王 濤張子君張逸鳴王曉峰鄒慶道

(遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所,遼寧 沈陽 110161)

番茄斑萎病毒(TSWV)是一種極具破壞性的農(nóng)作物病毒病原,嚴(yán)重威脅我國番茄生產(chǎn)。番茄感染TSWV后莖和葉片出現(xiàn)發(fā)育不良,葉片呈青銅色、卷曲、出現(xiàn)壞死斑點(diǎn)和條紋,產(chǎn)量也隨之大幅度減少甚至絕收。TSWV的傳播媒介主要是西花薊馬,帶毒的成年薊馬感染一棵健康的植株只需30 min[1～2]。培育抗病番茄新品種是預(yù)防TSWV最直接有效的方法,研究者在栽培番茄和野生番茄中均發(fā)現(xiàn)有TSWV的抗源。迄今為止,已報(bào)道的抗病基因有8個(gè),包括Sw1a,Sw1b,sw2,sw3,sw4,Sw-5,Sw-6和Sw-7[3～4],其中只有在秘魯番茄中發(fā)現(xiàn)的Sw-5基因廣泛應(yīng)用在番茄育種中。Sw-5對(duì)TSWV的各種小種均表現(xiàn)較好的抗性,并且對(duì)番茄斑萎病毒屬的其他病毒也具有抵抗作用。攜帶Sw-5的植株可有效地限制TSWV的擴(kuò)散,僅在局部位置出現(xiàn)輕微過敏性癥狀。研究者利用RFLP分子標(biāo)記將Sw-5定位在第9染色體臨近端粒區(qū)域的長臂上,位于標(biāo)記CT71和CT220之間[5]。隨后Spassova等利用圖位克隆法克隆了該基因[6]。Dianese等利用Sw-5序列的一個(gè)InDel突變,開發(fā)出一個(gè)共顯性CAPS標(biāo)記,該標(biāo)記的擴(kuò)增子包含了Sw-5b啟動(dòng)子的一段保守序列[7]。

番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)同樣是一種危害嚴(yán)重的番茄病毒,在世界上最重要的植物病毒中排名第三。TYLCV由粉虱傳播引起,自傳入我國南方地區(qū)以來,發(fā)展迅猛,目前已在多個(gè)省份大面積爆,市場(chǎng)上不抗TYLCV的番茄品種幾乎難以推廣應(yīng)用。目前已報(bào)道的抗TYLCV基因有5個(gè),包括Ty-1、Ty-2、Ty-3、Ty-4和Ty-5,育種實(shí)踐中利用的抗性基因主要是前3個(gè),部分高抗番茄品種甚至同時(shí)攜帶Ty-1、Ty-2和Ty-3三個(gè)抗性基因。Verlaan等克隆了Ty-1基因,同時(shí)發(fā)現(xiàn)該基因與Ty-3是等位基因[8]。Yang等利用圖位克隆法將Ty-2定位在11號(hào)染色體上的UP8 (51.344 Mb)和M1 (51.645 Mb)標(biāo)記之間[9]。Garcia等開發(fā)出一個(gè)與Ty-2緊密連鎖的共顯性SCAR標(biāo)記T0302[10]。

利用分子標(biāo)記輔助選擇是快速準(zhǔn)確篩選抗病育種材料最有效的方法,本研究獲得了Sw-5和Ty-2的連鎖分子標(biāo)記,通過體系優(yōu)化,建立同時(shí)檢測(cè)番茄Sw-5和Ty-2基因的雙重PCR技術(shù),為聚合以上兩個(gè)基因提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用番茄試材共27份,均來自遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所番茄課題組。其中1、3和4號(hào)為純合抗TSWV(Sw-5/Sw-5)材料,5、6、7、9和10號(hào)為雜合抗TSWV(Sw-5/Sw-5)材料,2和8號(hào)為不含Sw-5的感病材料。1號(hào)和6號(hào)為純合抗TYLCV(Ty-2/Ty-2)材料,3、5、8、9和10號(hào)為雜合抗TYLCV(Ty-2/ty-2)材料,2、4和7號(hào)為不含Ty-2的感病材料。11-27號(hào)為抗性未知的待檢測(cè)番茄材料。

1.2 引物

與Sw-5和Ty-2基因緊密連鎖的SCAR標(biāo)記分別參照Dianese等和Garcia等的設(shè)計(jì)(表1),引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成[7,10]。

