張 佳，韓 瑨，吳正鈞, ，張 娟，余 意

（1.光明乳業(yè)研究院乳業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，上海 200436；2.上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200444）

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是發(fā)酵可利用的糖類物質(zhì)后主要產(chǎn)物為乳酸、不形成芽孢的革蘭氏陽性細(xì)菌的統(tǒng)稱，它們?cè)诜诸惿暇哂卸鄻有訹1]。乳酸菌分布廣泛，除了動(dòng)物的消化道、植物的莖、葉、果實(shí)及部分天然發(fā)酵食品外，也存在于部分極端低溫的生境中[2]。同時(shí)，乳酸菌也是導(dǎo)致部分冷藏包裝食品污染的重要原因[3]。乳酸菌可用于各種發(fā)酵食品的生產(chǎn)和保存。此外，部分乳酸菌可以對(duì)宿主健康產(chǎn)生明確地促進(jìn)作用，如調(diào)節(jié)腸道菌群的組成[4]、緩解腹瀉、乳糖不耐癥、糖尿病等[5]，對(duì)于癌癥也有一定預(yù)防作用[6]。因此，這些乳酸菌被作為益生菌在醫(yī)藥、食品和養(yǎng)殖業(yè)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[7]。

大多數(shù)乳酸菌適合在20～45 ℃生長，當(dāng)環(huán)境溫度急劇下降并明顯低于其正常的生長溫度范圍時(shí)，乳酸菌細(xì)胞的代謝甚至形狀會(huì)出現(xiàn)異常，這會(huì)影響細(xì)胞的存活性。例如，在制備直投式酸奶發(fā)酵劑時(shí)需經(jīng)過深度冷凍或真空冷凍干燥過程，而低溫會(huì)對(duì)組成酸奶發(fā)酵劑的乳酸菌細(xì)胞內(nèi)的酶活[8]、細(xì)胞質(zhì)的流動(dòng)性等造成嚴(yán)重?fù)p傷，使其死亡率明顯升高，從而降低發(fā)酵劑的生產(chǎn)性能[9]。同時(shí)，發(fā)酵乳作為乳酸菌的優(yōu)良載體，在運(yùn)輸和保存過程中，通常需要采用冷藏措施，低溫也會(huì)導(dǎo)致部分乳酸菌的活菌數(shù)或活力降低，從而影響其在體內(nèi)功能的發(fā)揮。此外，為了達(dá)到長期保存的目的，通常需要將乳酸菌存放在低于零度甚至-80 ℃的環(huán)境中，在此過程中，極端低溫會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞滲透壓升高、形成冰晶，導(dǎo)致細(xì)胞完整性受損等，從而導(dǎo)致部分細(xì)胞死亡。

當(dāng)周圍環(huán)境溫度急劇下降時(shí)，細(xì)菌細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生一系列的生理變化，如膜的流動(dòng)性下降、部分蛋白質(zhì)折疊效率降低及核糖體的功能發(fā)揮受到限制等[10]。前期已有研究者對(duì)古細(xì)菌、嗜中溫細(xì)菌等對(duì)冷脅迫的應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)行了綜述，包括降低組成細(xì)胞膜脂肪酸的不飽和度、合成冷休克蛋白等[11-12]。研究者很早就注意到環(huán)境脅迫對(duì)乳酸菌細(xì)胞完整性及生理代謝的影響，但受限于缺乏合適的遺傳操作工具等原因，對(duì)乳酸菌受到冷脅迫時(shí)冷休克蛋白的表達(dá)及其生理功能缺乏系統(tǒng)的研究。隨著組學(xué)（Omics）技術(shù)出現(xiàn)及質(zhì)譜分析技術(shù)的發(fā)展，研究者對(duì)乳酸菌的抗冷脅迫作用獲得了更全面和深入的了解。因此，本文總結(jié)了過去二十年內(nèi)研究乳酸菌抗冷脅迫的主要進(jìn)展及方法，以期為后續(xù)的研究提供一定的借鑒。

