焦曉佳 ，吳利洋 ，陳艷紅 ，2，姜澤東 ，2，倪輝 ，2，李清彪 ，2，朱艷冰 ，2*

（1.集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021）（2.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，廈門市食品生物工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361021）

褐藻膠又名海藻酸鈉（alginate），分子式為(C6H7NaO6)n，它是一類從海帶和巨藻等藻體中分離提取的線性多糖[1]。褐藻膠寡糖是褐藻膠降解的低分子聚合物，它由古羅糖醛酸和甘露糖醛酸兩種結(jié)構(gòu)單元組成。由于其分子量低、水溶性好、穩(wěn)定性高、安全無毒、生物活性突出[2-7]等特點，近年來受到研究人員的高度關(guān)注。褐藻膠的降解途徑主要包括酶法、化學(xué)法、物理法等[8]。褐藻膠寡糖的酶法制備由于具有良好的生物活性且不易被破壞、反應(yīng)環(huán)境條件溫和、產(chǎn)物得率高等特點而得到廣泛運用。

褐藻膠裂解酶，是多糖裂解酶的一種，它可通過β-消除反應(yīng)將褐藻膠降解為在非還原端具有雙鍵的不飽和寡糖[9]。游離酶存在熱穩(wěn)定性差、使用壽命短、回收重復(fù)利用難等缺點。固定化酶是利用化學(xué)或者物理方法將游離酶與載體結(jié)合，使其固定在有限空間內(nèi)，是一種能夠保持催化活性且實現(xiàn)可重復(fù)使用的酶，在一定程度上可解決上述問題[10]。共價結(jié)合法、吸附法、包埋法和交聯(lián)法作為酶固定化的主要方法被廣泛報道[11]。磁性納米粒子作為一種吸附材料，不僅具有比表面積大、毒性低、粒徑小、生物相容性好等納米材料的優(yōu)點，而且更具有獨特的磁學(xué)性質(zhì)，外加磁場，易于磁液分離，操作簡便快捷，可作為酶固定化的載體[12]。然而，磁性納米顆粒的應(yīng)用因其在水介質(zhì)中的聚集性而受到限制，改性對抑制磁性納米粒子的聚集具有重要作用[13]。通過適當(dāng)?shù)谋砻嫘揎?，磁性納米顆?？梢员惶厥饣鶊F功能化，有助于防止載體的聚集和氧化，促進(jìn)載體與酶分子的有效結(jié)合。單寧酸是一種天然的低成本且分子量較高的多酚類物質(zhì)，常用作磁性納米顆粒改性劑[14]。目前對于褐藻膠裂解酶的研究多數(shù)集中在酶的制備、酶學(xué)性質(zhì)表征和發(fā)酵工藝優(yōu)化等方面[15，16]，對該酶的固定化研究較少。該文以固定化酶的酶活力和酶活回收率為指標(biāo)，探索單寧酸功能化Fe3O4磁性納米粒子固定化褐藻膠裂解酶的優(yōu)化工藝條件，并對固定化酶進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)表征和酶學(xué)性質(zhì)鑒定，以期為固定化褐藻膠裂解酶的工業(yè)應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

NH3·H2O、FeCl3·6H2O、FeSO4·7H2O、單寧酸、戊二醛、PEG 6000等試劑均為分析純，購于上海國藥集團有限公司。含微泡菌褐藻膠裂解酶基因的大腸桿菌基因工程菌[17]由集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院食品生物技術(shù)團隊構(gòu)建與保藏。

1.2 儀器與設(shè)備

JEOL JEM2100F透射電鏡，日本 Electronics-Corporation；8400S傅里葉變換紅外光譜儀，日本島津公司；冷凍干燥儀，美國Thermo Fisher公司；FE20K pH計，Mettler Toledo公司；KQ5200DE數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 Fe3O4磁性納米粒子的制備

載體的制備參考Atacan等[18]的方法，略加以修改。按Fe2+/Fe3+=3/5的比例，在400 mL去離子水中加入4.17 g 的 FeSO4·7H2O（0.02 mol/L）和 6.76 g 的FeCl3·6H2O（0.03 mol/L）。將混合溶液通入 N2，80 ℃、200 r/min攪拌1 h，然后迅速加入40 mL NH3·H2O，反應(yīng)30 min后，加入5 g表面活性劑PEG 6000，在N2下再攪拌反應(yīng)1 h，然后冷卻至室溫。用熱水洗滌獲得的Fe3O4納米粒子5次，期間用磁性分離法分離，最后在70 ℃真空干燥箱中干燥過夜。

