張微 陶西 龐宗文

(廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧530004)

玫煙色棒束孢菌(Isaria fumosorosea)是一種國(guó)際上研究和應(yīng)用都較為廣泛的生防真菌，分布于世界各地，其寄主資源豐富，具有高毒力，能在環(huán)境中繁殖且不易產(chǎn)生抗性[1,2]。近年來(lái)，世界多個(gè)國(guó)家和地區(qū)致力于玫煙色棒束孢菌的研究，不斷有新的玫煙色棒束孢菌株被分離、鑒定和注冊(cè)登記，菌株的生長(zhǎng)和培養(yǎng)條件、侵染途徑和機(jī)理等特征逐漸明確。目前已發(fā)現(xiàn)玫煙色棒束孢菌可侵染柑橘木虱[3,4]、桃蚜[5]、煙粉虱[6]、小菜蛾[7]和茶卷葉蛾[8]等一些重要農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，被廣泛應(yīng)用于害蟲(chóng)的生物防治中。

棒束孢菌的侵染機(jī)理主要是通過(guò)分生孢子萌發(fā)后直接穿入昆蟲(chóng)體表形成芽管，然后進(jìn)入昆蟲(chóng)的血腔中，并在血腔中大量的增殖，最終導(dǎo)致昆蟲(chóng)的死亡[9,10]?？梢?jiàn)棒束孢菌分生孢子的質(zhì)量和產(chǎn)量是防治效果的決定性因素，因此大量收集分生孢子是棒束孢菌用于防治害蟲(chóng)的基礎(chǔ)，而分生孢子產(chǎn)量取決于發(fā)酵工藝[11]。目前國(guó)內(nèi)外使用較廣泛的發(fā)酵方法有液體發(fā)酵法、固體發(fā)酵法及液固雙相發(fā)酵法[12,13]。采用固體發(fā)酵優(yōu)勢(shì)在于固體發(fā)酵中的生長(zhǎng)條件類(lèi)似于微生物自身的天然環(huán)境，可使微生物較好地適應(yīng)且固體發(fā)酵法設(shè)備和操作簡(jiǎn)單、成本低，其培養(yǎng)基組成常采用廉價(jià)的基質(zhì)如麥麩、稻殼、玉米粉和大米等農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品，增加了農(nóng)產(chǎn)品附加值且提高了資源利用率[14,15]。

本研究以玫煙色棒束孢菌為出發(fā)菌株，采用固體發(fā)酵技術(shù)，先采用單因素試驗(yàn)探究了麥麩和玉米粉的不同配料比及發(fā)酵條件對(duì)產(chǎn)孢的影響，并以產(chǎn)孢量為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)對(duì)其發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，確定棒束孢菌的最佳發(fā)酵工藝條件，為棒束孢菌生防菌劑的生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

玫煙色棒束孢菌(菌株保藏編號(hào)GDMCC 3.428)購(gòu)自廣東微生物菌種保藏中心。

1.1.2 主要試劑

麥麩、玉米粉、馬鈴薯(市售)；吐溫-80(CP)、胰蛋白胨(BR)、葡萄糖(AR)、瓊脂(BR)購(gòu)自試劑公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：稱(chēng)取200g去皮的馬鈴薯切塊，加入適量自來(lái)水煮沸30min后用紗布過(guò)濾雜質(zhì)并收集濾液，向其中加入20g葡萄糖，20g瓊脂，用自來(lái)水定容至1000mL，pH自然。

PPDA培養(yǎng)基：在PDA培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加10g·L-1的蛋白胨。

PPD培養(yǎng)基：PPDA培養(yǎng)基去掉瓊脂。

1.2 方法

1.2.1 一級(jí)種子液

在無(wú)菌條件下，用0.05%吐溫-80溶液洗脫在PPDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d的棒束孢菌分生孢子，振蕩均勻后用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定，調(diào)配制成 1×107個(gè)·mL-1的孢子懸浮液，接種于20mL的PPD培養(yǎng)基，25℃、180r·min-1振蕩培養(yǎng)48h，制得一級(jí)種子液。

