李 煜，夏 婷, ，康超艷，田穎蕾，房 彬，閆裕峰，朗繁繁，鄭 宇，王 敏,

（1.食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室，天津市微生物代謝與發(fā)酵過程控制技術(shù)工程中心，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.山西紫林醋業(yè)股份有限公司，山西太原 030400）

肝臟是機體最大的代謝器官，具有免疫功能。細菌、病毒入侵感染機體和藥物、食物中毒等損傷因素對肝細胞的直接作用以及這些損傷因素引起的先天免疫反應(yīng)釋放的細胞因子、趨化因子、過氧化物等多種生物活性物質(zhì)均能引起肝損傷[1-2]。在人體衰老過程中，肝臟的生理功能也會隨之下降，肝細胞的衰老使得肝臟體積縮小，對消化吸收入血物質(zhì)的代謝能力和血液中毒素的清除能力削弱，營養(yǎng)代謝的降低和體內(nèi)毒素的聚集是造成肝損傷的主要原因。嚴重的肝損傷伴發(fā)急性肝衰竭和嚴重并發(fā)癥，威脅著老年群體的生命。脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）位于革蘭陰氏菌細胞外壁上，能激發(fā)人體免疫應(yīng)答和造成組織損傷，吸收后隨血循環(huán)入肝進行清除解毒。在LPS誘導(dǎo)的肝損傷模型中，LPS刺激庫普弗細胞（Kupffer cells，KC）提高趨化因子和黏附分子的合成或釋放，促進中性粒細胞（Polymorphonuclear neutrophil，PMN）、T淋巴細胞及單核巨噬細胞聚集和附著在肝臟組織，分泌多種促炎細胞因子從而損傷肝臟組織[3-4]。另有研究表明，活化的KC能產(chǎn)生白介素-10（interleukin 10，IL-10）等細胞因子，這些細胞因子對炎癥反應(yīng)具有比較強的抑制性，其通過抑止腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor alpha, TNF-α）等促炎因子對組織造成的炎癥性損傷，進而發(fā)揮抗炎作用[5]。因此，降低體內(nèi)炎癥反應(yīng)對肝臟的保護作用極為重要。

食醋作為飲食中非常重要的調(diào)味酸性傳統(tǒng)發(fā)酵食品，它含有豐富的多酚、黃酮、多糖等活性成分。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認為食醋具有收斂止咳、理氣、消腫、止血、潤肺補陰、引藥入肝以及解毒等功效[6]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明食醋能有效抵御機體氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)機體的免疫功能、護肝及預(yù)防心血管疾病等作用[7-8]。研究表明中藥材人參、甘草和五味子中含有多種皂苷類、多糖及黃酮類活性成分，具有抗炎、抗氧化、增強免疫的藥理學(xué)作用，同時還對人體的肝損傷有保護功能，其中甘草酸和木脂素具有極強的抗菌及抗炎活性。醋制中藥能增加藥物中有效成分的溶解度，改變藥物質(zhì)地便于煎煮，提高藥物療效，削弱藥物毒性作用，醋制引藥入肝是中華民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)獨有的醫(yī)學(xué)理論，總結(jié)為醋味酸性微溫，歸肝經(jīng)，具有活血之功效[9]。本研究旨在正常老年小鼠和LPS誘導(dǎo)的老年小鼠炎性肝損傷模型下，探究人參、甘草、五味子復(fù)合醋提物（Medicine vigner extract，MVE）對肝損傷的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

中藥材（人參、甘草、五味子） 北京同仁堂股份有限公司；食醋 山西紫林醋業(yè)股份有限公司；動物ICR小鼠（SPF級）40只，體重（45±3）g，雄性，實驗動物合格證號為SCXK（京）2016-0006，由北京維達爾河實驗動物技術(shù)有限公司提供；谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）試劑盒 南京建成生物有限公司；TNF-α、IL-6、IL-10、白介素-4（interleukin 4，IL-4）、白介素-1β（interleukin 1β，IL-1β）、白介素-17（interleukin 17，IL-17）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、趨化因子配體17（CXC chemokine ligand 17，CXCL17）、趨化因子配體1（CXC chemokine ligand 1，CXCL1）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）試劑盒 上海酶聯(lián)生物科技有限公司；Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）、NF-κB、GAPDH抗體 美國圣克魯斯（Santa Cruze）生物技術(shù)有限公司。