1.3.2 單寧酸功能化 Fe3O4磁性納米粒子的制備

在40 mL蒸餾水中加入2 g Fe3O4磁性納米粒子并超聲15 min，得到均勻分散的磁性納米粒子，通入N2，200 r/min、40 ℃持續(xù)攪拌1 h后加入2.50%（m/V）單寧酸溶液，接著通入N2，200 r/min、40 ℃持續(xù)攪拌2 h，將混合物冷卻至室溫。磁鐵收集制備的單寧酸功能化Fe3O4磁性納米粒子，收集物先后用乙醇和去離子水洗滌三次。最后在70 ℃真空干燥箱中干燥過夜。

1.3.3 褐藻膠裂解酶粗酶液的制備

將已經(jīng)活化好的重組褐藻膠裂解酶大腸桿菌基因工程菌液按1.20%的接種量接種到含有50 mg/mL卡那霉素的250 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min搖動培養(yǎng)至 OD600值達(dá)到 0.60～0.80，加入 25 μL 0.50 mol/L的異丙基-β-D-吡喃半乳糖苷（IPTG）溶液，在18 ℃、180 r/min條件下誘導(dǎo)表達(dá)20 h后。將誘導(dǎo)的菌液置于4 ℃離心（8000 r/min、10 min），取菌體沉淀物重懸于15 mL 50 mmol/L的NaH2PO4-Na2HPO4（pH 8.00）緩沖液。在低溫條件下對菌體進(jìn)行細(xì)胞超聲破碎處理（300 W、10 min），然后在4 ℃條件下，10000 r/min離心20 min。取上清液低溫保存，上清液即為褐藻膠裂解酶液。

1.3.4 褐藻膠裂解酶的固定化條件優(yōu)化

固定單寧酸功能化磁性納米粒子為10 mg，戊二醛交聯(lián)時間為3 h、固定化溫度為5 ℃、固定化時間為3 h、固定化pH為7.00、加酶量為0.60 U，以固定化酶活力和酶活回收率為測定指標(biāo)，研究不同戊二醛濃度（V/V，0.00%、1.00%、2.00%、3.00%、4.00%）、不同戊二醛交聯(lián)時間（1、2、3、4和5 h）、不同酶固定化溫度（5、15、25、35、45 ℃）、不同酶固定化時間（1、2、4、6、8和10 h）、不同酶固定化pH（4.00、5.00、6.00、7.00、8.00、9.00和10.00）、不同加酶量（0.60、1.20、1.80、2.40、3.00和3.60 U）對褐藻膠裂解酶固定化的影響。保持其他因素不變，逐一進(jìn)行單因素試驗，每個因素最優(yōu)結(jié)果用于下一個單因素試驗。

1.3.5 固定化褐藻膠裂解酶的制備

在50 mL磨口具塞錐形瓶中加入0.50 g單寧酸功能化磁性納米粒子和終濃度為 1.00%的戊二醛溶液，超聲處理5 min后于室溫下交聯(lián)2 h。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行磁分離，利用去離子水對載體進(jìn)行清洗，然后加入10 mL溶于50 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4（pH 8.00）緩沖液的褐藻膠裂解酶粗酶液（60 U），5 ℃下反應(yīng)8 h，磁分離后，用去離子水清洗固定化褐藻膠裂解酶，真空冷凍干燥后，4 ℃貯藏備用。

1.3.6 酶學(xué)性質(zhì)測定

1.3.6.1 褐藻膠裂解酶的活力測定

利用 3，5-二硝基水楊酸（DNS）法可以測定褐藻膠裂解酶固定化前后的酶活力[19]。游離酶的活力測定：取20 μL褐藻膠裂解酶粗酶液加入到 180 μL 5 mg/mL海藻酸鈉溶液（以 pH 8.00、50 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液配制海藻酸鈉溶液）中，混勻物在35 ℃反應(yīng)10 min后，加入400 μL DNS溶液終止反應(yīng)，沸水浴10 min，在540 nm處測吸光度值。固定化酶的活力測定：用10 mg固定化褐藻膠裂解酶替代20 μL的游離褐藻膠裂解酶粗酶液，其余操作同游離酶的活力測定。褐藻膠裂解酶的活力定義：在上述條件下每分鐘生成 1 μmol還原糖所需的酶量為一個酶活力單位（U）。

1.3.6.2 溫度對酶活性和穩(wěn)定性的影響

測定游離酶、固定化酶在不同溫度（25、35、45、55、65 ℃）條件下的酶活力，研究溫度對酶活性的影響。將游離酶、固定化酶在35 ℃下溫育1 h后，測定酶的殘余活力，表示酶在 35 ℃下的穩(wěn)定性，以未經(jīng)處理的酶活力為100%。

