胡仲琳， 劉偉才

（上海牙組織修復與再生工程技術研究中心，同濟大學口腔醫(yī)學院，同濟大學附屬口腔醫(yī)院口腔修復教研室，上海 200072）

遺傳性釉質發(fā)育不全（amelogenesis imperfecta，AI）是一組相似疾病的總稱，是指在牙齒發(fā)育過程中， 由于遺傳因素而引起的牙釉質形成或礦化障礙，不伴有其他全身性疾病，可同時伴有前牙開牙合或牙齒敏感癥等[1]。根據(jù)調查人群的不同，AI 的患病率為1/14 000～1/12 000，是口腔科學領域的遺傳性疾病。 AI 發(fā)病原因及其致病因素眾多，并且臨床表現(xiàn)也有很大不同，具有臨床異質性和遺傳異質性[2]。AI 患者臨床表現(xiàn)包括牙釉質的厚度、硬度及顏色等的異常，主要分為4 類：發(fā)育不全型、鈣化不全型、成熟不全型及復合型[3]。 AI 的遺傳方式有常染色體顯性遺傳、 常染色體隱性遺傳及X 性連鎖遺傳，目前研究者已經證實多個與AI 相關的致病基因，如釉原蛋白基因 （amelogenin，AMELX）、 釉蛋白基因（enamelin，ENAM）、激肽釋放酶（kallikrein-4，KLK-4）編碼基因等[1，4]。

FAM83H 屬于FAM83 家族， 位于染色體8q24.3，包含5 個外顯子，由1 179 個氨基酸組成，絕大部分氨基酸由五號外顯子編碼。該基因在2008年被首次報道與常染色體顯性釉質鈣化不全型AI相關， 目前所知道的致鈣化不全型AI 的FAM83H基因突變眾多，致病性突變通常位于最后一個外顯子中編碼287 位絲氨酸至694 位谷氨酸的序列之間[5-7]。 目前，關于FAM83H 突變導致鈣化不全型AI的發(fā)病機制尚不清楚，本課題前期研究[8-9]發(fā)現(xiàn)，一個FAM83H 致病突變（c.1354C＞T， p.Gln452*）就能導致鈣化不全型AI。為進一步理解AI 的發(fā)病機制，本研究利用細胞功能實驗對FAM83H 第452 位谷氨酰胺位點突變的致病性進行驗證。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

DMEM 高糖培養(yǎng)基，胰酶消化液，青/鏈霉素混合液（HyClone 公司，美國）；胎牛血清（Gibco 公司，美國）；TRIzol 試劑盒（Invitrogen 公司， 美國）；FAM83H 野生型及突變型病毒表達載體由上海創(chuàng)濟生物科技有限公司（中國）設計合成；DAPI 溶液（Solarbio 公司，中國）；PCR 工作儀（Bio-red 公司，美國）；熒光定量PCR 儀（Roche 公司，德國）；熒光顯微鏡（Nikon 公司，日本）等。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)永生化人胚胎腎上皮細胞HEK293T，并將其置于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，1～2 d傳代1 次。

1.2.2 穩(wěn)轉細胞系構建 將HEK293T 細胞鋪在皿中，待細胞密度長至70%～80%后，分別轉染pCDH慢病毒空載、pCDH-FAM83H-wild-HA 慢病毒表達載體及pCDH-FAM83H-mut-HA 慢病毒表達載體，Sanger 測序進行驗證。 轉染24 h 后，采用嘌呤霉素（puromycin）對細胞株進行篩選，篩選10 d 后，熒光顯微鏡下觀察轉染效率。

1.2.3 RNA 提取與實時定量聚合酶鏈反應（RTqPCR） 上述3 組細胞穩(wěn)轉株以1×106/孔的密度接種于含有適量完全培養(yǎng)基的12 孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞密度至80%～90%后， 將實驗細胞用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）沖洗3 次，使用TRIzol 法提取細胞總RNA，測量其濃度；根據(jù)TaKaRa 公司逆轉錄試劑盒說明書操作，將RNA 轉換為cDNA；按照RT-qPCR 試劑說明書，進行操作。FAM83H 正向引物序列：5'-GGCCCCTCACATTTGGCTT-3'，反向引物序列：5'-GCAGATCCACGTCGGTAAACA-3'；內參對照GAPDH 正向引物序列：5'-CATCTGAGGGCCCACTG-3'，反向引物序列：5'-GAGGCCATGTAGGCCATGA-3'。 反應程序為30 s，95 ℃；5 s，95 ℃；30 s，60 ℃，共45 個循環(huán)。