1X2-1LLJ100普通光學(xué)顯微鏡 日本Olympus有限公司；1500全波長酶標儀 美國Thermo有限公司；Odyssey紅外激光成像 美國LI-COR生物技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 復(fù)合醋提物的制備 經(jīng)預(yù)實驗確定復(fù)合醋提物的的制備最佳工藝條件，具體為稱取中藥材（人參5 g、甘草5 g、五味子20 g），加入4.5倍中藥材總質(zhì)量的食醋水溶液（體積濃度為60%）拌勻浸泡過夜，文火醋炒至微干，再噴灑食醋水溶液、晾干、篩去碎屑備用。加入500 mL雙蒸水熬煮后過濾得醋制中藥液5 mL；10 mL食醋與30 mL無水乙醇混勻，靜置后離心（7000 r/min，15 min）、渦旋振蕩20 min、超聲40 min、待混合均勻后置于4 ℃再次離心（7000 r/min，10 min），取上層溶液，隨后在50 ℃溫度條件下使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行蒸發(fā)濃縮，最后得到4 mL醋浸膏。取1 mL醋浸膏與1.3 mL醋制中藥液混勻，得MVE溶液/膏約2.3 g（含750 mg食醋提取物+生藥6 g），制備工藝流程見圖1。

圖1 人參、甘草、五味子復(fù)合醋提物制備工藝流程圖Fig.1 Flowchart of preparation of medicine vinegar extract of Panax ginseng, Glycyrrhiza and Schisandra chinensis

1.2.2 動物實驗分組 40只SPF級雄性ICR老齡小鼠經(jīng)過適應(yīng)性喂養(yǎng)（給予充足飲食和12 h循環(huán)光照）7 d后隨機分入正常對照組、MVE組（2.3 g/kg·bw）、LPS組（5 mg/kg·bw）、MVE（2.3 g/kg·bw）+LPS（5 mg/kg·bw）組，每組10只。MVE組和MVE+LPS組給予MVE連續(xù)口服灌胃30 d（1 次/天），其余組灌胃等量生理鹽水。LPS組、MVE+LPS組小鼠在30 d后末次給藥12 h后進行腹腔注射LPS（5 mg·kg-1），5 h后取小鼠肝臟組織，保存待測。

1.2.3 肝組織形態(tài)學(xué)檢查 肝組織用多聚甲醛（4%）固定，24 h后石蠟包埋，將肝組織樣本切成厚度為3 μm的截面，附著于載玻片上。用蘇木精-伊紅染色法（Hematoxylin-eosin staining，HE）染色。將染色樣本進行封片，使用光學(xué)顯微鏡觀察對比各組肝組織病理學(xué)變化。采用免疫組織化學(xué)染色法（Immunohistochemistry，IHC）染色切片觀察樣本組織中髓過氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）的表達。

1.2.4 ALT和AST檢測 將肝臟樣本與PBS緩沖液一起進行液氮研磨，4 ℃靜置20 min，4 ℃ 4500 r/min離心8 min取上清液后按試劑盒說明書測定ALT和AST活力，在510 nm處檢測分析各孔吸光度值。

1.2.5 肝組織ROS和細胞因子檢測 等質(zhì)量選取相同部位肝臟組織標本置于PBS緩沖液中，液氮研磨成勻漿，4 ℃靜置20 min，4 ℃ 4500 r/min離心8 min，使用ELISA試劑盒對各樣本上清中ROS和IL-1β、TNF-α、TGF-β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17及CXCL1、CXCL17表達水平測定并在450 nm處進行吸光值檢測。

1.2.6 Western blot檢測TLR4和p-NF-κB p65的蛋白水平 取等質(zhì)量小鼠肝臟組織加入等體積的組織細胞液裂解，液氮研磨成勻漿，4 ℃靜置20 min，離心取上清加入蛋白上樣緩沖液，在98 ℃條件下加熱5 min，隨后-80 ℃保存。取等質(zhì)量等體積樣品，將聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)分離的蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，然后用7%脫脂牛奶封閉，隨后取出，與一抗4 ℃孵育過夜，洗滌后與二抗孵育。經(jīng)過TBST緩沖液洗滌，奧德賽紅外成像系統(tǒng)避光掃描檢測蛋白表達。分析蛋白條帶灰度值，計算各目的蛋白表達量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