1.3.6.3 pH對酶活性和穩(wěn)定性的影響

分別以Na2HPO4-檸檬酸緩沖液（pH 4.00～6.00）、Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液（pH 7.00～8.00）、巴比妥鈉緩沖液（pH 8.50～9.00）和 Gly-NaOH 緩沖液（pH 9.50～11.00）作為底物緩沖液，測定游離酶、固定化酶在不同pH條件下的酶活力，研究pH對酶活性的影響。將游離酶、固定化酶在pH 8.0下溫育1 h后，測定酶的殘余活力，表示酶在pH 8.0下的穩(wěn)定性，以未經(jīng)處理的酶活力為100%。

1.3.6.4 酶的存儲穩(wěn)定性測定

將游離酶和固定化酶分別在 4 ℃條件下貯存 30 d，每隔5 d取樣測定酶的殘余活力，計算酶活力的半衰期，研究酶的存儲穩(wěn)定性。

1.3.6.5 固定化酶的操作穩(wěn)定性測定

將10 mg固定化酶加入200 μL 5 mg/mL海藻酸鈉底物溶液（底物溶于pH 9.50、50 mmol/L Gly-NaOH緩沖液中），35 ℃反應(yīng)10 min后，將固定化酶與反應(yīng)液進(jìn)行磁分離，反應(yīng)液加入400 μL DNS溶液，沸水浴10 min，在540 nm處測吸光度值，測定固定化酶的活力。分離的固定化酶利用去離子水洗滌3次后，進(jìn)行下一次催化反應(yīng)。固定化酶連續(xù)重復(fù)使用5次，研究酶的操作穩(wěn)定性。

1.3.7 固定化酶的透射電子顯微鏡和傅里葉紅外變換光譜分析

利用透射電子顯微鏡觀察固定化褐藻膠裂解酶、單寧酸功能化Fe3O4磁性納米粒子載體的形態(tài)。樣品用KBr壓片法制樣，用傅里葉紅外變換光譜儀進(jìn)行檢測，測試范圍4000～400 cm-1。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

為保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，上述各項實驗均重復(fù)3次，結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的方式來表示。使用Excel 365軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析、Origin 9.00軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素對褐藻膠裂解酶固定化的影響

2.1.1 戊二醛濃度對酶固定化的影響

戊二醛因使用過程簡便高效而成為酶固定化中常用的交聯(lián)劑之一。戊二醛可以促進(jìn)酶和載體之間產(chǎn)生多點共價連接，可以減少外部因素對其構(gòu)象變化造成的干擾，因此提高了酶的穩(wěn)定性[20，21]。本研究利用戊二醛作為固定化酶制備的交聯(lián)劑，研究不同戊二醛濃度對褐藻膠裂解酶固定化的影響。由圖1可見，在戊二醛濃度達(dá)到1.00%時，褐藻膠裂解酶的固定化效率最高，酶活力和酶活回收率分別達(dá)到 13.68 U/g和23.08%。交聯(lián)劑濃度為零時，酶可以通過物理作用吸附在載體表面，但通過物理吸附形成的固定化酶酶活力低于通過戊二醛交聯(lián)形成的固定化酶的酶活力[22]。在一定的濃度范圍內(nèi)，隨著戊二醛濃度的增加，載體與交聯(lián)劑會形成戊二醛聚合體，可以使固定化效率提高，固定化酶活力增大[23]；但隨著戊二醛濃度的逐漸增大，會導(dǎo)致酶活回收率和酶活力降低，可能是戊二醛分子和載體之間出現(xiàn)交聯(lián)體，使得酶分子的構(gòu)象出現(xiàn)變化[24]。Jiang 等[25]和 Chang 等[26]在固定化漆酶、β-葡萄糖苷酶研究中發(fā)現(xiàn)最佳戊二醛濃度分別為8.00%、4 g/L，載體和酶的差異導(dǎo)致最佳條件與本文不同，但在不同戊二醛濃度下，酶的固定化效率與本研究趨勢一致。因此本研究確定戊二醛最優(yōu)的使用濃度為1.00%。

