李世英 張晉霞 張志勇 張 蕊 任 伯 劉 斌

（華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院，河北 唐山 063000）

腦血流的恢復(fù)是缺血性卒中后生存的基礎(chǔ)［1］。然而，腦血管再通后可能通過鈣超載、炎癥反應(yīng)、凋亡、血腦屏障（BBB）損傷等機(jī)制進(jìn)一步加重腦組織的損傷［2-3］，這就是腦缺血再灌注損傷，但其具體機(jī)制尚不清楚。凋亡是由Bcl-2家族和Fas系統(tǒng)等促凋亡和抗凋亡蛋白調(diào)控［4-5］，在缺血-再灌注損傷（I/R）的過程中起著非常重要的作用。研究證實(shí)，如果細(xì)胞的凋亡受到抑制，I/R損傷的程度將有所減輕［6-7］。在線粒體信號(hào)通路中，Bcl-2家族在凋亡中起著關(guān)鍵性作用。Bcl-2與Bax之間的平衡發(fā)生改變可能會(huì)加重或抑制神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡。在I/R損傷的機(jī)制中，JNK、ERK1/2和p38等信號(hào)通路在調(diào)控細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用［8-10］。ERK信號(hào)通路啟動(dòng)自我修復(fù)過程，在腦I/R損傷的恢復(fù)中發(fā)揮重要作用。p38和JNK是細(xì)胞應(yīng)激的介質(zhì)，參與炎癥和神經(jīng)元細(xì)胞凋亡［11］。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性SD大鼠購于北京華阜康公司，許可證號(hào)SCXK（冀）2015-0038，共36只，鼠齡為8～10周，體質(zhì)量250～300 g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于華北理工大學(xué)屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，室內(nèi)溫度維持在21～23℃，濕度保持在50%～60%。36只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、I/R組、Res組，每組12只。6只大鼠用于制備石蠟組織塊，進(jìn)行HE染色和TUNEL染色，6只大鼠用于Western blotting法檢測(cè)大鼠腦組織JNK、p-JNK、P38、p-P38的表達(dá)。

1.2 試藥與儀器

白藜蘆醇購自Sigma公司（貨號(hào)R5010，含量≥99%），TUNEL試劑盒購自武漢博士德公司，JNK、p-JNK、P38、p-P38抗體均購自abcam公司。光學(xué)顯微鏡購自日本OLYMPUS公司，蛋白電泳儀購自北京六一公司，SDS-PAGE電泳槽購自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 模型制備

參照改良的Longa法［13］，大鼠稱重后用10%水合氯醛按照350 mg/kg腹腔麻醉。頸部正中切口，鈍性分離出右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）、右側(cè)頸外動(dòng)脈（ECA）和右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）。結(jié)扎右側(cè)ECA，CCA、ICA用動(dòng)脈夾夾閉。在右側(cè)頸外A刺破一小口，將MCAO線栓從ECA緩慢插入，松開右側(cè)CCA動(dòng)脈夾，將MCAO線栓插入右側(cè)CCA，深度一般為（18.5±0.5）mm，感到有阻力感后停止，逐層縫合。2 h后緩慢將線栓拔出約10 mm。假手術(shù)組只分離相應(yīng)的血管，但不結(jié)扎血管。神經(jīng)功能檢查由2名不知情人員進(jìn)行，0分為沒有神經(jīng)功能缺陷，1分為大鼠左前爪無力，2分為大鼠走路時(shí)向左轉(zhuǎn)，3分為大鼠走路時(shí)向?qū)?cè)摔倒，4分為大鼠不能自然行走，甚至出現(xiàn)昏迷。選取0～3分大鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 分組及給藥

隨機(jī)將大鼠分為假手術(shù)組、模型組、白藜蘆醇組，每組12只。造模成功后，白藜蘆醇組在2 h將MCAO線栓拔出即刻給予腹腔注射白藜蘆醇40 mg/kg，假手術(shù)組大鼠同一時(shí)間腹腔注射等體積0.9%氯化鈉注射液。

近年來，晚霜、倒春寒、冰雹等自然災(zāi)害都會(huì)導(dǎo)致櫻桃減產(chǎn)甚至絕收。其中，倒春寒導(dǎo)致櫻桃花期授粉受精不良，每年櫻桃損失約20%的產(chǎn)量；雹災(zāi)在果實(shí)膨大接近成熟期時(shí)危害櫻桃果實(shí)，可導(dǎo)致15%～85%的櫻桃受損；成熟期遇陰雨天氣，可導(dǎo)致近20%的櫻桃果實(shí)采前落果和裂果。雖然全區(qū)一直在增強(qiáng)對(duì)基地建設(shè)的支持力度，但絕大多數(shù)果園投入側(cè)重于保證櫻桃苗木的定植成活，少有果園在機(jī)耕道、生產(chǎn)便道、小水窖及其他必要農(nóng)機(jī)的配套上實(shí)現(xiàn)相對(duì)完善，嚴(yán)重影響櫻桃果實(shí)采收后的運(yùn)輸，增加了果品種植和采收成本，降低了種植戶的經(jīng)濟(jì)效益，削弱了抵御自然災(zāi)害的能力。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè)