1 冷脅迫對(duì)乳酸菌的影響

1.1 對(duì)細(xì)胞膜流動(dòng)性和完整性的影響

在冷凍過程中細(xì)胞膜發(fā)生膜脂質(zhì)相變，磷脂雙層從液態(tài)無序液晶相變?yōu)閯傂杂行蚰z相，并伴隨細(xì)胞周圍及胞內(nèi)基質(zhì)由外至內(nèi)的冰晶形成[13]。針對(duì)冷凍造成細(xì)胞損傷的機(jī)制，Mazur等[14]提出了雙因素假說。該假設(shè)認(rèn)為，在低冷卻速率下，細(xì)胞損傷主要來自滲透壓的改變（溶液效應(yīng)），低溫引起的冰晶形成會(huì)導(dǎo)致胞外溶質(zhì)濃縮，使細(xì)胞長時(shí)間暴露于離子強(qiáng)度增加、pH改變的環(huán)境中；在高冷卻速率下，胞內(nèi)冰晶的形成被認(rèn)為是導(dǎo)致細(xì)胞死亡的主要原因。然而，當(dāng)冷凍保護(hù)劑存在時(shí)，并未觀察到細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成[15]。因此，也有研究者認(rèn)為LAB細(xì)胞在快速冷凍時(shí)的損傷不是來自于胞內(nèi)的冰晶，而是由解凍過程中發(fā)生的細(xì)胞內(nèi)外滲透壓不平衡所引起[16]。Meneghel等[13]認(rèn)為冷凍會(huì)產(chǎn)生結(jié)冰和高滲透壓雙重效應(yīng)，對(duì)保加利亞乳桿菌分別進(jìn)行凍融處理和高滲透壓脅迫處理，觀察到了相似的生物活性損失。因此，他們強(qiáng)調(diào)高滲透壓的形成是冷凍損傷的主要來源。

細(xì)胞包被（Cell envelope）的組成在很大程度上取決于微生物生活的環(huán)境，其中溫度是最重要的因素之一[17]。細(xì)胞膜的組成和結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)菌的冷適應(yīng)很重要，因?yàn)樗鼈儤?gòu)成了細(xì)胞和環(huán)境之間的動(dòng)態(tài)界面，使細(xì)菌能夠應(yīng)對(duì)環(huán)境挑戰(zhàn)[18]。此外，細(xì)胞膜還可作為分子傳感器，在分子運(yùn)輸和相關(guān)應(yīng)激反應(yīng)的激活中發(fā)揮重要作用[19]。當(dāng)受到冷脅迫時(shí)，微生物細(xì)胞膜的流動(dòng)性和完整性會(huì)受到影響。Wang等[20]將3株植物乳桿菌分別在-20和-196 ℃預(yù)凍3 h后再進(jìn)行冷凍干燥，然后采用熒光雙染色法測(cè)定了細(xì)胞膜完整性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在不同預(yù)凍溫度下，3株植物乳桿菌的膜完整性受到不同程度的破壞。與-20 ℃相比，在-196 ℃預(yù)凍會(huì)導(dǎo)致3株被測(cè)試植物乳桿菌的細(xì)胞膜損傷密度顯著增加，這表明適當(dāng)?shù)念A(yù)凍溫度能夠使細(xì)胞內(nèi)形成更均勻的冰晶，從而減少對(duì)細(xì)胞膜的損傷[20]。

1.2 對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的影響

低溫會(huì)降低細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)尤其是酶的活性，甚至影響蛋白質(zhì)的正常折疊，主要表現(xiàn)如下：影響某些蛋白質(zhì)的分泌[10]；導(dǎo)致部分蛋白質(zhì)折疊緩慢或效率低下；降低酶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄或翻譯的活性。細(xì)胞要維持生命活動(dòng)，需要保持酶的一定活性。隨著溫度的降低，酶反應(yīng)速率也降低，而蛋白質(zhì)的剛性增加。為了應(yīng)對(duì)這些影響，生活在低溫環(huán)境中的嗜冷菌（psychrophile）通過下調(diào)初級(jí)代謝或改變蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)、減少穩(wěn)定相互作用增加分子的無序度，從而維持酶的功能[21]。

