王曉潔，孟凡強，周立邦，陸兆新

（南京農業(yè)大學食品科技學院，江蘇南京 210095）

短桿菌素（Brevibacillin）是由側孢短芽孢桿菌（Brevibacillus laterosporus）產生的一種線性抗菌脂肽，良好的抑菌活性使其可與一些抗生素相媲美[1-2]，同時具有良好的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性[3]，是潛在的新型生物防腐劑。目前對于其菌體及代謝產物的應用主要集中在農業(yè)[4]及環(huán)境[5]等行業(yè)，寧亞維等[6]將側孢短芽孢桿菌的抗菌肽brevilaterin與各種食品添加劑協(xié)同使用，結果表明協(xié)同使用可增加對食源性致病菌的廣譜抑菌。本實驗室前期從南京土壤中篩選出一株側孢短芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液中低劑量的短桿菌素即可有效殺死脫脂牛奶中的金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌，具有替代食品防腐劑保鮮劑的潛力[7-8]。并且在生姜的生防試驗中側孢短芽孢桿菌可顯著抑制群結腐霉對生姜的侵染[9]。然而其較低的發(fā)酵產量卻無法應用于大規(guī)模的工業(yè)化生產，目前沒有對于合成短桿菌素完整的特異性調控路徑的報道，因此采用優(yōu)化培養(yǎng)基提高菌體密度的方法來提高短桿菌素的含量是行之有效的手段。但是對于優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基提高側孢短芽孢桿菌產短桿菌素含量的研究參考文獻較少。

微生物生長繁殖過程中產生的次級代謝產物的含量不僅與微生物自身的代謝過程及遺傳信息有關，培養(yǎng)基的主要組成成分[10-11]及發(fā)酵條件[12-13]也會影響次級代謝產物的生物合成。前期通過基因組改組篩選出一株高產短桿菌素的融合菌株命名為fmb70-24，并在此基礎上，擬通過響應面試驗優(yōu)化融合菌株的發(fā)酵條件進一步提高短桿菌素的含量，為短桿菌素應用于工業(yè)化生產提供理論基礎和方法。

基于Plackett-Burman試驗篩選出的顯著因子考察不同因子之間的交互影響作用[14-15]，解決多變量的問題，合理使用響應面優(yōu)化發(fā)酵工藝可以有效提高生產效益[16-17]，成為生產過程中解決問題的有效方式，因此廣泛運用于化學[18]、生物[19]、食品[20-21]等各個領域。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

側孢短芽孢桿菌fmb70-24（B. laterosporusfmb 70-24） 南京農業(yè)大學酶工程實驗室；胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、牛肉浸膏、硫酸銨、酵母膏、玉米漿、氯化鈣、氯化鉀、氯化鎂 分析純，國藥集團化學試劑。

SX-700高壓蒸汽滅菌鍋 日本TOMY公司；SWCJ-IBU超凈工作臺 蘇凈集團安泰公司；DIONEX 3000高效液相色譜儀 美國DIONEX公司；Centrifuge 5804R冷凍離心機 德國Eppendorf公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 初始發(fā)酵/種子培養(yǎng)基[7]：胰蛋白胨10.0 g/L、酵母提取物5.0 g/L、氯化鈉10.0 g/L，蒸餾水1000 mL，pH7.0，121 ℃滅菌20 min。

1.2.2 菌種的培養(yǎng)及發(fā)酵

1.2.2.1 菌種的培養(yǎng) 將甘油管中的菌種按2%的接種量接種至50 mL/250 mL液體培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min搖床培養(yǎng)24 h后，然后按照相同的接種量轉接至50 mL/250 mL培養(yǎng)基中相同條件下培養(yǎng)24 h至對數(shù)后期。

1.2.2.2 菌種的發(fā)酵 將活化后的種子培養(yǎng)液按2%的接種量接種至50 mL/250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃下180 r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)24 h。

1.2.3 培養(yǎng)基成分考察的單因素實驗 試驗前期已優(yōu)化Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基中胰蛋白胨最佳添加量為15 g/L，酵母提取物的最佳添加量為5 g/L，氯化鈉的最佳添加量為10 g/L。在此基礎上以側孢短芽孢桿菌fmb70-24為試驗菌株，初始發(fā)酵培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）作為對照，優(yōu)化培養(yǎng)基的碳源、氮源和無機鹽離子，并使用HPLC檢測發(fā)酵液中短桿菌素的含量。

碳源：在初始發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加10 g/L的葡萄糖、蔗糖、果糖或麥芽糖。比較短桿菌素的含量，以含量最高的碳源為最佳碳源，對其添加量進行優(yōu)化，添加量分別設為10.0、20.0、30.0、40.0和50.0 g/L。