1.5.1 大鼠腦組織的病理學(xué)觀察 大鼠I/R后24 h，每組各取6只大鼠，麻醉后斷頭取腦，用4%多聚甲醛固定腦組織，石蠟包埋，用切片機(jī)切成4 μm厚的切片，按照HE染色步驟進(jìn)行去脂，蘇木精伊紅染色，封片。使用光鏡觀察大鼠腦組織的病理學(xué)變化。

1.5.2 Western blotting法 大鼠I/R后24 h，每組取6只大鼠，麻醉后迅速斷頭取腦，取新鮮腦組織，4℃生理鹽水沖洗。收集腦組織，放入-80℃冰箱儲(chǔ)存待用。制備蛋白樣品：取出所需的腦組織樣本，在預(yù)冷過的玻璃器皿中研磨至粉末，加入裂解液，冰上放置30 min，放入4℃離心機(jī)中，12 000 r/min離心20 min，取上清待測(cè)。使用BCA蛋白試劑盒測(cè)定蛋白的濃度。將100 μg蛋白與緩沖液混合，取適量蛋白上樣，經(jīng)10% SDS電泳結(jié)束后，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，然后用5%脫脂奶粉在室溫下孵育1 h，加入不同的已稀釋的一抗，4℃過夜。洗膜，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育2 h。對(duì)條帶進(jìn)行掃描，用Quantity One圖像軟件分析條帶結(jié)果。

1.5.3 TUNEL法 嚴(yán)格按照TUNEL試劑盒的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行操作。將制備好的腦組織石蠟切片常規(guī)進(jìn)行脫蠟水化，PBS沖洗3 min共3次；37℃胃蛋白酶孵育60 min，PBS沖洗3 min共3次；3% H2O2在37℃孵育30 min，PBS沖洗3 min共3次；37℃TUNEL反應(yīng)液孵育60 min，PBS沖洗3 min共3次；辣根過氧化酶抗體37℃孵育30 min，PBS沖洗3 min共3次；DAB顯色，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，梯度酒精進(jìn)行脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。光鏡下觀察大鼠凋亡細(xì)胞：陽性的細(xì)胞為神經(jīng)元細(xì)胞核被染成棕黃色顆粒，計(jì)算細(xì)胞凋亡率（%）=凋亡數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用IBM SPSS24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以（）來表示。多組間比較釆用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較

見表1。腦缺血再灌注后1 d，白藜蘆醇組大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說明白藜蘆醇在大鼠腦缺血再灌注后可以明顯減輕大鼠神經(jīng)功能受損程度。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分及梗死側(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率比較（±s）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分及梗死側(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與假手術(shù)組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組 別n 神經(jīng)功能缺損評(píng)分（分）n 凋亡率（%）假手術(shù)組模型組白藜蘆醇組12 12 12 0.00±0.00 2.46±0.38 1.86±0.52*6 6 6 1.64±0.53 29.37±6.32△△19.36±3.85**△△

2.2 各組大鼠腦組織病理學(xué)觀察

光鏡下假手術(shù)組腦組織結(jié)構(gòu)正常，未發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元有明顯的破壞或神經(jīng)元發(fā)生缺失。神經(jīng)元細(xì)胞核結(jié)構(gòu)正常，核仁清晰，細(xì)胞的包漿豐富。與假手術(shù)大鼠相比，模型組大鼠梗死側(cè)腦組織結(jié)構(gòu)紊亂，神經(jīng)元細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，體積縮小，細(xì)胞核發(fā)生固縮。白藜蘆醇組與模型組比較，神經(jīng)元數(shù)量有所增多，細(xì)胞水腫較輕，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)破壞程度較I/R組有所減輕。結(jié)果顯示白藜蘆醇可以改善I/R大鼠的腦組織的損傷程度。見圖1。

2.3 各組大鼠梗死側(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況

見圖2，表1。凋亡細(xì)胞核深染，出現(xiàn)皺縮，假手術(shù)組中僅觀察到少量tunel陽性細(xì)胞。模型組組大鼠tunel陽性細(xì)胞明顯多于假手術(shù)組（P＜0.01）。白藜蘆醇組tunel陽性細(xì)胞明顯少于模型組（P＜0.01）。提示白藜蘆醇可以減輕I/R大鼠腦組織凋亡的發(fā)生。

2.4 各組大鼠梗死側(cè)腦組織JNK、p-JNK、P38、p-P38表達(dá)的比較

見圖3，表2。結(jié)果顯示，JNK和p38在各組腦組織中的表達(dá)無明顯差異（P＞0.05）。假手術(shù)組p-P38的表達(dá)較弱，腦缺血再灌注后明顯上調(diào)了p-P38的表達(dá)，與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。白藜蘆醇組下調(diào)了p-P38的表達(dá)，與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。假手術(shù)組p-JNK的表達(dá)較低，腦缺血再灌注后明顯上調(diào)了p-JNK的表達(dá)，與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。白藜蘆醇組下調(diào)了p-JNK的表達(dá)，與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組大鼠梗死側(cè)腦組織JNK、p-JNK、P38和p-P38蛋白表達(dá)比較（±s）

