栗 浩 文 謙 胡航綺 潘 慧 徐 旭 李 寧△

（1.四川大學(xué)華西醫(yī)院，四川 成都 610041；2.四川大學(xué)華西第四醫(yī)院，四川 成都 610041；3.四川省南充市身心醫(yī)院，四川 南充 637700）

重癥急性胰腺炎（SAP）是臨床常見急腹癥，是多種病因?qū)е乱让冈谝认賰?nèi)被激活后引起自身組織消化、水腫、出血、壞死的炎癥反應(yīng)，其發(fā)病急驟，可引起嚴(yán)重的局部和全身并發(fā)癥，病死率高達(dá)36%～50%［1］。腸道是SAP病理生理過程中最早也是最易受損的器官之一，SAP并發(fā)腸道動力障礙造成腸道內(nèi)細(xì)菌和內(nèi)毒素排泄障礙，導(dǎo)致細(xì)菌過度生長、腸道黏膜屏障受損，細(xì)菌入血或遷移到腹腔，從而引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能障礙，是導(dǎo)致SAP患者病死的重要原因［2-4］。因此，恢復(fù)腸道黏膜屏障的免疫功能，減少腸道細(xì)菌過度生長和移位，從而控制炎癥反應(yīng)，是改善SAP預(yù)后的關(guān)鍵。近年來，更有學(xué)者提出SAP治療關(guān)鍵應(yīng)“從腸論治”的新觀點［5］。

電針足三里穴對SAP患者具有改善腸道動力障礙及減輕炎癥反應(yīng)的雙重療效，為臨床上治療重癥急性胰腺炎使用頻次最高的穴位［6］。目前已有較多研究證實電針足三里穴在改善腸道動力方面的療效及作用機(jī)制，但在減輕炎癥反應(yīng)方面的作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。本團(tuán)隊前期實驗研究已發(fā)現(xiàn)電針足三里穴可動態(tài)調(diào)整血清中促炎因子與抗炎因子含量的平衡，減輕胰腺炎癥反應(yīng)［7］，其作用機(jī)制可能與電針足三里穴調(diào)節(jié)腸道免疫功能有關(guān)。因此本研究擬在既往研究的基礎(chǔ)上，從SAP大鼠小腸分泌型IgA（SIgA）的表達(dá)及其影響因素入手，進(jìn)一步探討電針足三里穴對SAP大鼠腸道免疫功能的影響［1］。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 72只SD雄性大鼠，10～12周齡，體質(zhì)量180～220 g，購于成都達(dá)碩實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（川）2020-030。動物飼養(yǎng)于四川大學(xué)華西科技園動物中心SPF級動物房中，室內(nèi)溫度維持在（23±2）℃，相對濕度維持在40%～60%，照明控制為12 h白天/黑夜循環(huán)，每籠5只，實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。本實驗獲得四川大學(xué)華西醫(yī)院動物保護(hù)倫理委員會批準(zhǔn)（倫理號：2020002A），所有操作均按相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

1.2 試藥與儀器 牛磺膽酸鈉購自美國Sigma公司，戊巴比妥鈉購自美國Merk公司，0.9%氯化鈉注射液購自成都青山利康藥業(yè)，血清白細(xì)胞介素-4（IL-4）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）、干擾素-γ（IFN-γ）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）ELISA試劑盒購自美國eBioscience公司，SIgA抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，二抗及通用型S-P免疫組化試劑盒購自北京中山生物技術(shù)有限公司。Synergy Mx多功能酶標(biāo)儀由香港基因有限公司研制；電針儀采用華佗電針治療儀，SDZ-V型，由蘇州醫(yī)療用品廠有限公司研制；一次性無菌針灸針（0.23 mm×13 mm）由無錫佳健醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)。