冷脅迫會(huì)導(dǎo)致乳酸菌細(xì)胞產(chǎn)生何種應(yīng)激反應(yīng)，取決于實(shí)際面臨的溫度是否高于0 ℃。當(dāng)溫度低于0 ℃時(shí)，大多數(shù)原核細(xì)胞出現(xiàn)被動(dòng)反應(yīng)，胞內(nèi)水結(jié)冰，引發(fā)細(xì)胞膜和DNA損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞緩慢死亡[22]。高于冰點(diǎn)的低溫可能導(dǎo)致乳酸菌生長停滯，但這種情況不會(huì)突然引發(fā)細(xì)胞死亡。然而對(duì)于嗜冷菌，即使在低于冰點(diǎn)的溫度下也能維持其代謝和生長[23]，原因在于嗜冷菌中含有獨(dú)特的冷適應(yīng)蛋白，例如伴侶蛋白。伴侶蛋白是幫助蛋白質(zhì)折疊的重要蛋白質(zhì)。當(dāng)GroEL和DnaK的伴侶蛋白CspB在嗜溫大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，可提高其抗冷性[24]。Mbye等[25]述了乳酸菌在冷脅迫時(shí)，細(xì)胞適應(yīng)低溫環(huán)境蛋白表達(dá)的變化（表1）。通過產(chǎn)生冷適應(yīng)蛋白，乳酸菌在低溫下能保持一定的活性。

表1 冷脅迫時(shí)部分乳酸菌蛋白表達(dá)的變化Table 1 Effects of cold stress on total protein profiles in selected lactic acid bacteria

1.3 對(duì)核酸結(jié)構(gòu)和功能的影響

冷脅迫會(huì)給細(xì)胞帶來諸多挑戰(zhàn)，例如酶反應(yīng)速率降低、對(duì)底物的親和力降低，細(xì)胞膜流動(dòng)性降低和RNA聚合酶活性受損等。除此之外，冷脅迫還可影響核酸的結(jié)構(gòu)和功能。研究表明，凍融過程中細(xì)菌的死亡主要?dú)w結(jié)于膜損傷和DNA變性[28]。冷脅迫還會(huì)造成核糖核酸和脫氧核糖核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，導(dǎo)致核糖核酸翻譯和轉(zhuǎn)錄效率的降低[24]。DNA通常為負(fù)超螺旋，受溫度影響后易產(chǎn)生錯(cuò)誤折疊[29]。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)枯草芽孢桿菌施加冷刺激后，負(fù)超螺旋迅速增加[30]。DNA超螺旋的調(diào)節(jié)在DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄中可起到重要作用[31]。Mizushima等[32]為了檢測(cè)冷休克對(duì)DNA超螺旋的影響，通過含有氯喹的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行冷休克處理時(shí)，細(xì)胞中質(zhì)粒DNA的負(fù)超螺旋增加。

2 乳酸菌抗冷脅迫所采用的策略

據(jù)報(bào)道，冷適應(yīng)細(xì)菌在應(yīng)對(duì)低溫條件時(shí)有一系列的適應(yīng)策略[33]，如表2所示。其中，胞外聚合物和相容性溶質(zhì)的產(chǎn)生可為細(xì)菌提供滲透保護(hù)，膜脂肪酸中不飽和脂肪酸含量的增加有助于維持細(xì)菌細(xì)胞膜的流動(dòng)性，分子伴侶的產(chǎn)生可穩(wěn)定蛋白質(zhì)，而冷適應(yīng)蛋白的表達(dá)可使細(xì)菌更好地適應(yīng)溫度下降。在乳酸菌中，主要通過細(xì)胞包被的變化、膜性能的變化、冷休克蛋白的表達(dá)和相容性溶質(zhì)的產(chǎn)生來應(yīng)對(duì)冷脅迫。