2.1.2 交聯(lián)時間對酶固定化的影響

由圖2可見，載體經(jīng)戊二醛交聯(lián)2 h后與褐藻膠裂解酶進(jìn)行固定化，褐藻膠裂解酶的固定化效率最高，酶活力和酶活回收率分別達(dá)到15.11 U/g和24.81%。隨著交聯(lián)時間的增加，固定化酶的活力有所降低，可能是因為戊二醛暴露在空氣中的時間變長導(dǎo)致其穩(wěn)定性較差，因為戊二醛的穩(wěn)定性受到溫度、氧氣含量等外界因素的影響[27]。另外，當(dāng)戊二醛以游離態(tài)存在時，所占體積小，容易擴散，很容易與酶分子進(jìn)行交聯(lián)；反應(yīng)過程中形成的戊二醛二聚物可能會導(dǎo)致固定化酶活力的下降[28]。因此本研究確定戊二醛最優(yōu)的交聯(lián)時間為2 h。

2.1.3 溫度對酶固定化的影響

由圖3可見，酶的固定化在低溫條件下進(jìn)行比較有利，在5 ℃下對褐藻膠裂解酶進(jìn)行固定化，酶活力和酶活回收率達(dá)到最大，分別為16.50 U/g和27.09%。隨著固定化溫度的逐漸變高，褐藻膠裂解酶固定化的效果變差，這是因為較高的溫度會使酶活力下降，進(jìn)而使得固定化酶活力降低。因此本研究確定最優(yōu)的固定化溫度為5 ℃，肖瓊等[29]報道瓊膠酶固定化最佳溫度條件與本研究一致。

2.1.4 固定化的時間對酶固定化的影響

由圖4可見，當(dāng)褐藻膠裂解酶與載體的固定化時間達(dá)到8 h時，酶活力和酶活回收率最大，分別為18.38 U/g和27.98%。這可能是因為固定化時間較短時，酶和載體結(jié)合不充分；時間過長，固定上去的酶較多，酶活性中心被掩埋，產(chǎn)生的位阻效會導(dǎo)致固定化酶活力下降。此外，隨著固定化時間的延長，游離酶活力下降也是導(dǎo)致酶活回收率和固定化酶活力下降的原因，因此本研究確定最優(yōu)的固定化時間為8 h。相關(guān)研究也有報道隨著固定化時間的延長，固定化效率出現(xiàn)先增后降的趨勢[30，31]。另外，阮貴華等以戊二醛為交聯(lián)劑，在研究磁性納米粒子對胰蛋白酶固定化時間影響時發(fā)現(xiàn)最佳固定化時間為4 h，陳蕭蕭等利用海藻酸鈉固定化脂肪酶與蛋白酶，確定最佳固定化時間為30 min?？梢姽潭ɑd體、固定化酶的種類不同都會對固定化時間造成影響。

2.1.5 固定化體系pH值對酶固定化的影響

pH值對酶的穩(wěn)定性和催化性能有一定的影響[32]。由圖5可見，隨著pH的逐漸增大，固定化褐藻膠裂解酶的酶活力和酶活回收率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，說明過酸或者過堿均可能導(dǎo)致固定化酶的活力下降，固定化酶在微堿環(huán)境下酶活力相對較高。這是因為pH值影響物質(zhì)的電離狀態(tài)，進(jìn)而對固定化褐藻膠裂解酶的活力產(chǎn)生了影響。當(dāng)固定化體系的pH值為8.00時，酶活力和酶活回收率均達(dá)到最大，分別為19.66 U/g和29.92%，因此本研究確定最優(yōu)的固定化體系pH值為8.00。游離褐藻膠裂解酶[17]的最適反應(yīng)pH與本研究最優(yōu)固定化體系pH一致，說明在游離酶最適pH條件下進(jìn)行固定化，有利于褐藻膠裂解酶固定化效率的提高。

2.1.6 加酶量對酶固定化的影響

由圖6可見，當(dāng)加酶量從0.60 U增加到3.60 U時，固定化褐藻膠裂解酶的酶活力和酶活回收率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當(dāng)加酶量為1.20 U時，酶活力和酶活回收率均達(dá)到最大，分別為36.56 U/g和30.55%。固定化酶活力及酶活回收率在一定范圍內(nèi)與加酶量呈現(xiàn)正相關(guān)性，可能是因為載體固定的酶量有限，在低濃度范圍內(nèi)，隨著加酶量的增加，酶分子與戊二醛的連接幾率變大；繼續(xù)增加游離酶的量，酶活力和酶活回收率反而呈下降趨勢，可能是因為游離酶的濃度逐漸變大，使得載體表面結(jié)合的酶趨于飽和，部分酶分子相互聚集使其活性中心互相掩埋，影響酶與底物的結(jié)合[33]。因此針對10 mg的單寧酸功能化磁性納米粒子載體，本研究確定最優(yōu)的加酶量為1.20 U。

