張英琦 劉志鳳 于天源 焦誼 王厚融 徐亞靜 官乾 劉迪

發(fā)熱是兒童疾病最常見的癥狀之一，也是兒童入院的第二大常見原因[1]。小兒推拿治療發(fā)熱歷史悠久，可追溯至隋唐時期，如《厘正按摩要術(shù)》：“小兒發(fā)熱，有表里虛實之異……分陰陽，二百遍。推三關(guān)，一百遍……”，相關(guān)推拿手法一直沿用至今。小兒推拿通過體表干預(yù)激發(fā)體內(nèi)的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，患兒多不抗拒，舒適度高，臨床效果良好。本課題組綜合分析明清至現(xiàn)代小兒推拿專著及臨床資料，最終選用穴位清晰、作用明確、應(yīng)用廣泛、便于操作的退熱六法(開天門、推坎宮、揉太陽、揉耳后高骨、清天河水、推脊)作為干預(yù)方法進行研究。本研究采用大腸桿菌內(nèi)毒素(lipopolysaccharides，LPS)注射方法制備幼兔細菌發(fā)熱模型，旨在觀察推拿退熱六法對內(nèi)毒素誘導(dǎo)發(fā)熱幼兔的退熱作用，探討其作用機制，為進一步揭示臨床小兒推拿退熱的作用機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

2月齡清潔級新西蘭雄性幼兔，體質(zhì)量(2±0.5) kg，體溫(39±0.5)℃，購于北京隆安實驗動物養(yǎng)殖中心，動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK(京)2019-0006。單籠飼養(yǎng)，飼料由北京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。購入后置于室溫20～25℃、相對濕度為40%～60%的飼育室內(nèi)，適應(yīng)性飼養(yǎng)3日后，篩選基礎(chǔ)體溫均一的幼兔共24 只。本實驗所有操作經(jīng)過北京中醫(yī)藥大學(xué)IACUC的批準(BUCM-4-2020083102-3013)，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 藥品及試劑

脂多糖(美國Sigma公司，生產(chǎn)批號：0000081276)、生理鹽水(石家莊四藥有限公司，生產(chǎn)批號：2012141904)、BSA標準品(北京索萊寶科技有限公司，生產(chǎn)批號：20200817)、彩虹 245 廣譜蛋白Marker(北京索萊寶科技有限公司，生產(chǎn)批號：1223C021)、三氯乙醛(上海麥克林生化科技有限公司，生產(chǎn)批號：C10323759)、BCA蛋白定量試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，生產(chǎn)批號：20200903)、10×TBST (北京索萊寶科技有限公司，生產(chǎn)批號：20210311)、兔源COX-2抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號：AI06116399)、PGE2 ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，生產(chǎn)批號：20210101-72205A)。

1.3 主要實驗儀器

信息化生物信號采集與處理系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)、溫度探頭(成都泰盟科技有限公司)、電子天平[美國雙杰兄弟(集團)有限公司]、電泳儀(美國 BIO-RAD 公司)、Mini-P-2 電泳槽( 美國BIO-RAD公司)、 MultiSkan3酶標儀(美國 Thermo公司)、水平脫色搖床(北京六一公司)、Fresco 低溫冷凍離心機(美國Thermo公司)。

1.4 動物分組與造模

采用隨機數(shù)字表法將24只幼兔隨機分為3 組，即鹽水對照組、模型組和退熱六法組，每組8只。鹽水對照組經(jīng)耳緣靜脈予以1 mL/kg無熱源生理鹽水注射。模型組、退熱六法組均采用LPS注射方法制備發(fā)熱幼兔模型，藥物用量、給藥方式參考文獻[2]及課題前期研究[3]制定：用生理鹽水將LPS稀釋至0.5 μg/mL，并按1 mL/kg劑量經(jīng)幼兔耳緣靜脈注射給藥。以注射造模后1小時內(nèi)開始發(fā)熱，肛溫升高0.6℃以上為造模成功。