上述所有實驗全部重復(fù)三次，通過SPSS統(tǒng)計軟件處理，所有結(jié)果以平均值±標準差（X±SD）表示。使用GraphPad Prism 5.03制作圖表進行t值檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 MVE對老年急性炎性肝損傷小鼠肝臟組織的影響

口服灌胃復(fù)合醋提物期間，小鼠無死亡情況，MVE組小鼠表現(xiàn)出精神狀態(tài)好、被毛柔順锃亮，表明復(fù)合醋提物對小鼠無明顯毒副作用。LPS組小鼠活動明顯減少，精神萎靡伴有被毛凌亂暗淡，而MVE+LPS組小鼠這些癥狀較輕。此外，LPS組小鼠肝臟略顯蒼白，給予復(fù)合醋提物對這一現(xiàn)象具有效緩解作用。使用光學(xué)顯微鏡對各組肝組織進行形態(tài)學(xué)觀察如圖2所示，發(fā)現(xiàn)LPS組小鼠的肝索模糊、肝細胞界限不清，肝細胞嚴重腫脹伴炎性浸潤等；MVE+LPS組較LPS組這些病理改變能有效緩解；并且相較于正常對照組，MVE組小鼠的肝臟細胞的形態(tài)更好、細胞排列更為緊密，且界限更加清晰，細胞胞漿著色均勻，肝索結(jié)構(gòu)更加整齊清晰，這可能與多酚、黃酮、皂苷、多糖、木脂素和甘草酸等活性成分的抗炎和肝保護作用有關(guān)，提示MVE具有改善小鼠因衰老所致肝細胞受損的功效。

圖2 各組小鼠肝臟解剖圖及其組織病理學(xué)變化（200×）肝索為黑色箭頭標記Fig.2 Anatomical map and histopathological changes of mice liver （200×）

2.2 MVE對老年急性炎性肝損傷小鼠肝臟肝功酶和ROS的影響

研究結(jié)果如表1所示，相對于與正常對照組，LPS組小鼠肝臟樣本中ALT、AST和ROS活性都極顯著升高（P＜0.01）；MVE組小鼠肝組織樣本中ALT、AST和ROS活性均降低（P＜0.05）；MVE+LPS組小鼠可顯著對抗LPS誘導(dǎo)引起的ALT、AST和ROS活性增強（P＜0.01）。表明MVE能有效抑制肝臟ROS生成，發(fā)揮其保護肝臟的作用，這可能與保護肝細胞免受氧化應(yīng)激引起細胞死亡和減少ROS誘導(dǎo)PMN凋亡削弱炎癥反應(yīng)有關(guān)。

表1 各組小鼠肝臟組織ALT、AST、ROS的含量變化（n=10）Table 1 Changes of ALT, AST and ROS contents in liver of mice in each group (n=10)

2.3 MVE對老年急性炎性肝損傷小鼠肝臟中趨化因子表達的影響

為了探究MVE對PMN調(diào)控作用，檢測了PMN趨化因子IL-17、CXCL1和CXCL17的含量。結(jié)果如圖3所示，LPS組老年小鼠肝組織勻漿液中趨化PMN的細胞因子IL-17、CXCL1和CXCL17較正常對照組比極顯著升高（P＜0.01），伴隨MVE的攝入，MVE+LPS組老年小鼠可顯著對抗LPS誘導(dǎo)引起的PMN趨化因子表達升高（P＜0.05），表明MVE能通過減緩PMN募集，避免PMN受ROS等抗原物質(zhì)刺激引發(fā)大量凋亡加劇炎癥反應(yīng)，保護肝組織免受炎性損傷。

圖3 小鼠肝臟組織中IL-17、CXCL1和CXCL17的檢測結(jié)果Fig.3 Changes of IL-17、CXCL1 and CXCL17 contents in liver of mice in each group

