張瑾涵， 吳銀礴， 田萬年， 呂樹臣

(吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物科技學(xué)院，吉林 吉林 132101)

卵形巴貝斯蟲病是經(jīng)蜱傳播，由卵形巴貝斯蟲(Babesiaovata)寄生于牛紅細(xì)胞內(nèi)引起的血液原蟲病[1]。本病具有明顯的季節(jié)性，一般外地引進(jìn)牛感染發(fā)病較為嚴(yán)重，主要臨床癥狀為高熱、貧血、黃疸、血紅蛋白尿[2，3]。1980年，Minami等首次從日本牛的血液中分離到卵形巴貝斯蟲[1]。1986、1994年，我國相繼在河南省盧氏縣、甘肅省張家川回族自治縣飼養(yǎng)牛群中發(fā)現(xiàn)該病并分離到卵形巴貝斯蟲[1]。目前對卵形巴貝斯蟲病的診斷主要通過臨床癥狀和血液涂片鏡檢方法，由于染色劑及相似病原體等因素，易出現(xiàn)誤診。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，出現(xiàn)了卵形巴貝斯蟲PCR診斷方法[4]。正常生理條件下，熱休克蛋白(Heat shock protein，HSP)在生物體內(nèi)的表達(dá)量較低，當(dāng)機體處于病原感染或應(yīng)激狀態(tài)時其表達(dá)量顯著升高[5]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，HSP70基因在生物體進(jìn)化過程中具有高度保守性，目前已應(yīng)用于梨形蟲基因序列系統(tǒng)進(jìn)化分析[6]。本試驗通過對卵形巴貝斯蟲吉林株HSP70基因進(jìn)行PCR擴增測序和系統(tǒng)進(jìn)化分析，為卵形巴貝斯蟲的分類鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料樣品來自吉林省琿春地區(qū)放牧的8頭發(fā)病黃牛(主要表現(xiàn)為貧血)，分別采集每頭牛的頸靜脈血10 mL，置于無菌肝素管中，-20 ℃保存。

1.2 主要試劑、儀器血液DNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒、DL 2 000 DNA Marker[均購自天根生化科技(北京)有限公司]、TaqPreMix(購自華美生物工程有限公司)、PCR儀(型號：大龍TC1000-G)、電泳槽(型號：DYCP-31BN)、低溫離心機(型號：Sigma 3K30)。

1.3 血液DNA的提取(1)取抗凝血150 μL加入含有細(xì)胞裂解液300 μL的離心管(容積1.5 mL)中，靜置5 min，13 000 r/min離心7 min，棄去上清液。(2)在離心管中加入細(xì)胞裂解液300 μL，再加入蛋白沉淀液100 μL，充分顛倒混勻，13 000 r/min 離心5 min。(3)將上清液倒入含有異丙醇300 μL的新離心管中，13 000 r/min 離心1 min。(4)棄去上清液，加入70%乙醇300 μL，13 000 r/min 離心 1 min，棄去上清液，自然晾干，最后加入雙蒸水(ddH2O) 50 μL，-20 ℃保存?zhèn)溆?。上述均? ℃低溫離心。

1.4 引物設(shè)計與合成以卵形巴貝斯蟲HSP70DNA序列(GenBank登錄號：XM_029011319)為參考序列，應(yīng)用軟件Oligo 6.0設(shè)計特異引物。上游引物：5’-ATGTCTGCTCCGGCTATTGGTA-3’；下游引物：5’-TTAGTCCACCTCCTCGACAGTG-3’。預(yù)擴增片段大小1 947 bp，引物退火溫度55 ℃。引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成。

1.5 PCR擴增及測序?qū)β研伟拓愃瓜x吉林株HSP70基因進(jìn)行擴增，PCR反應(yīng)體系25 μL：ddH2O 9.5 μL，TaqPreMix 12.5 μL，DNA 模板2 μL，上、下游引物(濃度10 μmol/L)各0.5 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性35 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃終延伸4 min。PCR擴增產(chǎn)物按DNA回收試劑盒說明書方法進(jìn)行回收，送吉林省庫美生物科技有限公司測序。