表2 微生物適應(yīng)低溫的細(xì)胞及分子機(jī)制Table 2 Cellular and molecular mechanism of microbial adaptation to low temperature

2.1 細(xì)胞包被的變化

胞外聚合物是多種生物分泌到其局部環(huán)境中的多功能、高分子量生物聚合物復(fù)合物，它們被認(rèn)為具有多種功能[33]。其中胞外多糖具有促進(jìn)細(xì)胞粘附和吸附環(huán)境中低濃度營養(yǎng)物質(zhì)的作用，同時(shí)可為細(xì)胞提供多種保護(hù)功能如滲透保護(hù)、冷凍保護(hù)等。研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生胞外多糖是細(xì)菌適應(yīng)低溫環(huán)境的共有特征[18]。乳酸菌菌株也可產(chǎn)生胞外多糖[36]。胞外多糖可以作為莢膜多糖附著在細(xì)菌表面，也可以作為粘液多糖分泌到周圍介質(zhì)中。在低溫條件下，一些冷適應(yīng)細(xì)菌還具有肽聚糖層增厚和與肽聚糖生物合成有關(guān)基因上調(diào)的特征[33]。Polo等[27]研究發(fā)現(xiàn)，肽聚糖組成的差異可能是造成不同乳桿菌在不同預(yù)凍溫度下冷凍干燥后存活率產(chǎn)生差異的原因。

2.2 膜性能的變化

已有研究證明，冷凍可改變脂質(zhì)的物理狀態(tài)，從而改變脂質(zhì)組織和膜流動(dòng)性[37]。冷應(yīng)激（cold shock）處理會(huì)改變?nèi)樗峋哪ぶ舅峤M成，使菌株的抗凍性增加。Beal等[38]研究發(fā)現(xiàn)，嗜熱鏈球菌CFS2的脂肪酸組成與細(xì)胞抗凍性密切相關(guān)，且不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的之比（UFA/SFA）越高，對(duì)冷凍的抵抗力越好。冷凍干燥后的保加利亞乳桿菌的存活率也與UFA/SFA有關(guān)[39]。由此可知，受冷脅迫后膜脂組成的差異會(huì)造成菌株抗凍性的不同。此外，菌株自身膜脂組成的差異也會(huì)造成抗凍性不同。Meneghel等[13]對(duì)兩株抗凍性不同的菌株，保加利亞乳桿菌ATCC 11842和CFL1的膜脂肪酸進(jìn)行分析。結(jié)果表明，抗凍菌株ATCC 11842的細(xì)胞膜中顯示出更高的不飽和脂肪酸含量。除了不飽和脂肪酸含量外，UFA/SFA和cycC19:0含量也會(huì)對(duì)膜流動(dòng)性造成影響。Fonseca等[40]對(duì)影響膜流動(dòng)性的因素進(jìn)行了總結(jié)（表3），不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸之比增加會(huì)導(dǎo)致膜流動(dòng)性的增加，而長鏈脂肪酸長度的增加則會(huì)降低細(xì)胞膜的流動(dòng)性。此外，Velly等[41]還發(fā)現(xiàn)環(huán)狀脂肪酸與不飽和脂肪酸的比率似乎與乳酸乳球菌TOMSC161的冷凍干燥耐受性相關(guān)，cycC19:0含量越高，細(xì)胞對(duì)冷凍干燥的耐受性越好。然而，當(dāng)前的研究中大部分只是討論冷脅迫后乳酸菌膜脂肪酸成分的變化，關(guān)于乳酸菌調(diào)控脂肪酸變化的具體機(jī)制仍不清楚，因此，在未來的研究中可從脂肪酸合成相關(guān)基因著手，從基因組學(xué)的角度對(duì)脂肪酸調(diào)節(jié)機(jī)制作進(jìn)一步探索。

