切相關(guān)，并能夠影響NF-κB通路的活化，由此可見(jiàn)Notch3在炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答中也發(fā)揮著重要作用。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果能夠?yàn)榻窈笥诎唏R魚(yú)中深入研究Notch3在發(fā)育生物學(xué)、先天免疫及炎癥等方面的功能提供幫助。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了斑馬魚(yú)N3ICD真核表達(dá)載體，并進(jìn)行了表達(dá)分析，所構(gòu)建的N3ICD真核表達(dá)載體能夠?qū)F-κB家族中rela和nfκb1啟動(dòng)子的活性產(chǎn)生影響，使其活性明顯升高。