1.3 分組與造模 將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、電針組，每組24只。參照Aho等［8］的造模方法并加以改進(jìn)，大鼠術(shù)前12 h禁食不禁水，采用胰膽管內(nèi)逆行注射3.5%?；悄懰徕c制備SAP大鼠模型。取3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔內(nèi)注射麻醉后固定于手術(shù)臺，由腹壁正中入腹切口約2 cm，提起十二指腸，在膽胰管十二指腸開口處對側(cè)腸壁，用24號靜脈留置針穿刺后針尖稍向上抬經(jīng)乳頭探入膽總管，拔出針芯，用外套管繼續(xù)沿膽總管方向推入1～2 cm，固定以防止脫出。用微型血管鉗夾住近肝端，將3.5%牛磺膽酸鈉溶液按0.1 mL/100 g微量泵5 min內(nèi)泵完，留置針和微血管夾保留5 min。觀察到大鼠胰腺出現(xiàn)水腫、出血、壞死等改變，即為造模成功。假手術(shù)組手術(shù)操作相同，但不注射藥物。

1.4 干預(yù)方法 各組均在造模成功后給予基礎(chǔ)治療：分別于第0、2、4小時用0.9%氯化鈉注射液2 mL/100 g灌胃，此后每隔4小時背部皮下注射0.9%氯化鈉注射液1 mL/100 g為大鼠提供補液支持）［2］。電針組：分別在造模成功后和處死前于雙側(cè)“足三里”穴（位于大鼠后肢膝關(guān)節(jié)外下方腓骨小頭下約5 mm處［9］）進(jìn)行電針刺激。操作：將大鼠放入固定器中，取0.23 mm×13 mm毫針直刺進(jìn)針7 mm左右，輕微提插捻轉(zhuǎn)至有緊滯感后將針柄連接電針治療儀（型號：SDZ-V），電針參數(shù)：疏密波2 Hz，連續(xù)刺激30 min。假手術(shù)組及模型組大鼠在相同時間點僅固定30 min，不予電針治療。

1.5 標(biāo)本采集與檢測 1）各組大鼠分別于術(shù)后3、6、12 h各處死8只于心臟左心室取血處死，留取血液、胰腺及小腸組織標(biāo)本，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測各組血清中IL-4、IL-10、TGF-β、IFN-γ的含量。2）制作胰腺及小腸組織的石蠟切片，切片蘇木精和伊紅染色后用無水乙醇進(jìn)行梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，于鏡下觀察各組胰腺組織及小腸組織病理變化并進(jìn)行評分。3）免疫組化法測定小腸組織中SIgA的表達(dá)。石蠟切片置于二甲苯后用無水乙醇至水，將切片浸泡在3% H2O2中氧化，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；PBS清洗后將浸泡于EDTA溶液中，微波爐修復(fù)8 min重復(fù)2次；PBS洗2 min重復(fù)3次；滴加一抗，4℃孵育過夜；PBS洗2 min重復(fù)3次；滴加二抗，37℃孵育1 h；PBS洗2min重復(fù)3次；加DAB顯色液顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核1 min后流水沖洗，無水乙醇脫水；二甲苯透明后用中性樹膠封片。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.00統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，方差齊者同一指標(biāo)比較采用方差分析，對方差不齊者采用秩和檢驗，組間比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清IL-4、IL-10含量比較 見表1。模型組血清IL-4、IL-10含量明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05）；電針組各時間點血清IL-4、IL-10含量明顯低于模型組（P＜0.05）。

表1 各組大鼠各時間點血清IL-4、IL-10含量比較（pg/mL，±s）

表1 各組大鼠各時間點血清IL-4、IL-10含量比較（pg/mL，±s）

注：與假手術(shù)組同期比較，*P＜0.05；與模型組同期比較，△P＜0.05。下同。

組別假手術(shù)組（n=24）模型組（n=24）電針組（n=24）時間3 h 6 h 12 h 3 h 6 h 12 h 3 h 6 h 12 h IL-4 15.723±1.985 11.560±1.763 8.193±1.068 19.298±1.391*15.125±1.561*13.459±0.816*15.398±1.291△12.178±1.255△10.086±0.899*△IL-10 551.093±24.842 454.145±28.662 339.972±32.299 964.034±32.907*871.387±25.911*662.692±27.421*719.788±27.458*△656.038±33.490*△458.402±16.063*△