1.2.2 二級(jí)種子液

按照5%的接種量將一級(jí)種子液轉(zhuǎn)接入100mL PPD培養(yǎng)液中，25℃、180r·min-1繼續(xù)振蕩培養(yǎng)72h，即為二級(jí)菌種培養(yǎng)液，用于固態(tài)發(fā)酵。

1.2.3 固態(tài)培養(yǎng)基的配制

將配制好的培養(yǎng)基裝入250mL三角瓶，每瓶裝樣量為8g，8層紗布包扎放入高壓滅菌鍋121℃滅菌30min，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

1.2.4.1 麥麩與玉米粉的不同比例對(duì)產(chǎn)孢的影響

固體培養(yǎng)基以麥麩為主要組分，通過(guò)添加不同比例的玉米粉為輔料，培養(yǎng)基組分及配比分別為麥麩∶玉米粉=9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5，滅菌后按10%接種量，于25℃的條件下發(fā)酵10d后測(cè)定各組合的產(chǎn)孢量。

1.2.4.2 含水量對(duì)產(chǎn)孢的影響

以篩選出的最佳培養(yǎng)基配方作為固體培養(yǎng)基，在固體基質(zhì)中加入一定量的水，使培養(yǎng)基含水量分別為45%、50%、55%、60%、65%、70%，滅菌后按10%接種量，于25℃條件下發(fā)酵10d后測(cè)定各含水量條件下的產(chǎn)孢量。

1.2.4.3 接種量對(duì)產(chǎn)孢的影響

在明確最優(yōu)培養(yǎng)基和含水量后，在此基礎(chǔ)上設(shè)置接種量為5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%，于25℃條件下發(fā)酵10d后測(cè)定各接種量條件下的產(chǎn)孢量。

1.2.4.4 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)孢的影響

在明確培養(yǎng)基配方、含水量和接種量的基礎(chǔ)上，發(fā)酵溫度設(shè)置為20℃、25℃、28℃、30℃、32℃，發(fā)酵10d后測(cè)定各溫度條件下的產(chǎn)孢量。

1.2.4.5 初始pH對(duì)產(chǎn)孢的影響

在優(yōu)化以上條件的基礎(chǔ)上，調(diào)整培養(yǎng)基用水的pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，發(fā)酵10d后測(cè)定各pH條件下的產(chǎn)孢量。

1.2.4.6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)孢的影響

根據(jù)上述步驟確定的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方、含水量、接種量和溫度的基礎(chǔ)上，發(fā)酵時(shí)間分別為5d、6d、7d、8d、9d、10d、11d，發(fā)酵終止后測(cè)定各發(fā)酵時(shí)間條件下的產(chǎn)孢量。

1.2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素確定的對(duì)產(chǎn)孢量有顯著影響的培養(yǎng)條件(含水量、溫度和時(shí)間)進(jìn)行L9(33)正交試驗(yàn)，各因素和水平的選擇見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)的因素和水平設(shè)計(jì)

1.2.6 檢測(cè)方法

產(chǎn)孢量的檢測(cè)：培養(yǎng)完成后，準(zhǔn)確稱(chēng)取1g固體發(fā)酵基質(zhì)放入250mL的三角瓶中，加入50mL體積分?jǐn)?shù)為0.05%吐溫-80中和若干玻璃珠，置于25℃、180rpm搖床震蕩3h后取出，用紗布過(guò)濾洗脫孢子，利用血球計(jì)數(shù)板對(duì)濾液中的孢子進(jìn)行計(jì)數(shù)。另準(zhǔn)確稱(chēng)取5g固體發(fā)酵基質(zhì)置105℃烘干至恒重，測(cè)定固體發(fā)酵基質(zhì)的含水量，通過(guò)計(jì)算得到1g干曲所含孢子數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 麥麩與玉米粉的不同比例對(duì)產(chǎn)孢的影響

以未添加玉米粉的培養(yǎng)基為對(duì)照，麥麩與玉米粉的不同比例對(duì)棒束孢菌產(chǎn)孢的影響見(jiàn)圖1。從圖1可以看出，當(dāng)麥麩∶玉米粉為7∶3時(shí)產(chǎn)孢量最高。隨著玉米粉量的增加，產(chǎn)孢呈先增加后遞減的趨勢(shì)，其原因可能是培養(yǎng)基中添加適量的玉米粉后可提供菌體生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而玉米粉過(guò)多時(shí)，培養(yǎng)基粘性過(guò)大，透氣性降低，不利于菌株的生長(zhǎng)產(chǎn)孢。

