周旻超王振亞*王弼陡羅剛銀馬思齊

激光掃描共聚焦光譜系統(tǒng)設(shè)計(jì)

周旻超1，2，王振亞2*，王弼陡2，羅剛銀2，馬思齊2

（1.復(fù)旦大學(xué) 工程與應(yīng)用技術(shù)研究院，上海 200433；2.中國科學(xué)院 蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所，江蘇 蘇州 215163）

激光掃描共聚焦；Amici棱鏡；色散線性度；共光軸直視型

1 引言

激光掃描共聚焦顯微鏡成像光學(xué)分辨率介于傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡之間，能夠?qū)崿F(xiàn)高分辨率下的無損三維成像，把光學(xué)顯微成像技術(shù)推向了全新的應(yīng)用階段，是國內(nèi)外從事生物醫(yī)學(xué)和材料科學(xué)研究不可或缺的高端科研設(shè)備［1-2］。與傳統(tǒng)寬場(chǎng)顯微鏡相比，共聚焦顯微鏡通過針孔濾波的方式，消除焦平面外雜散光的干擾，可實(shí)現(xiàn)光學(xué)層切掃描成像。

隨著生物醫(yī)學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，對(duì)被測(cè)樣品進(jìn)行多種熒光標(biāo)記物標(biāo)記的需求日益增高［3］。因此，多光譜成像技術(shù)得到了較為廣泛的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣本不同部位的成像，一般采用不同的熒光染料對(duì)樣本進(jìn)行熒光標(biāo)記，但有些熒光染料激發(fā)譜較寬容易和其他熒光染料激發(fā)譜重疊。為避免多種熒光成像時(shí)的熒光串?dāng)_問題，激光掃描共聚焦顯微系統(tǒng)引入了多光譜成像技術(shù)［4-5］。共聚焦實(shí)現(xiàn)光譜成像的主要方式有濾光片式、光柵式以及棱鏡式等，其中分光元件是光譜成像的核心部件［6-7］。濾光片式熒光分光組件的應(yīng)用方便簡單，但它是固定的波長組合，很大程度上限制了熒光染料選擇的靈活性，很難解決熒光串?dāng)_問題。因此，光柵或棱鏡分光的方法被更多地應(yīng)用于多光譜成像技術(shù)中。光柵分光具有色分辨率高、色散線性均勻等優(yōu)點(diǎn)，但也有局限性，如光柵系統(tǒng)在寬譜段分光時(shí)，存在譜線疊加問題；制造工藝導(dǎo)致光柵分光的雜散光較多，加工難度較大；光柵是通過衍射分光，能量利用率只能達(dá)到總能量的60%～70%左右［8］。共聚焦成像熒光信號(hào)較為微弱，光譜衍射效率是十分重要的指標(biāo)。棱鏡分光原理簡單，性能穩(wěn)定，熒光透射效率高（一般大于90%），十分適合應(yīng)用于共聚焦顯微鏡的光譜成像。共聚焦顯微鏡棱鏡式分光一般采用單棱鏡，由于棱鏡材料本身的性質(zhì)，光譜分辨率存在非線性問題，短波段的色分辨率高，長波段的色分辨率低，因此不同波段的光譜分辨率也是不同的。除此之外，單棱鏡的色散會(huì)引起光線在傳播方向上的偏折，給光學(xué)裝調(diào)增加了一些難度。

復(fù)合棱鏡組合在設(shè)計(jì)方面具有更高的靈活性，在保證較高的能量利用率的同時(shí)，通過選擇棱鏡的材料以及控制各棱鏡的角度實(shí)現(xiàn)入射和出射光束共軸，以及色散的非線性校正［9］。共聚焦顯微鏡的模塊化研發(fā)需要考慮結(jié)構(gòu)小型化、空間利用率高、裝調(diào)簡單等因素，本文采用雙Amici棱鏡結(jié)構(gòu)作為色散元件，根據(jù)Amici棱鏡的光學(xué)特性推導(dǎo)其共軸條件，優(yōu)化材料和棱鏡頂角實(shí)現(xiàn)了寬光譜、共光軸、直視型光譜分光系統(tǒng)，大大改善了棱鏡分光的非線性。

2 系統(tǒng)組成

激光掃描共聚焦顯微鏡主要由掃描模塊、顯微鏡和光譜成像模塊等部分組成，如圖1所示。掃描模塊中的激光進(jìn)入顯微鏡后被物鏡聚焦在被測(cè)樣本上，激發(fā)出的熒光經(jīng)顯微鏡進(jìn)入掃描模塊，在二向色鏡處透射，再經(jīng)針孔透鏡聚焦后通過針孔進(jìn)入光譜成像模塊。光譜成像模塊由準(zhǔn)直透鏡、分光棱鏡、聚焦透鏡、可變狹縫以及光電倍增管（Photomultiplier Tube， PMT）組成，熒光進(jìn)入光譜成像模塊后先由準(zhǔn)直透鏡準(zhǔn)直成平行光，再進(jìn)入分光棱鏡和聚焦透鏡，分光棱鏡將熒光展開成一定寬度的光譜帶，利用可調(diào)狹縫進(jìn)行光譜選擇并由PMT采集信號(hào)。