2.4 MVE對老年急性炎性肝損傷小鼠肝臟MPO表達的影響

過氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）是PMN激活和功能的標志，MPO在滅活毒素的同時還參與調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)。為了探究MVE對MPO調(diào)控作用，在光學(xué)顯微鏡下觀察MPO（黃色染色）在肝臟組織的浸潤程度，結(jié)果如圖4所示，由于小鼠衰老所致的肝臟細胞組織損傷誘導(dǎo)PMN活化，因此，可見正常對照組中老年小鼠肝組織內(nèi)有MPO浸潤，伴隨MVE的攝入，MVE組老年小鼠可明顯減少MPO在肝組織的浸潤，減弱PMN活化對肝細胞的損傷，證實了MVE能有效改善小鼠因衰老所致的肝細胞受損。LPS組老年小鼠肝組織中的MPO廣泛大量浸潤，伴隨MVE的攝入，MVE+LPS組老年小鼠可明顯改善LPS誘導(dǎo)引起的MPO在肝組織的浸潤。表明MVE能通過降低MPO浸潤肝組織減弱炎癥反應(yīng)保護肝損傷。

圖4 肝臟樣本中MPO的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（200×）Fig.4 Immunohistochemical staining of MPO in liver of mice in each group (200×)

2.5 MVE對老年急性炎性肝損傷小鼠肝臟促炎和抗炎細胞因子表達的影響

為了探究MVE對細胞因子的調(diào)控作用，檢測了IL-1β等促炎細胞因子和IL-10等抗炎細胞因子的含量。如圖5所示，LPS組小鼠肝組織IL-1β、IL-6、TNF-α較正常對照組均高度顯著升高（P＜0.001），而IL-4、IL-10、TGF-β含量也會顯著升高（P＜0.01），這可能是老年小鼠自身免疫功能受抗原激活后分泌的抗炎細胞因子。伴隨MVE的攝入，MVE+LPS組小鼠可高度顯著對抗LPS誘導(dǎo)引起的促炎細胞因子含量升高（P＜0.001），同時極顯著增加LPS誘導(dǎo)引起的抗炎細胞因子分泌（P＜0.01）。提示MVE能通過調(diào)節(jié)促炎和抗炎細胞因子保護肝損傷。

圖5 各組小鼠肝臟組織中促炎和抗炎細胞因子的含量變化Fig.5 Changes of pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in liver tissue of mice in each group

2.6 MVE對老年急性炎性肝損傷小鼠肝臟TLR4/NF-κB通路蛋白表達的影響

Western blot法檢測結(jié)果如圖6所示，正常對照組相比，MVE組老年小鼠肝組織勻漿中p-NF-κB p65蛋白表達顯著降低（P＜0.05），提示與MVE對衰老小鼠肝損傷的保護作用有關(guān)。LPS組老年小鼠肝組織勻漿中TLR4和p-NF-κB p65蛋白表達較正常對照組相比高度顯著升高（P＜0.001），伴隨MVE的攝入，MVE+LPS組老年小鼠肝組織勻漿中TLR4和p-NFκB p65蛋白的表達含量較LPS組相比均被抑制（P＜0.001）。這表明機體在遭受LPS刺激時，攝入一定量的MVE能有效對抗LPS攻擊所致TLR4/NFκB炎癥信號通路的激活，減輕炎癥反應(yīng)，達到保護肝損傷的目的。

圖6 MVE對各組小鼠肝臟組織蛋白TLR4和p-NF-κB p65水平的影響Fig.6 Effects of MVE on the levels of liver tissue protein TLR4 and p-NF-κB p65 in mice of each group

3 討論與結(jié)論

革蘭氏陰性桿菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素LPS可通過誘導(dǎo)全身炎癥反應(yīng)損傷肝臟組織，隨年齡遞增，肝臟營養(yǎng)吸收速度變慢、代謝能力和清除毒素的能力逐漸減弱。本實驗通過腹腔注射LPS制備老年小鼠急性炎性肝損傷模型，觀察MVE對細胞因子、中性粒細胞、肝臟形態(tài)結(jié)構(gòu)、肝臟功能的影響，并初步探討MVE的護肝作用機制。