圖1 麥麩與玉米粉的不同比例對(duì)產(chǎn)孢的影響

2.2 含水量對(duì)產(chǎn)孢的影響

含水量對(duì)棒束孢菌產(chǎn)孢的影響見(jiàn)圖2，從圖2可以看出，當(dāng)含水量為60%，最有利于菌株的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢?；|(zhì)中含水量過(guò)低時(shí)，培養(yǎng)基較干燥，菌株不能更好地利用培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)，菌體因缺水而造成生長(zhǎng)受到限制，進(jìn)而影響產(chǎn)孢量。當(dāng)含水量過(guò)高時(shí)，培養(yǎng)基容易結(jié)塊，透氣性降低，不易通風(fēng)，散熱性差，局部溫度高容易造成燒曲，從而影響產(chǎn)孢量。

圖2 含水量對(duì)產(chǎn)孢的影響

2.3 接種量對(duì)產(chǎn)孢的影響

接種量對(duì)棒束孢菌產(chǎn)孢的影響見(jiàn)圖3，從圖3可以看出，在一定范圍下隨著接種量的增加產(chǎn)孢量逐漸增加，當(dāng)接種量為10%時(shí)，產(chǎn)孢量最高，當(dāng)接種量超過(guò)10%時(shí)，產(chǎn)孢量隨著接種量的增加逐漸減少。這可能是因?yàn)榻臃N量過(guò)少時(shí)，無(wú)法滿(mǎn)足菌株的生長(zhǎng)要求，菌體生長(zhǎng)較為緩慢，因此產(chǎn)孢量不高；當(dāng)接種量過(guò)高時(shí)，發(fā)酵前期菌絲大量生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗快，影響后期發(fā)酵孢子的產(chǎn)生，因而產(chǎn)孢量降低。

圖3 接種量對(duì)產(chǎn)孢的影響

2.4 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)孢的影響

發(fā)酵溫度對(duì)棒束孢菌產(chǎn)孢的影響見(jiàn)圖4，從圖4可以看出，菌株在20～32℃條件下均能生長(zhǎng)，產(chǎn)孢量隨著溫度的提高呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)溫度為25℃產(chǎn)孢量達(dá)到最高。分析其原因可能是當(dāng)溫度過(guò)低時(shí)菌株生長(zhǎng)緩慢，產(chǎn)生的菌體量少，不利于產(chǎn)孢。溫度過(guò)高時(shí)，酶活性降低，菌株的生長(zhǎng)受到抑制，進(jìn)而影響產(chǎn)孢，故產(chǎn)孢量較低。

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)孢的影響

2.5 初始pH對(duì)產(chǎn)孢的影響

初始pH對(duì)棒束孢菌產(chǎn)孢的影響見(jiàn)圖5，從圖5可以看出，菌株對(duì)初始pH值不是很敏感， 產(chǎn)孢量變化不大，pH在4.0～8.0都能很好的生長(zhǎng)，其中當(dāng)pH為6.0時(shí)，產(chǎn)孢量達(dá)到最高。因培養(yǎng)基本身的自然pH值為6.0左右，故后續(xù)試驗(yàn)中將采取自然pH值。

圖5 初始pH對(duì)產(chǎn)孢的影響

2.6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)孢的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)棒束孢菌產(chǎn)孢的影響見(jiàn)圖6，從圖6可以看出，發(fā)酵時(shí)間為8d左右時(shí)，達(dá)到最大的產(chǎn)孢量。培養(yǎng)時(shí)間小于8d時(shí)，菌株處于快速生長(zhǎng)期，發(fā)酵不完全，菌體不能充分產(chǎn)孢，因此產(chǎn)孢量較低。而當(dāng)發(fā)酵時(shí)間超過(guò)8d，產(chǎn)孢量呈下降趨勢(shì)，可能是培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，孢子散落粘附在瓶壁上，造成孢子量測(cè)定時(shí)的取樣誤差。