氮源：在初始發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加10 g/L的硫酸銨、牛肉膏、酵母膏或玉米漿。比較短桿菌素的含量，以含量最高的氮源為最佳氮源，對其添加量進行優(yōu)化，添加量分別設為10.0、20.0、30.0、40.0和50.0 g/L。

無機鹽離子：在初始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎上分別添加10 g/L的氯化鈣、氯化鎂或氯化鉀。比較短桿菌素的含量，以含量最高的無機鹽離子為最佳離子，對其添加量進行優(yōu)化，添加量分別設為5.0、10.0、20.0、30.0和40.0 g/L。

1.2.4 響應面優(yōu)化試驗設計

1.2.4.1 Plackett-Burman（PB）試驗 選取影響短桿菌素含量的6個主要培養(yǎng)基組分為自變量，發(fā)酵液中短桿菌素含量為響應值，選用N=11的Plackett-Burman設計，并設計5個空白作為誤差分析項。每個因素選取高（+1）低（-1）2個水平，篩選影響顯著的因子[22-23]。PB試驗設計見表1。

表1 PB設計因子、水平及編碼Table 1 Factors, levels and codes of PB design

1.2.4.2 最陡爬坡試驗確定響應面中心點 通過最陡爬坡試驗盡可能逼近短桿菌素含量的最大區(qū)域，確定此時培養(yǎng)基主要組分的濃度，建立響應面擬合方程的最優(yōu)模型。最陡爬坡試驗的爬坡方向及步長主要通過PB試驗得到的3個顯著影響因子的系數(shù)值確定，因素系數(shù)值為正值選取高水平，負值選取低水平，設計試驗找出短桿菌素含量的最大值時顯著因子的濃度，作為Box-Behnken試驗的起始中心點。

1.2.4.3 Box-Behnken（BB）設計 利用響應面試驗可評價顯著因子之間的交互作用[13]，以PB試驗篩選出的三個顯著因子作為自變量，發(fā)酵液中短桿菌素的含量為響應值，設計三因素三水平的響應面試驗，建立多元二次回歸數(shù)學方程來擬合自變量與響應值之間的函數(shù)關系，獲得短桿菌素含量的最佳培養(yǎng)基配方。BBD試驗設計見表2。

表2 Box-Behnken因素編碼及水平設計Table 2 Factors, levels and codes of Box-Behnken design

1.2.4.4 驗證試驗 通過響應面試驗獲得的理論最佳培養(yǎng)條件進行發(fā)酵24 h驗證，得到的短桿菌素含量平均值與理論最大值進行比較，驗證實驗模型的可靠性。

1.2.4.5 發(fā)酵液中短桿菌素的測定 取發(fā)酵液1 mL在離心機中12000×g離心2 min，上清液即為發(fā)酵液，HPLC測定發(fā)酵液中短桿菌素的含量。

HPLC檢測短桿菌素含量方法[7]：Biobasic C18（250 mm×4.6 mm） 柱；進樣量：20 μL；柱溫：25 ℃；檢測波長：210 nm；流速：0.6 mL/min；溶劑A：乙腈（ACN，含0.1%三氟乙酸，TFA）；溶劑B：水（含0.1%TFA）；洗脫條件如表3所示。

表3 分析型HPLC洗脫條件Table 3 Elution condition of HPLC

對側孢短芽孢桿菌次級代謝產物短桿菌素的不同同系物進行積分，從而得到不同濃度樣品的峰面積，做出峰面積-短桿菌素濃度標準曲線，后續(xù)試驗以此計算短桿菌素的含量。

brevibacillin V峰面積（x）與濃度（y）的標準方程為：y=0.0867x-4.9292（R2=0.99916）。

brevibacillin峰面積（x）與濃度（y）的標準方程為：y=0.1548x-0.273（R2=0.99955）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究中所有的試驗均進行3次重復，數(shù)據(jù)使用IBM SPSS Statistics 22的單因素ANOVA進行顯著性分析（P＜0.05），使用Origin 2018進行數(shù)據(jù)繪圖，Design-Expert.V8.0.6進行響應面試驗設計及分析。

2 結果與分析

2.1 碳源、氮源及無機鹽對發(fā)酵短桿菌素的影響

2.1.1 碳源的影響 在初始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎上進行碳源的優(yōu)化，分別以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖及果糖作為碳源進行優(yōu)化，結果如圖1所示。試驗結果顯示，在不同種類的供試碳源中，蔗糖的添加可以促進發(fā)酵液中短桿菌素的含量，并且當蔗糖的添加量為40.0 g/L時，短桿菌素的含量達到最高，是對照組含量的1.12倍，所以選擇添加量為40.0 g/L的蔗糖作為最佳碳源。