1.2.4 免疫熒光 將滅菌處理的細胞爬片放入24 孔板中，以6×103/孔的密度將FAM83H-wild 和FAM83H-mut 細胞種于細胞爬片上。 細胞匯合達80%時，棄去培養(yǎng)基，PBS 溶液漂洗3 次，用4%多聚甲醛室溫固定20 min；PBS 漂洗3 次，加入含DAPI 的熒光封片劑封片，固定后于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 統(tǒng)計學分析 采用GraphPad prism 8.0 軟件對基因間的數(shù)據(jù)進行處理。 采用t檢驗法比較2 組之間的差異，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 病毒表達載體構建

課題組前期文獻及家系研究[8-9]發(fā)現(xiàn)，位于人類染色體Chr8q24.3 區(qū)域FAM83H 基因第5 號外顯子的第1354 位發(fā)生C＞T 的雜合突變 （c.1354C＞T， p.Gln452*），該突變導致鈣化不全型AI，且該位點氨基酸谷氨酰胺在小鼠、大鼠、狼、黑猩猩等物種中具有高度保守性，說明該位點對于維持FAM83H 基因的功能有重要作用。根據(jù)基因突變序列構建突變病毒載體，以期檢測該位點突變后該蛋白對細胞的功能影響，對病毒載體進行測序確認載體構建成功（圖1）。

圖1 病毒表達載體測序結果Figure 1 Sequencing results of viral expression vector

2.2 載體轉染效率檢測

pCDH 慢病毒空載、pCDH-FAM83H-wild-HA 及pCDH-FAM83H-mut-HA 慢病毒表達載體分別感染對數(shù)期生長的293T 細胞，感染48～72 h 后，細胞高表達綠色熒光蛋白（圖2）。

圖2 轉染后48 h 的細胞熒光圖（×40）Figure 2 Fluorescence picture of cells 48 h after transfection（×40）

2.3 RT-qPCR 檢測

RT-qPCR 結果顯示，轉染后，與野生型相比，突變型FAM83H mRNA 表達水平降低（圖3）。

圖3 RT-qPCR 結果Figure 3 RT-qPCR results

2.4 細胞熒光實驗

FAM83H 蛋白免疫熒光發(fā)現(xiàn)， 野生型FAM83H蛋白主要在細胞質內， 而突變后的FAM83H 蛋白進入細胞核，這說明突變型FAM83H 導致AI 的主要機制可能為在細胞內的作用位點不同所導致的（圖4）。

圖4 2 組免疫熒光染色結果（×400）Figure 4 Immunofluorescence results of two groups（×400）

3 討論

本研究成功構建了pCDH-FAM83H-wild-HA 慢病毒表達載體及pCDH-FAM83H-mut-HA 慢病毒表達載體。轉染后，293T 細胞形態(tài)無明顯變化，轉染效率高，并且成功構建了293T 穩(wěn)轉細胞株。 FAM83H基因突變研究結果發(fā)現(xiàn)， 相較于野生型， 突變型FAM83H 的mRNA 表達水平降低；細胞熒光染色結果顯示，突變后的FAM83H 蛋白主要作用在細胞核內，而野生型FAM83H 蛋白主要在胞質中。