1.5 干預(yù)方法

鹽水對照組、模型組、退熱六法組所有動物推拿手法操作部位于實驗前一天剃毛。造模成功后，退熱六法組以室溫清水為介質(zhì)，按照如下步驟進行手法操作：①退熱六法第一法：開天門(兔兩眉骨內(nèi)側(cè)中點至神庭穴[4])直推200次，操作2分鐘[5]；②退熱六法第二法：推坎宮(兔內(nèi)眼角，上下眼瞼交界處直上至眶上突外端[2])直推200次，操作2分鐘[4]；③退熱六法第三法：揉太陽(兔外眼角后上方顳窩中[2])揉200次，操作2分鐘[4]；④退熱六法第四法：揉耳后高骨(兔寰椎翼前緣直上方凹陷處[2])揉24次掐3下，操作2分鐘[4]；⑤退熱六法第五法：清天河水(兔腕橫紋至肘橫紋[2])500次，操作5分鐘[6]；⑥退熱六法第六法：推脊(兔背中線上，第7頸椎與第1胸椎棘突間至尾根[2])300次，操作5分鐘[4]。在相同時段內(nèi)模型組、鹽水對照組幼兔在已剃毛部位涂抹與退熱六法組等量的室溫清水，并抓握，但不進行推拿手法干預(yù)。

操作者均取得執(zhí)業(yè)醫(yī)師資格證并接受統(tǒng)一培訓(xùn)，以保證操作手法、刺激量等相同。直推時，操作者食、中二指并攏，余三指握拳，用力要均勻、持久、輕柔，在表皮操作，不能帶動皮下組織，以皮膚不發(fā)紅為度。操作者肩、肘、腕關(guān)節(jié)放松，靠肘關(guān)節(jié)的屈伸活動來實現(xiàn)。揉法操作時操作者手指不可離開皮膚表面，以前臂帶動手腕做環(huán)形而有節(jié)律的運動。操作時，操作者手指蘸水要干濕得易，不可過干或過濕。

1.6 觀察指標及檢測方法

1.6.1 體溫變化值 使用BL-420N生物信號采集系統(tǒng)于造模后每20分鐘連續(xù)監(jiān)測肛溫至造模后180分鐘，即干預(yù)后120分鐘。

1.6.2 血常規(guī)檢測 分別于干預(yù)前、干預(yù)后120分鐘于兔耳緣靜脈采血0.5 mL，置于含 EDTA抗凝管中，以五分類血液分析儀檢測白細胞、中性粒細胞百分比。

1.6.3 血、肝、肺組織取材 干預(yù)后120分鐘，幼兔腹腔注射水合氯醛后處死。開腹，下腔靜脈取血5 mL，使用低溫離心機4℃，3 000 r/min離心15分鐘，取上清液。取肝、肺組織置于液氮罐中冷凍，后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.4 血、肝、肺組織前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)表達 使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA法)對外周血、肝、肺PGE2濃度進行檢測，具體過程如下：標準品孔加不同濃度標準品50 μL；樣本孔加樣本稀釋液40 μL，待測樣品10 μL，后每孔加入酶標試劑100 μL，37℃孵育60分鐘，再用洗滌液洗滌5次，拍干。隨后在各反應(yīng)孔中加入顯色劑A50 μL，顯色劑B50 μL，振蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘，最后加入終止液50 μL終止反應(yīng)。隨后將反應(yīng)孔板置于酶標儀中讀取數(shù)據(jù)，波長設(shè)置450 nm。檢測操作過程全部按照試劑盒說明書進行。