圖6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)孢的影響

2.7 正交試驗(yàn)結(jié)果分析與驗(yàn)證

在單因素優(yōu)化試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)發(fā)酵結(jié)果影響最大的3個(gè)因素含水量(A)、溫度(B)、發(fā)酵時(shí)間(C)，以產(chǎn)孢量為試驗(yàn)指標(biāo)，設(shè)計(jì)3因素3水平L9(33)的正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵條件，其試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法和結(jié)果如表2，方差分析見(jiàn)表3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

表3 方差分析結(jié)果

由表2和表3可知，3個(gè)因素對(duì)產(chǎn)孢量的影響順序A>B>C，即溫度對(duì)產(chǎn)孢量的影響最大，其次是含水量，影響最小的是發(fā)酵時(shí)間。方差分析結(jié)果表明，溫度對(duì)棒束孢菌的產(chǎn)孢量具有顯著影響(P<0.05)，含水量和發(fā)酵時(shí)間對(duì)該菌的產(chǎn)孢量影響都沒(méi)達(dá)到顯著性。通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)得到，溫度、含水量和發(fā)酵時(shí)間的最佳配比為A2B1C2，即溫度為25℃，含水量為55%，發(fā)酵時(shí)間為9d。

2.8 正交試驗(yàn)驗(yàn)證

3 結(jié)果與討論

隨著棒束孢菌殺蟲(chóng)劑需求量的不斷增加，研究者越來(lái)越重視棒束孢菌的生產(chǎn)方法。固體發(fā)酵是一種極好的發(fā)酵工藝方法，可充分利用低成本的農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品進(jìn)行生產(chǎn)。而培養(yǎng)基是影響棒束孢菌固體發(fā)酵的重要因素之一，培養(yǎng)基的優(yōu)劣直接決定了菌株的產(chǎn)孢性能。張婧迪等[16]通過(guò)單因素篩選出金龜子綠僵菌菌株 CY-1的最佳固體發(fā)酵培養(yǎng)基為玉米粉:稻殼=8∶2，產(chǎn)孢量可達(dá)7.45×109孢子·g-1。鄧小軍[17]等利用麥麩、紅壤、谷糠為作為球孢白僵菌BbⅢ22發(fā)酵固體培養(yǎng)基發(fā)現(xiàn)，在m(麥麩)∶m(谷糠)∶m(紅壤) =2∶4∶4時(shí)產(chǎn)孢量最高，但在谷糠基質(zhì)中不生長(zhǎng)。本研究采用麥麩為主，加入一定量的玉米粉的培養(yǎng)基配方進(jìn)行了初步研究，通過(guò)添加一定量的玉米粉可以有效提供充足養(yǎng)分，發(fā)現(xiàn)當(dāng)麥麩和玉米粉為7∶3時(shí)產(chǎn)孢量最大?？梢?jiàn)固體發(fā)酵基質(zhì)的不同，產(chǎn)孢量也不近相同。同時(shí)，菌體的生長(zhǎng)受含水量、接種量、溫度、發(fā)酵時(shí)間和pH等因素的影響。冀媛媛等[18]分析了接種量、初始含水量、培養(yǎng)時(shí)間和初始pH對(duì)放線菌SC1-1產(chǎn)孢的影響，得到最佳發(fā)酵條件為初始含水量400mg·g-1、接種量0.4mL·g-1、溫度28℃、培養(yǎng)時(shí)間192h、初始pH 7.6。景芳等[18]研究表明，當(dāng)發(fā)酵條件為含水量60%、接種量30%、溫度28℃、pH 5.6時(shí)長(zhǎng)枝木霉T6生防菌劑產(chǎn)孢量最高。因此，選擇適合菌株自身生長(zhǎng)的最佳發(fā)酵條件，有利于提高菌體產(chǎn)量，使菌株的生防潛力獲得充分的發(fā)揮。本研究通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)獲得了棒束孢菌產(chǎn)孢量的最佳培養(yǎng)基配方及發(fā)酵工藝條件，為工業(yè)化生產(chǎn)棒束孢菌生防菌劑奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論