張瑾涵， 吳銀礴， 田萬年， 呂樹臣

(吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，吉林 吉林 132101)

卵形巴貝斯蟲病是經(jīng)蜱傳播，由卵形巴貝斯蟲(Babesiaovata)寄生于牛紅細(xì)胞內(nèi)引起的血液原蟲病[1]。本病具有明顯的季節(jié)性，一般外地引進(jìn)牛感染發(fā)病較為嚴(yán)重，主要臨床癥狀為高熱、貧血、黃疸、血紅蛋白尿[2，3]。1980年，Minami等首次從日本牛的血液中分離到卵形巴貝斯蟲[1]。1986、1994年，我國相繼在河南省盧氏縣、甘肅省張家川回族自治縣飼養(yǎng)牛群中發(fā)現(xiàn)該病并分離到卵形巴貝斯蟲[1]。目前對(duì)卵形巴貝斯蟲病的診斷主要通過臨床癥狀和血液涂片鏡檢方法，由于染色劑及相似病原體等因素，易出現(xiàn)誤診。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，出現(xiàn)了卵形巴貝斯蟲PCR診斷方法[4]。正常生理?xiàng)l件下，熱休克蛋白(Heat shock protein，HSP)在生物體內(nèi)的表達(dá)量較低，當(dāng)機(jī)體處于病原感染或應(yīng)激狀態(tài)時(shí)其表達(dá)量顯著升高[5]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，HSP70基因在生物體進(jìn)化過程中具有高度保守性，目前已應(yīng)用于梨形蟲基因序列系統(tǒng)進(jìn)化分析[6]。本試驗(yàn)通過對(duì)卵形巴貝斯蟲吉林株HSP70基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增測序和系統(tǒng)進(jìn)化分析，為卵形巴貝斯蟲的分類鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料樣品來自吉林省琿春地區(qū)放牧的8頭發(fā)病黃牛(主要表現(xiàn)為貧血)，分別采集每頭牛的頸靜脈血10 mL，置于無菌肝素管中，-20 ℃保存。

1.2 主要試劑、儀器血液DNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒、DL 2 000 DNA Marker[均購自天根生化科技(北京)有限公司]、TaqPreMix(購自華美生物工程有限公司)、PCR儀(型號(hào)：大龍TC1000-G)、電泳槽(型號(hào)：DYCP-31BN)、低溫離心機(jī)(型號(hào)：Sigma 3K30)。

1.3 血液DNA的提取(1)取抗凝血150 μL加入含有細(xì)胞裂解液300 μL的離心管(容積1.5 mL)中，靜置5 min，13 000 r/min離心7 min，棄去上清液。(2)在離心管中加入細(xì)胞裂解液300 μL，再加入蛋白沉淀液100 μL，充分顛倒混勻，13 000 r/min 離心5 min。(3)將上清液倒入含有異丙醇300 μL的新離心管中，13 000 r/min 離心1 min。(4)棄去上清液，加入70%乙醇300 μL，13 000 r/min 離心 1 min，棄去上清液，自然晾干，最后加入雙蒸水(ddH2O) 50 μL，-20 ℃保存?zhèn)溆?。上述均? ℃低溫離心。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成以卵形巴貝斯蟲HSP70DNA序列(GenBank登錄號(hào)：XM_029011319)為參考序列，應(yīng)用軟件Oligo 6.0設(shè)計(jì)特異引物。上游引物：5’-ATGTCTGCTCCGGCTATTGGTA-3’；下游引物：5’-TTAGTCCACCTCCTCGACAGTG-3’。預(yù)擴(kuò)增片段大小1 947 bp，引物退火溫度55 ℃。引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成。

1.5 PCR擴(kuò)增及測序?qū)β研伟拓愃瓜x吉林株HSP70基因進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系25 μL：ddH2O 9.5 μL，TaqPreMix 12.5 μL，DNA 模板2 μL，上、下游引物(濃度10 μmol/L)各0.5 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性35 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸4 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物按DNA回收試劑盒說明書方法進(jìn)行回收，送吉林省庫美生物科技有限公司測序。