FAM83H 是一個胞內蛋白，主要分布于高爾基體，因此推測其功能與高爾基體密切相關。FAM83H基因編碼非特異性胞內蛋白，其除在牙齒發(fā)育過程表達外，還在腎、膀胱、喉及子宮等多種組織中表達[10]。Kim 等[11]在2008 年首次報道FAM83H 為鈣化不全型AI 的主要致病基因， 隨后越來越多的FAM83H 基因突變位點被發(fā)現(xiàn)，多數(shù)致病性突變位點均位于5 號外顯子287 位至694 位氨基酸之間。Kweon 等[12]和Wang 等[13]構 建FAM83H 過 表 達 和 敲除轉基因小鼠模型，發(fā)現(xiàn)小鼠釉質組織學形態(tài)無明顯變化，表明單純FAM83H 功能亢進或喪失可能不是導致AI 的主要致病機制。 目前比較認同的說法是，F(xiàn)AM83H 致病性突變可能導致蛋白作用區(qū)域發(fā)生變化， 同時細胞免疫熒光結果顯示， 突變后的FAM83H 蛋白主要表達于細胞核中。 盡管FAM83H突變可逃避無義介導的mRNA 降解，有學者發(fā)現(xiàn)位于470 谷氨酰胺至610 位谷氨酸之間較少有無義突變的發(fā)生，可能與該區(qū)段作用于無義介導的mRNA降解相關，該區(qū)段無義突變后無法轉錄翻譯，導致FAM83H 功能喪失， 患者臨床釉質發(fā)育形態(tài)無異常，導致該區(qū)段突變報道較少[7]。 但實驗結果發(fā)現(xiàn)突變后mRNA 表達降低，可能是突變后轉錄水平下降的原因[6]。 FAM83 蛋白家族的成員通過其共有的N端DUF1669 結構域與異位絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶CK1 家族的亞細胞相互作用并調節(jié)其亞細胞分布，F(xiàn)AM83H 與CK1 亞型共定位于細胞質和細胞核形成斑點狀結構。Kuga 等[14]發(fā)現(xiàn)FAM83H 通過氨基端與CK1α 結合，羧基端與角蛋白絲結合，招募CK1α到角蛋白絲中調節(jié)角蛋白細胞骨架的形成；FAM83H 過表達的癌細胞中還有上皮細胞極性的缺失和E-鈣黏蛋白的表達， 提示FAM83H 過表達誘導的CK1α 介導的角蛋白絲拆卸參與了結直腸癌的侵襲和/或轉移。 同時相關研究表明，突變后的FAM83H 攜同CK1α 入核，導致胞質內β-連環(huán)蛋白（β-catenin）磷酸化減少，轉位入核增多，核積聚現(xiàn)象發(fā)生，致使Wnt/β-catenin 信號通路激活，抑制釉質礦化[15]。 此外，肝癌組織標本中FAM83H 的核表達與較高的腫瘤分期和較高的術前血清α-甲胎蛋白水平有顯著關系，F(xiàn)AM83H 的表達升高對肝癌患者治療效果及預后有著重要影響，同時原癌基因MYC參與了FAM83H 表達的轉錄調節(jié)[16]。 有研究表明，F(xiàn)AM83H 與NCK1/2 酪氨酸激酶相互作用和共定位，這種相互作用由FAM83H 末端富含脯氨酸的基序介導，它們與NCK1/2 的第2 個和第3 個SH3 結構域特異性地相互作用；而觸發(fā)FAM83H C 端截短的致病性AI 突變蛋白保留了它們與CK1 亞型的相互作用，但與NCK1/2 失去了相互作用，其相互作用機制及影響尚不清楚[17]。 盡管對于釉質發(fā)育不全致病基因FAM83H 的研究越來越多，然而其在釉質形成過程中的機制尚不明確，需進一步探索FAM83H在釉質發(fā)育不全中的作用及致病機制，為釉質發(fā)育不全疾病的防治提供可靠依據(jù)。

綜上所述，本文通過構建FAM83H 基因突變表達載體，對轉染后的293T 細胞進行RT-qPCR 及細胞免疫熒光檢測，分析突變后FAM83H 基本功能的變化，證明該位點突變后FAM83H 蛋白在細胞內作用位點發(fā)生了改變，F(xiàn)AM83H 在調控釉質形成的過程中，可能對多種不同的信號通路均有影響。 近期的研究表明，JNK 和p38 可能是FAM83H 表達的關鍵調控元件，JNK/p38 MAPK 通路在NaF 誘導的FAM83H 表達中起著至關重要的作用[18]；FAM83H通過調節(jié)CK1α 來調節(jié)經典Wnt/β-catenin 信號通路。這為我們發(fā)掘FAM83H 調控鈣化不全型釉質發(fā)育不全癥機制，提供了有力依據(jù)。 為了更好地利用FAM83H 在釉質發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，促進釉質發(fā)育不全生物治療的發(fā)展，有關FAM83H 在釉質形成過程中的作用，以及其突變后如何影響釉質形成，這些方面需要進一步探索。