圖1　共聚焦光譜系統(tǒng)組成

3 Amici結(jié)構(gòu)建模及設(shè)計(jì)

本文從棱鏡的光學(xué)特性出發(fā)，根據(jù)光束傳輸角度、棱鏡組頂角和材料折射率推導(dǎo)Amici棱鏡組的非線性設(shè)計(jì)方程，并利用小角度近似推導(dǎo)出的線性方程組計(jì)算初始解。在初始解的基礎(chǔ)上進(jìn)行非線性優(yōu)化，最終找到滿足線色散的共軸直視型Amici棱鏡組。

3.1　線性和非線性設(shè)計(jì)方法

根據(jù)斯涅爾定律和幾何關(guān)系可以得出光線在棱鏡組中各角度關(guān)系：

圖2　Amici棱鏡分光示意圖

假設(shè)波長和折射率近似呈線性關(guān)系，中心波長的色散可以寫成：

根據(jù)棱鏡材料的平均折射率可計(jì)算各元素的頂角：

實(shí)際上，大多數(shù)棱鏡不能完美滿足小角度近似，因此在設(shè)計(jì)過程中一般使用線性方程得到初始解，然后利用光學(xué)設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行最終的非線性優(yōu)化。直視系統(tǒng)中目標(biāo)值，°，光譜波段為400～700 nm。假設(shè)系統(tǒng)材料分別為BK7和SF6，在滿足目標(biāo)值的條件下，棱鏡頂角的線性和非線性表示如圖3所示。

3.2　玻璃材料選擇

另一種表示光譜色散線性度的方法是取色散梯度的最大值和最小值之比，即光譜采樣率（Spectral Sampling Ratio， SSR），SSR表示光譜波段非線性色散偏差的最大量。若SSR=2，最短波長對(duì)應(yīng)的光譜寬度為1 nm，則最長波長對(duì)應(yīng)的光譜寬度為2 nm。

表1Amici棱鏡參數(shù)表

Tab.1　Parameters of Amici prism

3.3　雙Amici棱鏡

雙Amici棱鏡由3個(gè)棱鏡元素組成，結(jié)構(gòu)完全對(duì)稱，如圖4所示。第一個(gè)棱鏡和第三個(gè)棱鏡完全一樣，具有相同的材料和頂角［11-12］。

圖4　雙Amici棱鏡示意圖

雙Amici棱鏡的對(duì)稱性表示其線性方程和Amici棱鏡組的線性方程幾乎相同，在第一個(gè)元素的表達(dá)式前乘以系數(shù)2得到［13］：

與式（5）相同，利用線性方程推導(dǎo)出棱鏡的頂角表達(dá)式為：

其線性方程組如下：

表2雙Amici棱鏡參數(shù)表

Tab.2　Parameters of double Amici prism

圖5　不同棱鏡角色散對(duì)比曲線

4 光學(xué)系統(tǒng)仿真

圖6　共聚焦顯微成像的光學(xué)仿真結(jié)果

根據(jù)圖6（a）可知，光束在像面上的色散距離為4.5 mm左右，即棱鏡的角色散為4°，色散線性程度與理論計(jì)算結(jié)果基本一致。

5 實(shí)　驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)利用可變狹縫和單軸精密位移臺(tái)模擬電機(jī)移動(dòng)，白光通過光纖進(jìn)入準(zhǔn)直透鏡后經(jīng)過棱鏡分光，再由透鏡將光譜帶聚焦在狹縫面。這里選擇頂角為60°的等邊色散單棱鏡和由3個(gè)等邊棱鏡膠合成的雙Amici棱鏡進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。其中，雙Amici結(jié)構(gòu)在棱鏡組合外層選擇低色散材料，內(nèi)層為高色散材料。因此，在有限范圍內(nèi)外層選擇F2材料（d=36.37），內(nèi)層選擇N-SF11材料（d=24.76）。實(shí)驗(yàn)測(cè)試平臺(tái)如圖7所示。

圖7　棱鏡線性度測(cè)試平臺(tái)