表2 各組大鼠梗死側(cè)腦組織JNK、p-JNK、P38和p-P38蛋白表達(dá)比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組白藜蘆醇組n 6 6 6 P38 0.23±0.08 0.25±0.06 0.21±0.07 p-P38 0.11±0.03 0.49±0.08△△0.39±0.05*△△JNK 0.33±0.11 0.31±0.09 0.29±0.13 p-JNK 0.30±0.07 0.51±0.09△△0.41±0.06*△

3 討 論

據(jù)估計(jì)，中風(fēng)的終生風(fēng)險(xiǎn)為8%～10%。缺血性卒中占所有卒中的85%，出血性卒中占15%［14］。缺血性腦中風(fēng)嚴(yán)重影響人類的健康，其發(fā)病機(jī)制主要是由I/R引起。I/R損傷機(jī)制，主要包括能量谷氨酸毒性、Ca2+超載、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)［15］、一氧化氮（NO）合成過度、細(xì)胞凋亡等諸多原因［16-17］。絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）在神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖中發(fā)揮作用。MAPKs信號(hào)通路在神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)，調(diào)控腦I/R損傷后神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)或凋亡［18］。MAPKs的主要3個(gè)亞家族：細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERKs）、c-Jun n端激酶（JNKs）和p38激酶［19］。在腦缺血再灌注過程中，許多凋亡調(diào)節(jié)信號(hào)通路被激活，如ERK1/2、JNK和p38信號(hào)通路。這些通路在調(diào)控細(xì)胞凋亡中起著關(guān)鍵作用［20］。ERK是激活基因表達(dá)的信號(hào)分子，有研究報(bào)道ERK1/2激活通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族表達(dá)促進(jìn)腦細(xì)胞增殖，調(diào)控缺血誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［21］。JNK通路也通過與線粒體凋亡機(jī)制相互作用在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。Tournier等［22］發(fā)現(xiàn)JNK磷酸化可調(diào)節(jié)缺血性損傷中與凋亡相關(guān)的下游信號(hào)通路。p38 MAPK已被證明在局灶性腦缺血后被激活，p38通路通過PARP和Caspase-9介導(dǎo)的機(jī)制參與細(xì)胞凋亡［23］。這些信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞凋亡，主要涉及Bcl-2家族。

中醫(yī)學(xué)稱中風(fēng)為中風(fēng)病，屬于急癥，以口舌歪斜、言語不利、肌膚不仁、半身不遂、甚至昏仆、不省人事為主要臨床表現(xiàn)，辨證分型分為中臟腑、中經(jīng)絡(luò)。

1940年白藜蘆醇首次從白藜蘆根中提取出來，1963年白藜蘆醇從中藥虎杖中提取出來。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇具有防輻射、抗氧化應(yīng)激、抗癌、延緩衰老、保護(hù)心臟和神經(jīng)、抗炎、抗微生物、免疫調(diào)節(jié)等特性。研究報(bào)道［24］白藜蘆醇能明顯改善大鼠神經(jīng)功能，減少大鼠腦梗死體積，減少神經(jīng)元損傷，顯著降低神經(jīng)元的凋亡。白藜蘆醇顯著上調(diào)了p-JAK2、p-STAT3、p-AKT、p-mTOR和BCL-2的表達(dá)，下調(diào)了cleaved Caspase-3和BAX的表達(dá)。提示白藜蘆醇對(duì)大鼠I/R具有神經(jīng)保護(hù)作用，其部分機(jī)制可能與激活JAK2/STAT3和PI3K/AKT/mTOR有關(guān)。白藜蘆醇可能通過激活JAK2/STAT3間接上調(diào)PI3K/AKT/mTOR通路。我們前期報(bào)道［12］白藜蘆醇可以上調(diào)Bcl-2，下調(diào)Bax的表達(dá)，參與凋亡的發(fā)生發(fā)展。但是白藜蘆醇對(duì)大鼠腦缺血再灌注后JNK、P38是否有影響尚不明確。在本研究中，我們使用TUNEL法觀察白藜蘆醇對(duì)MCAO大鼠凋亡的影響，結(jié)果顯示：模型組大鼠腦組織的凋亡細(xì)胞明顯高于假手術(shù)組，白藜蘆醇組凋亡細(xì)胞低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明白藜蘆醇可以減輕大鼠神經(jīng)元的凋亡程度。采用Western blotting法觀察I/R后腦組織中JNK、p-JNK、P38、p-P38的表達(dá)，結(jié)果顯示：JNK和p38在各組腦組織中的表達(dá)無明顯差異，腦缺血再灌注后明顯上調(diào)了p-JNK、p-P38的表達(dá)，與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致［25］。白藜蘆醇組下調(diào)了p-JNK、p-P38的表達(dá)，與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，本研究結(jié)果提示白藜蘆醇對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，可能是通過下調(diào)p-JNK、pp38的水平，減少大鼠神經(jīng)元的凋亡起作用的。