肝臟作為人體中具有天然免疫功能的最大代謝和清除毒素的器官，促炎細胞因子和ROS的分泌增多會致肝損傷和肝功能減退[10]。在LPS誘導(dǎo)的肝損傷模型中，LPS刺激活化KC和CD4+T細胞均會引起IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎細胞因子的分泌增多[11]。由Th1產(chǎn)生的IL-1β、TNF-α、IFN-γ等促炎細胞因子，在體內(nèi)介導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答的同時會引起組織損傷[12-14]，而由Th2細胞產(chǎn)生的IL-4、IL-10、TGFβ等抗炎細胞因子會促進體內(nèi)促進抗體的產(chǎn)生、介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答的同時，促進肝組織修復(fù)再生[12-13,15]。因此，平衡Th1/Th2細胞的比例有助于機體清除細菌、病毒等抗原物質(zhì)及其感染的細胞，從而維持機體正常的免疫功能，保護肝損傷[16-17]，其平衡失調(diào)會引起病毒性肝炎和原發(fā)性膽汁性肝硬化等肝臟疾病的發(fā)生和發(fā)展[18-20]。本實驗結(jié)果顯示，MVE能夠改善肝組織結(jié)構(gòu)紊亂等病理改變，明顯降低小鼠體內(nèi)肝功酶的活性和促炎因子水平，提高了IL-4、IL-10、TGF-β等抗炎因子水平，對LPS誘導(dǎo)肝損傷發(fā)揮保護作用。

研究發(fā)現(xiàn)Th17主要分泌的IL-17能通過上調(diào)CXCL1和CXCL17，促進PMN向炎癥部位聚集，釋放MPO滅活毒素，同時一定程度引起炎癥反應(yīng)，而當PMN受到高表達的TNF-α、細菌等抗原物質(zhì)刺激時，聚集在細胞和顆粒膜上的NADPH氧化酶會被激活產(chǎn)生ROS，誘導(dǎo)促進PMN凋亡，加劇炎癥反應(yīng)損傷肝臟組織[21-22]。本實驗結(jié)果顯示，MVE能夠明顯降低小鼠體內(nèi)ROS的活性和PMN趨化因子含量，提高抗炎因子含量，改善了肝組織內(nèi)PMN的聚集和凋亡，降低MPO在肝組織的浸潤，有效抵御劇烈炎癥反應(yīng)所致的肝損傷。

TLR4作為細胞膜上LPS的信號傳遞分子，核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB家族是TLR4的下游蛋白[23]，當細胞受到LPS等胞外信號刺激后，TLR4/NF-κB信號通路的激活會誘導(dǎo)Th1、Th2、Th17和Treg細胞產(chǎn)生多種細胞因子參與免疫炎癥反應(yīng)[24-26]。同時TLR4/NF-κB信號通路在內(nèi)毒素血癥、肝纖維化、非酒精性脂肪肝炎和乙型肝炎等肝損傷疾病中均有不同程度的激活[27-29]，有效抑制TLR4/NF-κB信號通路和調(diào)節(jié)相關(guān)免疫炎癥介質(zhì)平衡，對保護肝組織具有積極作用[30-32]。本實驗結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)的老年小鼠肝損傷模型中TLR4和p-NF-κB蛋白水平能夠被MVE顯著下調(diào)，并且MVE能夠抑制炎癥信號通路的傳導(dǎo)，削弱炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮肝損傷保護作用。

綜上所述，MVE在LPS誘導(dǎo)的急性炎性肝損傷老年小鼠模型中表現(xiàn)出良好的保護作用，并且通過調(diào)節(jié)促炎和抗炎因子平衡及下調(diào)TLR4/NF-κB信號通路來發(fā)揮肝保護作用機制。

此研究從免疫學(xué)和分子藥理學(xué)的角度，揭示了食醋炮制的人參、甘草和五味子結(jié)合食醋提取物能有效將藥引入肝臟，以此提高藥物療效，強化肝臟抵御炎癥侵襲的能力，為進一步探究天然藥物的炮制方式提供了理論依據(jù)，對強體護肝營養(yǎng)保健食品的研發(fā)提供了新思路。本文僅圍繞小鼠肝臟抗炎免疫進行研究分析討論，未進一步監(jiān)測MVE是否影響小鼠脾臟和循環(huán)免疫的平衡關(guān)系。因此，今后需進一步探討MVE對小鼠脾臟和循環(huán)免疫平衡的影響，并深入探究內(nèi)在免疫和分子機制，為臨床治療中結(jié)合免疫療法提供新途徑。