2.1.7 褐藻膠裂解酶固定化前后酶學(xué)性質(zhì)比較

褐藻膠裂解酶的游離酶和固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)比較見表1所示。固定化操作沒有改變褐藻膠裂解酶的最適反應(yīng)溫度。游離酶的最適反應(yīng)pH為8.00，固定化酶的最適反應(yīng)pH為9.50。在35 ℃處理1 h后，固定化酶的殘余酶活力為90.10%，游離酶的殘余酶活力為4.90%。褐藻膠裂解酶在pH 8.00條件下處理1 h后，固定化酶的殘余酶活力為94.80%，游離酶的殘余酶活力為72.30%。上述結(jié)果表明，固定化操作顯著提高了褐藻膠裂解酶的溫度穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性。存儲穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性也是評價固定化酶應(yīng)用價值的重要指標(biāo)。本研究中，固定化酶和游離酶在4 ℃條件下酶活力半衰期分別約為25 d、7 d。固定化酶重復(fù)使用次數(shù)為5次后，酶的相對活力為66%。上述結(jié)果表明，固定化褐藻膠裂解酶具有良好的存儲穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性。與Li等[34]的介孔氧化鈦顆粒固定化褐藻膠裂解酶研究結(jié)果相比，本文研究的單寧酸功能化的Fe3O4磁性納米顆粒固定化褐藻膠裂解酶除了具有相似的酶學(xué)性質(zhì)，還具有良好的存儲穩(wěn)定性。

表1 褐藻膠裂解酶固定化前后的酶學(xué)性質(zhì)比較Table 1 Comparison of enzymatic properties of alginate lyase before and after immobilization

2.2 固定化酶的透射電子顯微鏡分析

透射電子顯微鏡分析顯示，單寧酸功能化的Fe3O4磁性納米粒子的粒徑均勻，納米粒子間空隙較多，呈疏散蓬松狀（圖7a和b）。褐藻膠裂解酶固定化后，固定化酶連接緊密，空隙減少，呈不規(guī)則層疊狀（圖7c和d）。這些結(jié)果表明，載體和酶之間產(chǎn)生連接作用，形成的酶聚集體可以提高固定化酶的穩(wěn)定性。

2.3 固定化酶的傅里葉紅外變換光譜分析

利用傅里葉變換紅外光譜儀分析磁性納米粒子固定化前后紅外吸收峰的變化情況，從而判斷褐藻膠裂解酶是否成功固定在功能化載體表面。圖8中所示的是單寧酸功能化的磁性納米粒子（a）與固定化褐藻膠裂解酶（b）的傅里葉紅外變換光譜。圖8a顯示，565 cm-1處出現(xiàn)的峰是Fe3O4的特征吸收峰，1610 cm-1附近的吸收峰代表羰基的存在。在1500 cm-1和1430 cm-1處出現(xiàn)的兩個吸收峰對應(yīng)著羧酸鹽的-COO-吸收特征譜帶，這表明單寧酸經(jīng)氧化后形成的羧酸基與粒子表面發(fā)生了化學(xué)鍵合[35]。在3159 cm-1附近的吸收峰代表羥基的存在，表明該載體已經(jīng)成功被單寧酸修飾。由圖8b可看出，除了具有Fe3O4的特征吸收峰外，固定化褐藻膠裂解酶還出現(xiàn)新的吸收峰，1450 cm-1附近的吸收峰代表-NH2伸縮振動；1657 cm-1附近的吸收峰代表-CONH伸縮振動，常見于蛋白質(zhì)的紅外圖譜中[36]。以上結(jié)果表明，褐藻膠裂解酶成功地固定在單寧酸功能化的Fe3O4磁性納米載體上。

3 結(jié)論

本文以單寧酸功能化的 Fe3O4磁性納米粒子（TA-MNPs）作為固定化酶的載體，對微泡菌褐藻膠裂解酶進(jìn)行了固定化工藝優(yōu)化，獲得了包含戊二醛濃度為1.00%、交聯(lián)時間為2 h、固定化溫度為5 ℃、固定化時間為8 h、固定化pH為8.00和加酶量為1.20 U的最適固定化條件，最適條件下處理的固定化酶活力和酶活回收率分別達(dá)到36.56 U/g和30.55%。微泡菌褐藻膠裂解酶固定化后，酶的溫度穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性和存儲穩(wěn)定性顯著提高。良好的酶學(xué)性質(zhì)使該酶在相關(guān)領(lǐng)域具有應(yīng)用潛力。傅里葉紅外變換光譜和透射電子顯微鏡分析結(jié)果表明，單寧酸修飾的Fe3O4磁性納米顆粒是微泡菌褐藻膠裂解酶固定化的良好載體。