圖1 不同碳源對短桿菌素含量的影響Fig.1 Effect of different carbon sources on brevibacillin production

2.1.2 氮源的影響 在初始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎上進行氮源的優(yōu)化，分別以硫酸銨、牛肉膏、酵母膏及玉米漿作為氮源進行優(yōu)化，結果如圖2所示。試驗結果顯示，在不同種類的供試氮源中，牛肉膏的添加可以促進發(fā)酵液中短桿菌素的含量，并且當牛肉膏的添加量為30.0 g/L時，短桿菌素的含量達到最高，是對照組含量的1.2倍，考慮到后續(xù)工業(yè)化生產的經(jīng)濟效益，所以選擇添加量為30.0 g/L的牛肉膏作為最佳氮源。

圖2 不同氮源對短桿菌素含量的影響Fig.2 Effect of different nitrogen sources on brevibacillin production

2.1.3 無機鹽的影響 無機鹽離子作為酶的重要組成成分、激活劑及抑制劑，可以參與微生物代謝的不同階段，影響微生物的次級代謝產物[24]。在初始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎上進行無機鹽離子的優(yōu)化，分別以鉀離子、鎂離子及鈣離子作為無機鹽離子進行優(yōu)化，結果如圖3所示。試驗結果顯示，在不同種類的供試無機鹽離子中，鎂離子的添加可以促進發(fā)酵液中短桿菌素的含量，當發(fā)酵培養(yǎng)基中鎂離子的添加量分別為10.0 g/L和20.0 g/L時，短桿菌素的含量并不具有顯著性的差異，且考慮到發(fā)酵環(huán)境各種因素存在會影響發(fā)酵結果，因此選擇添加量為10.0 g/L的鎂離子作為最佳無機鹽離子。

圖3 不同無機鹽離子對短桿菌素含量的影響Fig.3 Effect of different inorganic salt ions on brevibacillin production

2.2 Plackett-Burman設計篩選影響短桿菌素含量的顯著因素

可能影響發(fā)酵液中短桿菌素含量的因素主要包括胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、蔗糖、牛肉浸膏、鎂離子等，利用PB試驗對這6個因素進行全面考察，篩選影響顯著的因素。PB試驗結果見表4，各因素之間的水平及效應評價見表5。由試驗結果可知，該試驗模型P=0.0026＜0.05，說明該試驗模型影響顯著，決定系數(shù)為R2=0.9585，矯正系數(shù)為R2Adj=0.9086，兩者較為接近，說明該模型對于試驗的重復性較好，因素水平設計合理。各因素對短桿菌素含量的影響顯著性大小排序為：鎂離子＞牛肉浸膏＞蔗糖＞氯化鈉＞胰蛋白胨＞酵母提取物，其中鎂離子的添加對于短桿菌素含量的增加具有極顯著影響（P＜0.01）。因此，選擇鎂離子、蔗糖和牛肉浸膏作為主要影響因素進行下一步試驗。

表4 Plackett-Burman的試驗設計及結果Table 4 Experimental design of Plackett-Burman and corresponding results

表5 Plackett-Burman設計的各因素水平及效應評價Table 5 Factors, levels and effect estimates of Plackett-Burman design

2.3 最陡爬坡試驗確定響應面試驗中心點

通過PB試驗篩選出前三個對于側孢短芽孢桿菌產短桿菌素影響較為顯著的因子，分別為蔗糖、牛肉浸膏及鎂離子，以此為基礎進行最陡爬坡試驗確定響應面試驗中心點。由于三個顯著因子對于短桿菌素合成的效應系數(shù)均為負值，因此選擇低水平進行爬坡試驗，試驗結果見表6。從表中可看出，第二組試驗的短桿菌素的含量達到最高，因此選擇第二組試驗的每個因子的水平作為響應面試驗的中心點，即蔗糖28 g/L、牛肉浸膏18 g/L、鎂離子12.5 g/L。

表6 最陡爬坡試驗結果Table 6 Results of steep climbing experimental

2.4 BBD響應面優(yōu)化培養(yǎng)基配方

根據(jù)Plackett-Burman試驗結果，運用Box-Behnken Design試驗對影響側孢短芽孢桿菌產短桿菌素的三個主要因素進行進一步優(yōu)化，表7為Box-Behnken Design試驗設計及結果，利用Design-Expert 8.06軟件對Box-Behnken Design的試驗結果進行回歸分析，得到的回歸方程Y=448.80+11.58A-81.55B+32.16C-4.14AB-5.46AC-57.51BC-35.32A2-193.29B2-110.77C2，其中，Y代表短桿菌素的含量，A、B、C分別代表蔗糖含量、牛肉浸膏含量與鎂離子含量的編碼值[25]。