表3 影響LAB膜流動(dòng)性的主要因素Table 3 Main factors affecting fluidity of LAB membrane

當(dāng)環(huán)境溫度降低時(shí)，為了在低溫條件下的生存，大多數(shù)微生物通常會(huì)改變膜脂組成，使細(xì)胞膜保持一定的流動(dòng)性。例如，增強(qiáng)脂肪酸脫氫酶對(duì)膜脂中脂肪酸底物的催化作用，使脂肪酸鏈中的雙鍵數(shù)量增加，導(dǎo)致UFA/SFA提高，膜脂凝固點(diǎn)降低，從而增加膜流動(dòng)性[42]。Suzuki等[43]對(duì)藍(lán)細(xì)菌在低溫中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)藍(lán)細(xì)菌中存在一個(gè)雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，可調(diào)節(jié)Δ15-脂肪酸脫氫酶（desB）基因的表達(dá)。該基因的表達(dá)可提高膜脂中α-亞麻酸含量，增強(qiáng)菌株的低溫耐受能力。

由于菌株的膜脂肪酸組成與其抗凍性之間存在一定聯(lián)系，因此，可通過改變微生物細(xì)胞膜的脂肪酸組成來改善其低溫適應(yīng)性，從而使微生物適應(yīng)冷凍環(huán)境，加入油酸可改變細(xì)胞膜的脂肪酸組成。對(duì)于乳酸菌而言，培養(yǎng)基中加入油酸可提高二氫甾酸的濃度和UFA/SFA。UFA/SFA的提高會(huì)增加細(xì)胞膜的流動(dòng)性，從而提高乳酸菌的抗凍性。

李占雷(2014)認(rèn)為供應(yīng)鏈?zhǔn)菫榱藢?shí)現(xiàn)全鏈價(jià)值的提升。整合全鏈資源，幫助節(jié)點(diǎn)上的企業(yè)融資。表現(xiàn)出是一種金融產(chǎn)品、市場(chǎng)等的特點(diǎn)。

2.3 冷休克蛋白的表達(dá)

在環(huán)境脅迫下，為了促進(jìn)自身的生存，細(xì)菌必須通過誘導(dǎo)特定的應(yīng)激反應(yīng)來快速適應(yīng)外部干擾[19]。許多微生物在低溫下會(huì)表達(dá)冷休克蛋白，以適應(yīng)溫度的快速下降。當(dāng)溫度高于0 ℃時(shí)，細(xì)胞出現(xiàn)主動(dòng)應(yīng)激，合成一類特定蛋白，即冷休克蛋白[10]。冷休克蛋白是一類核酸伴侶，其主要功能是防止RNA在低溫下形成次級(jí)結(jié)構(gòu)或促進(jìn)形成次級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA的降解。例如冷休克蛋白中的RNA解旋酶DeaD可以阻斷二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，進(jìn)一步在冷休克反應(yīng)產(chǎn)生的核糖核酸外切酶PNPase和RNase R的作用下對(duì)它們進(jìn)行降解[44]。

生產(chǎn)乳酸發(fā)酵產(chǎn)品的過程中，乳酸菌細(xì)胞會(huì)暴露在各種環(huán)境脅迫下，例如低溫、pH、滲透壓和高壓，這可能會(huì)影響細(xì)胞的生理活性[45]。然而，細(xì)菌細(xì)胞自身具備許多防御機(jī)制來提高在壓力環(huán)境中的生存能力，如伴侶蛋白（GroES/GroEL和DnaK/DnaJ/Grp E）、蛋白酶、運(yùn)輸系統(tǒng)和質(zhì)子泵[34]。研究人員首次在乳酸乳球菌MG1363中發(fā)現(xiàn)了以串聯(lián)重復(fù)方式排列的編碼冷休克蛋白基因（csp）的基因家族cspA、cspB、cspC、cspD和cspE[35]，與30 ℃培養(yǎng)的細(xì)胞相比，經(jīng)過10 ℃冷休克處理后，cspA、cspB、cspC、cspD的轉(zhuǎn)錄水平提高了10～40倍，但cspE的轉(zhuǎn)錄水平保持不變。在植物乳桿菌中，也鑒定到多種冷休克基因，如cspC、cspL和cspP。Song等[26]對(duì)植物乳桿菌L67進(jìn)行1、4、6 h的冷脅迫處理后，發(fā)現(xiàn)cspL和cspP的表達(dá)顯著增加。在低溫環(huán)境中細(xì)胞內(nèi)RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性增加，從而干擾轉(zhuǎn)錄和翻譯過程的進(jìn)行，CSPs可以作為RNA伴侶，以不依賴于能量的方式發(fā)揮解鏈和或RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)去穩(wěn)定化的功能，起到抗轉(zhuǎn)錄終止子的作用，從而提高E.coli對(duì)低溫環(huán)境的適應(yīng)能力[46]。此外，CSP還可在多種細(xì)胞代謝過程中發(fā)揮作用，例如脂肪酸代謝、染色體構(gòu)建、轉(zhuǎn)錄、翻譯、一般代謝、能量代謝和應(yīng)激反應(yīng)[35]。