1.6 系統(tǒng)進(jìn)化分析運(yùn)用MEGA 7.0軟件對(duì)所測序列與GenBank中的雙芽巴貝斯蟲(BabesiabigeminaAB482178)、牛巴貝斯蟲(BabesiabovisAF107118)、東方巴貝斯蟲(BabesiaorientalisEF512547)、駑巴貝斯蟲(BabesiacaballiAB248742)、犬吉氏巴貝斯蟲(BabesiagibsoniAB440627)、羊巴貝斯蟲(BabesiaovisAB248741)、馬巴貝斯蟲(BabesiaequiAB248743)、分岐巴貝斯蟲(BabesiadivergensAB248739)、東方泰勒蟲(TheileriaorientalisXM_009693862)、環(huán)形泰勒蟲(TheileriaannulataXM_948234)、綿羊泰勒蟲(TheileriaovisAB248747)、瑟氏泰勒蟲(TheileriasergentiD12692)12個(gè)參照序列進(jìn)行比較，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)行同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增及測序由圖1可見：從病料中分離擴(kuò)增的DNA片段大小為1 947 bp。測序結(jié)果顯示，卵形巴貝斯蟲吉林株HSP70基因與卵形巴貝斯蟲日本株(XM_029011319)同源性為99.8%，與雙芽巴貝斯蟲同源性為95.12%，與牛巴貝斯蟲同源性為 86.72%(見圖2)。

M：DL 2 000 Marker；1：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2：陰性對(duì)照?qǐng)D1 HSP70基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 基于HSP70基因序列的巴貝斯蟲同源性分析

2.2 遺傳進(jìn)化分析由圖3可見：卵形巴貝斯蟲吉林株HSP70基因與雙芽巴貝斯蟲(AB482178)親緣關(guān)系較近，與牛巴貝斯蟲(AF107118)及其他蟲種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖3 基于HSP70基因序列的巴貝斯蟲系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 結(jié)論

通過對(duì)卵形巴貝斯蟲吉林株HSP70基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其基因片段大小為1 947 bp；同源性分析表明，與卵形巴貝斯蟲日本株(XM_029011319)同源性為99.8%；系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，與雙芽巴貝斯蟲親緣關(guān)系較近，與牛巴貝斯蟲及其他蟲種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

4 討論

4.1卵形巴貝斯蟲病呈世界性分布，我國河南、甘肅、四川、吉林等地也有該病的報(bào)道，對(duì)牛的危害尤為嚴(yán)重，感染率達(dá)30.52%[7]。隨著我國養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展和牛的頻繁交易，該病在我國流行區(qū)域逐漸擴(kuò)大，已成為嚴(yán)重威脅養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展的重要疾病之一。白啟等[8]通過傳播媒介蜱進(jìn)行人工感染試驗(yàn)表明，卵形巴貝斯蟲與雙芽巴貝斯蟲、牛巴貝斯蟲各為單獨(dú)的蟲種。

4.2目前國內(nèi)有關(guān)卵形巴貝斯蟲的研究較少，據(jù)田萬年等[9]對(duì)卵形巴貝斯蟲18S rRNA序列分析結(jié)果顯示，其與雙芽巴貝斯蟲親緣關(guān)系較近，與牛巴貝斯蟲親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。本試驗(yàn)通過對(duì)卵形巴貝斯蟲吉林株HSP70基因擴(kuò)增，大小為1 947 bp；測序結(jié)果顯示其與雙芽巴貝斯蟲同源性為95.12%，與牛巴貝斯蟲同源性較低(86.72%)；系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，卵形巴貝斯蟲吉林株HSP70基因與雙芽巴貝斯蟲親緣關(guān)系較近，與牛巴貝斯蟲及其他蟲種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。這與田萬年等[9]對(duì)卵形巴貝斯蟲18S rRNA序列分析結(jié)果相一致，與曲志強(qiáng)等[10]基于HSP70基因系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果(雙芽巴貝斯蟲與卵形巴貝斯蟲親緣關(guān)系較近)相一致。本研究進(jìn)一步證明了卵形巴貝斯蟲與雙芽巴貝斯蟲、牛巴貝斯蟲之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，豐富了卵形巴貝斯蟲的遺傳進(jìn)化資料。