圖8　實(shí)驗(yàn)與理論對(duì)比結(jié)果

圖9　共聚焦顯微鏡照片

該雙Amici棱鏡結(jié)構(gòu)經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后，放置到激光掃描共聚焦顯微鏡的光譜成像模塊中進(jìn)行光譜成像實(shí)驗(yàn)。圖9（a）是激光掃描共聚焦顯微鏡，圖9（b）是共聚焦產(chǎn)品的光譜成像模塊。

采用光譜成像技術(shù)對(duì)牛肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞切片進(jìn)行了多通道熒光成像。該切片采購自賽默飛世爾科技公司，用DAPI、Alexa Fluor 488和MitoTracker Red 3種染料分別對(duì)牛肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞核、肌動(dòng)蛋白和線粒體進(jìn)行熒光標(biāo)記。采用405，488和561 nm激光同時(shí)去激發(fā)樣本熒光，按照盡量避免熒光串色的原則設(shè)置3種熒光通道的帶寬，DAPI激發(fā)的熒光光譜設(shè)置為［460 nm，490 nm］，Alexa Fluor 488激發(fā)的熒光光譜設(shè)置為［520 nm， 540 nm］，MitoTracker Red激發(fā)的熒光光譜設(shè)置為［600 nm，630 nm］。三通道同時(shí)采集熒光圖像，成像時(shí)間約為5 s，圖像分辨率是2 048×2 048。圖10是三通道熒光成像圖片。從圖10可以看出，不同熒光通道得到的圖像形態(tài)完全不同，說明不同熒光標(biāo)記的細(xì)胞結(jié)構(gòu)都能夠很好地呈現(xiàn)出來，幾乎不存在熒光串色問題。

圖10　牛肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞熒光成像

6 結(jié)　論

高分辨顯微成像近年來發(fā)展迅速，激光掃描共聚焦相比于生物熒光顯微鏡具有高分辨率和寬光譜成像的優(yōu)勢(shì)。目前，市面上共聚焦光譜模塊多選擇單棱鏡或光柵作為分光元件。光柵雖然能實(shí)現(xiàn)更高的光譜分辨率下，但其熒光傳輸效率較低；單棱鏡一般選恒偏向角棱鏡，其分光具有較嚴(yán)重的色散不均勻性且光路需要通過反射鏡轉(zhuǎn)折。本文針對(duì)直視型共軸分光棱鏡展開研究，提出Amici棱鏡和雙Amici棱鏡組的初始結(jié)構(gòu)計(jì)算方法，并利用優(yōu)化算法給出了線性度較好的棱鏡組結(jié)構(gòu)參數(shù)。最終選擇雙Amici棱鏡作為光譜模塊的分光元件，通過光學(xué)仿真實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)色散和中心波長零偏轉(zhuǎn)，整個(gè)光學(xué)模塊結(jié)構(gòu)簡單、緊湊。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：雙Amici棱鏡結(jié)構(gòu)相比單棱鏡具有更好的光譜線性度，可以提高光譜成像時(shí)光譜選擇的準(zhǔn)確性。

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Design of laser scanning confocal spectroscopy system

ZHOU Minchao1，2，WANG Zhenya2*，WANG Bidou2，LUO Gangyin2，MA Siqi2

（1，，200433，；2，，215163，），：

A spectral structure for the double Amici prism was designed to improve the spectroscopic performance of a laser scanning confocal microscope spectroscopy module. Linear and nonlinear mathematical models were formulated for the Amici and double Amici prisms， and the structure parameters of direct-viewing prism were chosen according to the prism dispersion characteristics. The structures of the Amici and double Amici prisms were compared for the same dispersion conditions， and the double Amici prism group was found to provide better dispersion linearity. A common optical axis direct vision spectroscopic system was developed using a double Amici prism for a 400-700 nm spectral range and 5 nm spectral resolution， with central wavelength deviation angle of 0° and maximum dispersion angle of 4°. The experimental results show that the dispersion linearity of this structure is significantly better than that of a single prism. Spectral resolution issues caused by the nonlinear spectroscopic characteristics of prisms are greatly reduced.

laser scanning confocal； Amici prism； dispersion linearity； common optical axis direct vision

TH744.1

A

10.37188/OPE.20223003.0237

1004-924X（2022）03-0237-09

2021-10-12；

2021-11-10.

中國科學(xué)院科研儀器設(shè)備研制項(xiàng)目（No.Y822141202）

周旻超（1985），男，江蘇江陰人，碩士，副研究員，2011年于南京理工大學(xué)獲得碩士學(xué)位，主要從事高/超分辨顯微成像的研究。E-mail：zhoumc@sibet.ac.cn

王振亞（1993），男，江蘇鎮(zhèn)江人，碩士，助理研究員，2018年于蘇州科技大學(xué)獲得碩士學(xué)位，主要從事高/超分辨顯微成像的研究。E-mail：wangzy@sibet.ac.cn