Broadbent等[47]對(duì)乳酸乳球菌MM160進(jìn)行冷脅迫處理，然后通過2D-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析35S標(biāo)記蛋白來表征乳酸乳球菌的冷脅迫反應(yīng)。放射自顯影結(jié)果顯示，在L.lactisMM160中，在10 ℃下的最初30 min內(nèi)，至少誘導(dǎo)了8種蛋白質(zhì)。用L.lactisMM210進(jìn)行的類似實(shí)驗(yàn)表明，冷脅迫誘導(dǎo)了大約15個(gè)Csps。L.lactisMM160和MM210的時(shí)間進(jìn)程標(biāo)記實(shí)驗(yàn)顯示，溫度降低后，其他蛋白質(zhì)的表達(dá)緩慢恢復(fù)，但即使在10 ℃下4 h后，在兩株乳球菌中，合成的蛋白質(zhì)主要是Csp。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，冷脅迫后的乳酸乳球菌細(xì)胞中含有更低的飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的比率。

Kim等[48]研究了冷脅迫對(duì)瑞士乳桿菌（L.helveticus）LB1、戊糖片球菌（P.pentosaceus）PO2、嗜熱鏈球菌（S.thermophilus）TS2以及乳酸乳球菌乳酸亞種（L.lactissubsp.lactis）M392、M474、M712和乳酸乳球菌乳脂亞種（L. lactissubsp.cremoris）M126、M149、M179的冷凍耐受性的誘導(dǎo)作用。結(jié)果表明，當(dāng)乳酸菌培養(yǎng)物在-20 ℃冷凍24 h后，除L.lactisM712（存活率50%）外，其它菌株的存活率都非常低。其中L.cremorisM179，只有1%的細(xì)胞存活。然而，當(dāng)培養(yǎng)物在冷凍前經(jīng)過10 ℃冷應(yīng)激2 h后，在測(cè)試的菌株中，來自乳酸乳球菌乳酸亞種的菌株和戊糖片球菌PO2的存活率都顯著提高，其中L.lactisM474的增幅最大，存活率由30%增加至67%。而這種效應(yīng)在被測(cè)試的乳酸乳球菌乳脂亞種、L.helveticusLB1及S.thermophilusTS2中未出現(xiàn)。采用針對(duì)Escherichia coli及Bacillus subtilis中編碼主要休克蛋白的基因的簡并引物進(jìn)行PCR，在所有被測(cè)試的菌株中都檢測(cè)到擴(kuò)增產(chǎn)物。對(duì)L.lactisM474的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測(cè)序后所推導(dǎo)出的蛋白質(zhì)的氨基酸序列與其它已知的冷休克蛋白具有高度的相似性。利用針對(duì)L.lactisM474冷休克蛋白編碼基因的引物對(duì)其它被測(cè)試的菌株進(jìn)行擴(kuò)增，僅在乳球菌中發(fā)現(xiàn)了PCR產(chǎn)物，而L.helveticus，S.thermophilus或P.pentosaceus中未觀察到擴(kuò)增產(chǎn)物。因此，不同乳酸菌冷休克蛋白的基因在序列上存在一定的差異，這種差異導(dǎo)致其宿主對(duì)冷脅迫出現(xiàn)不同的表現(xiàn)。還需要進(jìn)一步對(duì)冷休克蛋白結(jié)構(gòu)與抗冷凍作用之間的關(guān)聯(lián)性予以更深入的研究。