1.6.5 肝、肺組織環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase，COX-2)表達 每份樣本組織加入預(yù)冷的RIPA裂解液1 mL充分研磨，12 000 r/min 低溫離心15分鐘后取上清液。用BCA蛋白定量試劑盒測定各樣本蛋白濃度后，確定蛋白上樣量，加入5倍SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。目標蛋白上樣后電泳，先恒定電壓60 V電泳20分鐘，后恒定電壓80 V電泳90分鐘。轉(zhuǎn)膜時操作條件為恒定電壓100 V轉(zhuǎn)移70分鐘。加入10%脫脂牛奶封閉2小時后，將PVDF膜按蛋白分子量剪開。1×TBST每10分鐘洗1次，共洗3次。分別加入一抗COX-2抗體(1∶1 000)及一抗GADPH 抗體(1∶1 000)，搖床上室溫孵育1小時后4℃冰箱過夜。洗膜：1×TBST每10分鐘洗1次，共洗3次。經(jīng)二抗HRP-羊抗兔、HRP-羊抗鼠IgG(1∶10 000)室溫搖床孵育1小時。1×TBST每10分鐘洗1次，共洗5次。然后使用ECL試劑盒曝光顯影，條帶曝光完畢后，PVDF膜自然晾干后封存。應(yīng)用Image J分析軟件計算目標條帶積分光密度值。

1.7 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 各組幼兔各時段體溫的變化值

造模后幼兔體溫明顯升高，與鹽水對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。研究過程中大部分動物出現(xiàn)明顯的精神萎靡，頭面、耳廓明顯發(fā)燙，甚至出現(xiàn)粗大喘息、腹瀉等癥狀，提示造模成功。模型組與退熱六法組在干預(yù)前體溫差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。鹽水對照組體溫?zé)o明顯波動，模型組體溫維持較高水平。推拿退熱六法干預(yù)可降低幼兔的體溫。與模型組比較，在退熱六法干預(yù)后各監(jiān)測時間點，體溫增長幅度均低于模型組，在干預(yù)后20分鐘、80分鐘、100分鐘、120分鐘差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2 各組幼兔白細胞、中性粒細胞變化

干預(yù)前，即造模后60分鐘，模型組、退熱六法組白細胞計數(shù)、中細粒細胞百分比顯著低于鹽水對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示細菌感染模型造模成功。模型組與退熱六法組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明兩組在干預(yù)前無差別，具有可比性。干預(yù)后120分鐘，模型組、退熱六法組白細胞仍顯著低于鹽水對照組(P<0.05)，模型組與退熱六法組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。模型組、退熱六法組中性粒細胞百分比與鹽水對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與模型組相比，退熱六法組中性粒細胞明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組幼兔干預(yù)前、干預(yù)后120分鐘白細胞、中性粒細胞計數(shù)變化

2.3 各組幼兔血、肝、肺組織PGE2表達量比較

干預(yù)后120分鐘，與鹽水對照組相比，模型組血、肝、肺組織PGE2表達量顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。退熱六法組血PGE2較鹽水對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，肝、肺組織PGE2較鹽水對照組差異顯著(P<0.05)。退熱六法組較模型組，血、肝、肺組織PGE2表達量均降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組幼兔血、肝、肺PGE2表達量比較

2.4 各組幼兔肝、肺組織中COX-2蛋白表達水平比較

模型建立后，模型組幼兔肝、肺組織COX-2蛋白表達增加，與鹽水對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。推拿干預(yù)后120分鐘，與模型組比較，退熱六法組肝、肺組織COX-2表達水平顯著下降(P<0.05)。見表4、圖1、圖2。

表1 各組幼兔干預(yù)前、干預(yù)后120分鐘各時間點體溫變化值

表4 各組幼兔肝、肺COX-2表達量比較

注：Y 鹽水對照組；M 模型組；T 退熱六法組。

注：Y 鹽水對照組；M 模型組；T 退熱六法組。

3 討論

發(fā)熱由外源性致熱原進入機體刺激單核細胞、巨噬細胞等產(chǎn)生內(nèi)生致熱原，繼而作用于體溫調(diào)節(jié)中樞影響體溫調(diào)定點所致。神經(jīng)細胞進一步引發(fā)交感神經(jīng)系統(tǒng)興奮，促進機體局部或者全身的發(fā)熱反應(yīng)[7]。