表1 所用引物的序列信息Table 1 The sequences of primers used in this research

1.3 單引物PCR擴(kuò)增

在番茄植株幼苗期,采集新鮮葉片,采用CTAB法提取DNA,將DNA濃度稀釋至5 ng/μl備用。用于PCR反應(yīng)的所有藥品均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。單引物擴(kuò)增的 PCR反應(yīng)體系為 20 μl,包含DNA模板5 μl,上下游引物各1 μl(10 μmol/L),10×buffer 2 μl,dNTP0.5 μl(10 mmol/L),Taq酶(Sw-5)2U/(Ty-2)1U,ddH2O補(bǔ)足20 μl。PCR擴(kuò)增在德國耶拿PCR儀上進(jìn)行,反應(yīng)程序分為3步,第一步:94 ℃預(yù)變性 5 min;第二步:94 ℃變性30 s,相應(yīng)退火溫度復(fù)性45 s,72 ℃延伸30 s,35個(gè)循環(huán);第三步:72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物加入6×Loading buffer,然后在電泳儀上進(jìn)行電泳檢測(cè)。瓊脂糖凝膠的濃度為3%,goodview染色,固定電壓120 V,電泳時(shí)間為20 min,然后將瓊脂糖凝膠取出,在BIO-RAD Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)下進(jìn)行拍照。

1.4 雙重PCR擴(kuò)增

雙重PCR反應(yīng)體系為20 μl。通過體系優(yōu)化和反應(yīng)程序調(diào)整,最終確定雙重 PCR體系為:模板DNA 5 μl,兩對(duì)上下 游 引物 各0.75 μl (10 μmol/L) ,dNTP 0.5 μl (10 mmol/L),10×Buffer 2 μl,Taq酶2U,ddH20補(bǔ)充至20 μl。多重PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s,54 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,循環(huán)次數(shù)為40個(gè),72 ℃再延伸10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 Sw-5基因連鎖標(biāo)記的PCR擴(kuò)增

利用Sw-5的共顯性SCAR標(biāo)記對(duì)10份番茄材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增,1、3和4號(hào)純合抗TSWV材料擴(kuò)增出574 bp特異條帶,5、6、7、9和10號(hào)雜合抗TSWV材料擴(kuò)增出574 bp和464 bp兩條特異條帶,2和8號(hào)不含Sw-5感病材料擴(kuò)增出464 bp特異條帶(圖1A)。

2.2 Ty-2基因連鎖標(biāo)記的PCR擴(kuò)增

利用Ty-2的連鎖標(biāo)記T0302對(duì)上述10份材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增,1和6號(hào)純合抗TYLCV材料擴(kuò)增出900 bp特異條帶,3、5、8、9和10號(hào)雜合抗TYLCV材料擴(kuò)增出800 bp和900 bp 2條特異條帶,2、4和7號(hào)不含Ty-2的感病材料擴(kuò)增出800bp特異條帶(圖1B)。

2.3 同時(shí)擴(kuò)增Sw-5和Ty-2基因的雙重PCR體系的建立

將兩對(duì)特異引物在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增后,同時(shí)含有純合Sw-5和Ty-2基因的抗病材料(1號(hào))擴(kuò)增出574 bp和900 bp特異條帶;含有純合Sw-5和雜合Ty-2基因的抗病材料(3號(hào))擴(kuò)增出了574 bp、800 bp和900 bp 3條帶;含有純合Sw-5而不含Ty-2基因的材料(4號(hào))擴(kuò)增出了574 bp和800 bp特異條帶;含有雜合Sw-5和純合Ty-2基因的抗病材料(6號(hào))擴(kuò)增出464 bp、574 bp和900 bp 3條帶;同時(shí)含有雜合Sw-5和Ty-2基因的抗病材料(5、9和10號(hào))擴(kuò)增出4條帶;含有雜合Sw-5而不含Ty-2基因的材料(7號(hào))擴(kuò)增出了464 bp、574 bp和800 bp 3條帶;不含Sw-5而含有雜合Ty-2基因的材料(8號(hào))擴(kuò)增出464 bp、800 bp和900 bp 3條帶;兩個(gè)抗病基因均不含的感病材料(2號(hào))擴(kuò)增出464 bp和800 bp特異條帶(圖1C)。雙重PCR擴(kuò)增出的條帶清晰,長度差異明顯,極為容易辨識(shí),并且與單引物PCR檢測(cè)結(jié)果完全吻合,因此該雙重PCR體系可以同時(shí)鑒定Sw-5和Ty-2基因。

圖1 連鎖標(biāo)記的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Figure 1 The PCR products amplified by linked markers