表7 Box-Behnken設計及結果Table 7 Design and result of Box-Behnken

由表8方差分析可知，該模型的F值為22.10，P＜0.01，說明該模型極顯著，失擬項F值為1.65，P＞0.05，失擬項不顯著，模型的決定系數(shù)R2=0.9660，說明該模型具有良好得相關性，模型的校正決定系數(shù)R2Adj=0.9223，與R2較為接近，說明該模型的擬合度高。其中，B、B2、C2對短桿菌素的影響極顯著（P＜0.01），BC對短桿菌素含量的影響顯著（P＜0.05）。

表8 回歸模型的方差分析Table 8 Analysis of variance for the proposed quadratic polynomial model

圖5 蔗糖和鎂離子對短桿菌素含量影響的響應面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots of the effects of sucrose and Mg2+ on the content of brevibacillin

根據(jù)獲得的二次回歸方程及試驗方差分析結果，借助Design-Expert.V8.0.6軟件可繪制不同組合因子之間的等高線圖和響應面分析圖（圖4～圖6），進而更加直觀地觀察因子之間的交互作用對短桿菌素含量的影響。其中等高線圖中越接近圓形表示兩因子之間交互作用不顯著，橢圓形表示交互作用顯著[26-27]。由響應曲面圖可知，隨著各因素濃度的增加，發(fā)酵液中短桿菌素的含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，由圖6可看出，鎂離子含量的變化對于短桿菌素含量的影響較蔗糖和牛肉浸膏更大。該響應面圖說明不同因素之間存在交互作用，共同影響著側孢短芽孢桿菌產短桿菌素的生物合成，并且牛肉浸膏含量與鎂離子含量之間的交互作用比較顯著。

圖4 蔗糖和牛肉浸膏對短桿菌素含量影響的響應面圖和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots of the effects of sucrose and beef extract on the content of brevibacillin production

圖6 牛肉浸膏和鎂離子對短桿菌素含量影響的響應面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots of the effects of beef extract and Mg2+ on the content of brevibacillin production

2.5 發(fā)酵驗證模型

利用Design Expert軟件進行分析后，得到培養(yǎng)基組分中各顯著因子的最優(yōu)濃度為：蔗糖含量28.65 g/L、牛肉浸膏含量17.04 g/L、鎂離子含量13.01 g/L。在此基礎上重復3次試驗，測得短桿菌素含量的平均值為457.87±5.12 μg/mL，與預測值462.94 μg/mL偏差1.09%，表明該模型能夠很好地預測實際的短桿菌素的含量情況，較初始發(fā)酵培養(yǎng)基短桿菌素含量（340.5±16.35 μg/mL）提高34.6%。

3 討論與結論

本研究利用PB試驗對影響短桿菌素含量的六個因素進行篩選試驗，試驗結果顯示鎂離子、牛肉浸膏及蔗糖的含量對于短桿菌素的含量影響顯著（P＜0.05），并且鎂離子的添加可明顯提高發(fā)酵液中短桿菌素的含量，在糖酵解等途徑中鎂離子可以作為激活劑，輔助次級代謝產物的生物合成[28]，從而促進短桿菌素含量的增加。也有相關研究可表明在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加鎂離子可促進微生物次級代謝物的合成[29]，Wang等[30]研究了海洋來源真菌AscotrichaZJ-M-5的次級代謝產物，結果表明鎂離子是石竹烯型倍半萜類化合物ascotrichol生物合成的必要條件。通過最陡爬坡試驗逼近了短桿菌素含量最大值區(qū)域。在此基礎上利用Box-Behnken Design試驗對以上三個因素進行進一步優(yōu)化，建立以短桿菌素含量為響應值的二次回歸模型，最終獲得側孢短芽孢桿菌fmb70-24產短桿菌素的最適培養(yǎng)基配方為：蔗糖28.65 g/L、牛肉浸膏17.04 g/L、鎂離子13.01 g/L、胰蛋白胨10 g/L、氯化鈉10 g/L、酵母提取物5 g/L、菌種接種量2%，發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度30 ℃、搖床轉速180 r/min、發(fā)酵時間24 h、初始培養(yǎng)基pH自然，優(yōu)化后發(fā)酵液中短桿菌素含量較未優(yōu)化提高34.6%，為短桿菌素的工業(yè)化生產應用提供理論基礎和技術支持。