2.4 相容性溶質(zhì)

Tribelli等[18]報(bào)道了細(xì)菌與冷適應(yīng)有關(guān)的典型特征，包括酶結(jié)構(gòu)的調(diào)整、相容性溶質(zhì)（compatible solutes）的合成等。在低溫環(huán)境下，乳酸菌也會(huì)合成相容性溶質(zhì)，例如海藻糖和甘氨酸。相容性溶質(zhì)不僅能在低溫環(huán)境下為微生物細(xì)胞提供滲透保護(hù)和冷凍保護(hù)，還可作為碳源、氮源和能源。研究較多的相容性溶質(zhì)有甘氨酸、甜菜堿、甘油、海藻糖、蔗糖、甘露醇和山梨醇，它們能降低細(xì)胞質(zhì)的冰點(diǎn)，防止大分子聚集、清除自由基和穩(wěn)定細(xì)胞膜，從而使微生物適應(yīng)低溫環(huán)境。更重要的是，相容性溶質(zhì)還能降低細(xì)胞內(nèi)膠體的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度[49]。最近的一項(xiàng)研究顯示，添加甘油后，細(xì)菌細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度降低了30 ℃，解凍后的存活率也有所提高[49]。Li等[50]發(fā)現(xiàn)，與其它冷凍保護(hù)劑相比，在冷凍干燥過程中添加10%的海藻糖能更好地保持羅伊氏乳桿菌CICC6226細(xì)胞膜的完整性和流動(dòng)性。由此可知，除了自身合成外，乳酸菌還可從外部環(huán)境中吸收以積累相容性溶質(zhì)。由于不同乳酸菌轉(zhuǎn)運(yùn)相容性溶質(zhì)的能力可能存在差異，因此對(duì)不同種類乳酸菌轉(zhuǎn)運(yùn)相容性溶質(zhì)的機(jī)制進(jìn)行研究，也可為判斷乳酸菌的抗冷脅迫能力提供新的思路。

3 乳酸菌抗冷脅迫作用的表征

3.1 氣相色譜-質(zhì)譜法

3.2 液質(zhì)聯(lián)用

首先將乳酸菌接種于合適的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，然后進(jìn)行冷休克處理，按Lindae等[51]的方法提取菌體蛋白質(zhì)。先通過雙向電泳找出差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，將差異蛋白點(diǎn)用胰蛋白酶消化，再通過LC-MS對(duì)差異蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，以確定冷休克蛋白的表達(dá)。Chen等[52]對(duì)Lactobacillus kefiranofaciensM1進(jìn)行冷休克處理，然后分析冷休克前后菌株的蛋白表達(dá)差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)冷休克后的Lactobacillus kefiranofaciensM1有21個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)水平發(fā)生變化。采用LC-MS對(duì)這些差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行鑒定，鑒定出了伴侶蛋白DnaK、GroEL等。

3.3 基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜

冷休克蛋白的測(cè)定還可采用Maldi-TOF MS方法進(jìn)行。提取乳酸菌的菌體蛋白質(zhì)先進(jìn)行雙向電泳（2-DE），從2-DE凝膠中將差異表達(dá)的蛋白斑點(diǎn)片段手動(dòng)切除，然后通過Maldi-TOF MS進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。Song等[26]通過Maldi-TOF MS對(duì)一株植物乳桿菌L67在冷脅迫下的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行鑒定，有24種蛋白質(zhì)表達(dá)增強(qiáng)，13種蛋白質(zhì)被鑒定，其中2種蛋白質(zhì)與泛酸激酶和合成酶有關(guān)。13種被鑒定的蛋白質(zhì)分為六類：能量代謝、細(xì)胞生長、未知功能、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、應(yīng)激反應(yīng)和轉(zhuǎn)錄。