2.4 利用雙重PCR技術(shù)篩選抗病番茄材料

利用上述建立的雙重PCR技術(shù)對(duì)17份抗性未知的待檢測(cè)番茄材料進(jìn)行鑒定(圖2)。結(jié)果顯示:11號(hào)材料擴(kuò)增出574 bp和800 bp條帶,為純合抗TSWV材料;12、18、22、24、25和26號(hào)擴(kuò)增出4條帶,為雜合抗TSWV和TYLCV材料;13和21號(hào)擴(kuò)增出464 bp、800 bp和900 bp 3條帶,為雜合抗TYLCV材料;14和27號(hào)擴(kuò)增出464 bp和800 bp 2條帶,不含Sw-5和Ty-2基因;15、17和19擴(kuò)增出464 bp、574 bp和900 bp 3條帶,為雜合抗TSWV,純合抗TYLCV材料;16和20擴(kuò)增出464 bp、574 bp和800 bp 3條帶,為雜合抗TSWV材料;23號(hào)擴(kuò)增出574 bp、800 bp和900 bp 3條帶,為純合抗TSWV,雜合抗TYLCV材料。

圖2 17份番茄材料的雙重PCR擴(kuò)增結(jié)果Figure 2 The double PCR result of 17 tomato lines

3 結(jié)論與討論

番茄是病害較多的一種蔬菜作物,種植戶對(duì)番茄品種的抗病性要求也越來越高,優(yōu)良的番茄品種要抗6種以上主流病害,篩選抗病材料一直都是番茄育種的重要內(nèi)容。目前,分子標(biāo)記輔助選擇已經(jīng)是很常規(guī)的育種手段,利用連鎖標(biāo)記對(duì)抗病基因進(jìn)行鑒定,同時(shí)進(jìn)行基因聚合育種是培育多抗、高抗番茄新品種最有效的方法。對(duì)番茄育種試材進(jìn)行抗病性鑒定往往涉及多個(gè)抗性基因,常規(guī)PCR檢測(cè)已不能滿足目前的育種需求,因此研究者建立了可以同時(shí)鑒定數(shù)個(gè)目標(biāo)基因的多重PCR技術(shù)。例如,利用多重PCR鑒定Ty-1、Ty-3和Mi基因[11],Ty-3a和Tm-2a基因[12],Sw-5和Ty-3a基因等[13],然而未見有關(guān)Sw-5和Ty-2基因的多重PCR報(bào)道。本研究選擇的兩對(duì)引物是目前鑒定Sw-5和Ty-2基因應(yīng)用最廣泛的連鎖SCAR標(biāo)記,無需酶切,實(shí)驗(yàn)操作簡單,共顯性的標(biāo)記特性可區(qū)分雜合抗病材料。在研究中我們發(fā)現(xiàn)Sw-5的連鎖標(biāo)記對(duì)PCR反應(yīng)體系要求較高,起初的PCR擴(kuò)增條帶較為模糊,且無法使用更為快捷的Taq PCR Mix溶液進(jìn)行擴(kuò)增。我們經(jīng)過對(duì)擴(kuò)增體系的優(yōu)化,相應(yīng)提高了Taq酶含量,實(shí)驗(yàn)結(jié)果十分理想,條帶清晰明亮。而Ty-2基因的T0302引物的PCR擴(kuò)增較為順利,無論是常規(guī)PCR藥品還是Taq PCR Mix均可擴(kuò)增出理想的條帶。因此,本研究在摸索雙重PCR體系時(shí),相應(yīng)調(diào)整了引物濃度、Taq酶含量、退火溫度和PCR反應(yīng)循環(huán)次數(shù),最終結(jié)果較為理想,無雜帶干擾,每一種基因型均可輕易識(shí)別。根據(jù)Dianese等報(bào)道,Sw-5的連鎖標(biāo)記可擴(kuò)展出574 bp、510 bp和464 bp 3種帶型,本試驗(yàn)只擴(kuò)增出兩種,510 bp帶型并未出現(xiàn),其原因可能是本研究試材有限,未能覆蓋該標(biāo)記的所有等位基因[7]。

隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展,分子標(biāo)記輔助育種的效率也大幅度提高,研究者將已開發(fā)的連鎖標(biāo)記轉(zhuǎn)化為KASP標(biāo)記,借助高通量的分子檢測(cè)平臺(tái),可在短時(shí)間完成大量試材的基因型鑒定工作,目前國內(nèi)已建立了一些高通量分子檢測(cè)平臺(tái),對(duì)外承接分子檢測(cè)業(yè)務(wù)。這種高通量的檢測(cè)方法不可能覆蓋所有目標(biāo)基因,常規(guī)的PCR檢測(cè)方法也是分子育種必備的一種技術(shù)。本研究建立的雙重PCR技術(shù),操作簡單,穩(wěn)定可靠,極大地提高了Sw-5和Ty-2基因的鑒定效率。