1.6 系統(tǒng)進(jìn)化分析運用MEGA 7.0軟件對所測序列與GenBank中的雙芽巴貝斯蟲(BabesiabigeminaAB482178)、牛巴貝斯蟲(BabesiabovisAF107118)、東方巴貝斯蟲(BabesiaorientalisEF512547)、駑巴貝斯蟲(BabesiacaballiAB248742)、犬吉氏巴貝斯蟲(BabesiagibsoniAB440627)、羊巴貝斯蟲(BabesiaovisAB248741)、馬巴貝斯蟲(BabesiaequiAB248743)、分岐巴貝斯蟲(BabesiadivergensAB248739)、東方泰勒蟲(TheileriaorientalisXM_009693862)、環(huán)形泰勒蟲(TheileriaannulataXM_948234)、綿羊泰勒蟲(TheileriaovisAB248747)、瑟氏泰勒蟲(TheileriasergentiD12692)12個參照序列進(jìn)行比較，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)行同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增及測序由圖1可見：從病料中分離擴增的DNA片段大小為1 947 bp。測序結(jié)果顯示，卵形巴貝斯蟲吉林株HSP70基因與卵形巴貝斯蟲日本株(XM_029011319)同源性為99.8%，與雙芽巴貝斯蟲同源性為95.12%，與牛巴貝斯蟲同源性為 86.72%(見圖2)。

M：DL 2 000 Marker；1：PCR擴增產(chǎn)物；2：陰性對照圖1 HSP70基因PCR擴增結(jié)果

圖2 基于HSP70基因序列的巴貝斯蟲同源性分析

2.2 遺傳進(jìn)化分析由圖3可見：卵形巴貝斯蟲吉林株HSP70基因與雙芽巴貝斯蟲(AB482178)親緣關(guān)系較近，與牛巴貝斯蟲(AF107118)及其他蟲種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖3 基于HSP70基因序列的巴貝斯蟲系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 結(jié)論

通過對卵形巴貝斯蟲吉林株HSP70基因進(jìn)行PCR擴增，其基因片段大小為1 947 bp；同源性分析表明，與卵形巴貝斯蟲日本株(XM_029011319)同源性為99.8%；系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，與雙芽巴貝斯蟲親緣關(guān)系較近，與牛巴貝斯蟲及其他蟲種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

4 討論

4.1卵形巴貝斯蟲病呈世界性分布，我國河南、甘肅、四川、吉林等地也有該病的報道，對牛的危害尤為嚴(yán)重，感染率達(dá)30.52%[7]。隨著我國養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展和牛的頻繁交易，該病在我國流行區(qū)域逐漸擴大，已成為嚴(yán)重威脅養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展的重要疾病之一。白啟等[8]通過傳播媒介蜱進(jìn)行人工感染試驗表明，卵形巴貝斯蟲與雙芽巴貝斯蟲、牛巴貝斯蟲各為單獨的蟲種。

4.2目前國內(nèi)有關(guān)卵形巴貝斯蟲的研究較少，據(jù)田萬年等[9]對卵形巴貝斯蟲18S rRNA序列分析結(jié)果顯示，其與雙芽巴貝斯蟲親緣關(guān)系較近，與牛巴貝斯蟲親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。本試驗通過對卵形巴貝斯蟲吉林株HSP70基因擴增，大小為1 947 bp；測序結(jié)果顯示其與雙芽巴貝斯蟲同源性為95.12%，與牛巴貝斯蟲同源性較低(86.72%)；系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，卵形巴貝斯蟲吉林株HSP70基因與雙芽巴貝斯蟲親緣關(guān)系較近，與牛巴貝斯蟲及其他蟲種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。這與田萬年等[9]對卵形巴貝斯蟲18S rRNA序列分析結(jié)果相一致，與曲志強等[10]基于HSP70基因系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果(雙芽巴貝斯蟲與卵形巴貝斯蟲親緣關(guān)系較近)相一致。本研究進(jìn)一步證明了卵形巴貝斯蟲與雙芽巴貝斯蟲、牛巴貝斯蟲之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，豐富了卵形巴貝斯蟲的遺傳進(jìn)化資料。