3.4 細(xì)胞活性分析

細(xì)胞活性分析包括活菌計(jì)數(shù)、酸化能力測(cè)定和乳酸脫氫酶活性測(cè)定。通常采用選擇性平板計(jì)數(shù)法測(cè)定經(jīng)過冷凍處理后乳酸菌培養(yǎng)物中的活菌數(shù)。將樣品進(jìn)行稀釋，取合適稀釋倍數(shù)的稀釋液接種在MRS固體培養(yǎng)基中，48 h進(jìn)行計(jì)數(shù)[13]。乳酸菌培養(yǎng)物在冷凍前后和儲(chǔ)存期間酸化能力的變化也是衡量其抗冷凍協(xié)作用的重要表征，F(xiàn)onseca等[53]采用Cinac系統(tǒng)測(cè)定了經(jīng)過不同處理的乳酸菌的酸化能力，將細(xì)菌懸浮液接種于脫脂乳中，連續(xù)測(cè)定脫脂乳的pH直到酸化結(jié)束，以pH變化對(duì)時(shí)間的導(dǎo)數(shù)代表酸化速率。對(duì)于不同的乳酸菌樣品，達(dá)到在脫脂乳中最大酸化速率所需的時(shí)間tm（以min為單位）能夠表征細(xì)胞經(jīng)過冷脅迫后的活力。tm越高，潛伏期越長，酸化活性越低[38]。乳酸脫氫酶（LDH）可催化乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸，這是乳酸菌細(xì)胞產(chǎn)生能量的重要一步[20]。細(xì)胞中LDH的活性在冷凍或冷凍干燥后會(huì)降低，因此可以通過該酶活性判斷細(xì)胞受損情況。其活性測(cè)定通常采用比色法，通過NADH在340 nm處的吸收減少來確定[20]。

4 總結(jié)與展望

在低溫下，乳酸菌會(huì)通過改變細(xì)胞膜脂肪酸組成、產(chǎn)生冷休克蛋白及產(chǎn)生相容性溶質(zhì)等來適應(yīng)環(huán)境，以保持良好的活性。關(guān)于乳酸菌抗冷脅迫的研究仍存在不足之處，包括：a.冷休克蛋白與低溫耐受性的確切構(gòu)效關(guān)系；b.同種內(nèi)不同菌株之間由遺傳導(dǎo)致的細(xì)胞膜差異與冷脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的膜脂組成差異對(duì)細(xì)胞抗冷凍性能影響的程度；c.冷休克蛋白對(duì)膜脂合成的調(diào)節(jié)作用。這些問題需要通過對(duì)與不飽和脂肪酸、冷休克蛋白等合成相關(guān)基因的編輯（敲除、沉默和定向突變）予以進(jìn)一步的闡明。此外，冷休克蛋白自身結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)如何保證其在低溫下發(fā)揮活性也值得關(guān)注。因此，未來可以開展以下幾方面的工作：a.從基因組學(xué)的角度出發(fā)，對(duì)脂肪酸合成的相關(guān)基因進(jìn)行敲除，深入探究不同菌株抗凍性強(qiáng)弱與遺傳基因之間的關(guān)系；b.結(jié)合蛋白組學(xué)和基因組學(xué)，探究冷休克蛋白對(duì)膜脂組成的調(diào)節(jié)作用，即對(duì)冷休克蛋白的代謝通路進(jìn)行分析，通過相關(guān)基因的編輯來研究冷休克蛋白與膜脂組成之間的關(guān)聯(lián)；c.由于乳酸菌轉(zhuǎn)運(yùn)相容性溶質(zhì)的能力可能存在差異，因此后續(xù)的研究中還可對(duì)不同乳酸菌轉(zhuǎn)運(yùn)相容性溶質(zhì)的機(jī)制進(jìn)行研究，這可為研究乳酸菌的抗冷脅迫作用提供新的借鑒。