本課題組通過對古今文獻進行研究，總結(jié)出“退熱六法”(開天門、推坎宮、揉太陽、揉耳后高骨、清天河水、推脊)作為實驗干預(yù)手段[8]。這些穴位位置明確，療效顯著，刺激量相對固定。其中頭面部四大手法(開天門、推坎宮、揉太陽、揉耳后高骨)是具有代表性的退熱手法。孫重三先生的《兒科推拿療法簡編》將頭面部四大手法列為所有手法之首，用于治療感冒、頭痛、急慢驚風(fēng)等兒科常見病?！疤旌铀笔切和颇锰囟ㄑㄖ?，清天河水，性微涼，清熱而不傷陰，虛熱、實熱皆可用，是使用頻率最高的退熱手法[9]。督脈為陽脈之海，脊柱穴位于督脈之上，推脊能夠調(diào)節(jié)陽氣，瀉一身之火。在小兒退熱手法基礎(chǔ)上加上推脊能更有效地控制小兒發(fā)熱，并且操作方便，簡便易行[10]。

血常規(guī)中的白細胞和中細粒細胞值是判斷血液細菌感染的主要指標[11]。劉曉紅等[12]通過實驗發(fā)現(xiàn)，兔在感染發(fā)熱期會出現(xiàn)精神怠倦、顫抖、身體蜷縮、白細胞數(shù)降低，之后隨著體溫的升高進入高峰期，白細胞數(shù)漸漸上升，中性粒細胞數(shù)增多。本實驗觀察到模型組、退熱六法組耳緣靜脈注射LPS后血白細胞、中性粒細胞顯著降低。退熱六法組在干預(yù)后，中性粒細胞受到明顯下調(diào)，提示退熱六法的解熱作用與調(diào)節(jié)外周中性粒細胞有關(guān)。白細胞計數(shù)與文獻有差異，可能與檢測的時間點有關(guān)，仍需進一步研究。

前列腺素(prostaglandin，PG)是體溫調(diào)節(jié)的重要介質(zhì)，在體溫調(diào)節(jié)研究中占有重要地位[13]。PGE2是內(nèi)源性熱原介導(dǎo)的外周免疫反應(yīng)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)體溫調(diào)節(jié)之間的連接紐帶，是多種致熱原誘導(dǎo)體溫升高的中樞共同通路。環(huán)氧合酶(cyclooxygenase，COX)是合成前列腺素的關(guān)鍵限速酶[14]，COX-2在整個炎癥的發(fā)生、消退修復(fù)過程中可見大量持續(xù)的表達[15]，選擇性阻斷COX-2可完全消除發(fā)熱反應(yīng)[16]。Kupffer細胞是機體內(nèi)最大的巨噬細胞群，在發(fā)熱的啟動過程和終止過程中起到重要的作用。肝巨噬細胞也被認為是外周致熱原性細胞因子的主要細胞來源[17]。在LPS誘導(dǎo)的發(fā)熱過程中，COX-2在肝和肺部的巨噬細胞中大量表達[18]。本實驗觀察到經(jīng)LPS靜脈注射刺激，可明顯誘導(dǎo)幼兔血、肝、肺組織中PGE2含量增加，肝、肺組織COX-2表達水平的明顯增高。經(jīng)退熱六法干預(yù)后，這些組織的PGE2、COX-2表達量均下降，提示退熱六法的解熱作用與降低外周PGE2的含量以及COX-2的表達有關(guān)。

本研究實驗結(jié)果顯示，推拿退熱六法能明顯抑制發(fā)熱幼兔的體溫上升，下調(diào)血中性粒細胞百分比，降低外周血、肝、肺PGE2水平，抑制肝、肺組織中COX-2的表達，其機制值得進一步深入研究，以闡明推拿手法治療小兒發(fā)熱的起效途徑，為研究推拿退熱機制提供科學(xué)依據(jù)，為臨床治療發(fā)熱類疾病提供參考。