2.2 各組大鼠血清TGF-β1、IFN-γ含量比較 見表2。模型組血清TGF-β1含量明顯低于假手術(shù)組（P＜0.05）；電針組各時間點血清TGF-β1含量明顯高于模型組（P＜0.05）。模型組血清IFN-γ含量明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05）；電針組各時間點血清IFN-γ含量明顯低于模型組（P＜0.05）。

表2 各組大鼠各時間點血清TGF-β1、IFN-γ水平及小腸SIgA蛋白表達(dá)比較（pg/mL，±s）

表2 各組大鼠各時間點血清TGF-β1、IFN-γ水平及小腸SIgA蛋白表達(dá)比較（pg/mL，±s）

組別假手術(shù)組（n=24）模型組（n=24）電針組（n=24）時間3 h 6 h 12 h 3 h 6 h 12 h 3 h 6 h 12 h TGF-β1 3 240.978±29.660 3 449.565±33.414 3 593.551±24.314 2 606.231±18.541*2 747.312±28.006*2 823.101±33.581*2 696.597±37.690*△2 830.025±35.279*△3 298.280±31.254*△IFN-γ 213.105±17.322 156.787±24.943 102.613±11.902 421.900±29.077*330.056±26.889*212.865±22.473*308.593±32.902*△253.673±33.466*△113.883±33.159*△SIgA 4.250±1.669 4.875±1.246 6.250±1.282 1.625±1.061*1.875±1.356*2.375±1.061*3.125±1.458*△3.750±1.670*△4.250±1.669*△

2.3 各組大鼠胰腺病理評分的比較 見圖1。假手術(shù)組胰腺腺泡細(xì)胞正常，結(jié)構(gòu)完整，無出血及壞死；模型組大鼠胰腺組織水腫明顯，可見多處出血及壞死灶，胰腺間質(zhì)、導(dǎo)管及其周圍可見大量中性粒細(xì)胞浸潤；電針組大鼠胰腺組織水腫、出血、壞死及中性粒細(xì)胞浸潤均較模型組減輕。

根據(jù)Schmidt's標(biāo)準(zhǔn)［10］對胰腺病理切片進(jìn)行病理評分，各時點假手術(shù)組胰腺病理評分明顯低于模型組（P＜0.05）。電針組胰腺病理評分亦低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 各組大鼠各時間點胰腺病理評分及小腸病理評分比較（分，±s）

表3 各組大鼠各時間點胰腺病理評分及小腸病理評分比較（分，±s）

組別假手術(shù)組（n=24）模型組（n=24）電針組（n=24）時間3 h 6 h 12 h 3 h 6 h 12 h 3 h 6 h 12 h胰腺病理評分5.454±0.308 5.852±0.091 4.292±0.177 13.666±0.327*14.182±0.575*12.776±1.020*11.816±0.160*△10.480±0.392*△8.502±0.176*△小腸病理評分5.454±0.308 0.875±0.641 1.188±0.372 1.375±0.518*2.063±0.623*2.875±0.744*1.250±0.378*1.438±0.496△1.375±0.443△

2.4 各組大鼠小腸病理評分的比較 見圖2。對取樣的小腸組織進(jìn)行包埋切片，蘇木精-伊紅染色后光鏡觀察，假手術(shù)組可見小腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)完整，小腸絨毛排列整齊，未見脫落，及炎性浸潤等情況。而模型組小腸黏膜下層出現(xiàn)明顯的炎性細(xì)胞浸潤，小腸絨毛出現(xiàn)損傷，排列紊亂，上皮脫落，絨毛腫脹等。電針組治療后，小腸黏膜絨毛排列較整齊，未見明顯脫落、腫脹等情況。

根據(jù)Chiu's標(biāo)準(zhǔn)［11］對小腸病理切片進(jìn)行病理評分，各時點假手術(shù)組小腸病理評分明顯低于模型組（P＜0.05）。電針組小腸病理評分在3 h時與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義外，在其余各時間點均低于模型組，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

2.5 各組大鼠小腸SIgA蛋白表達(dá)比較 見圖3。大鼠小腸SIgA蛋白在假手術(shù)組中有較強陽性表達(dá)，陽性細(xì)胞染色主要集中在細(xì)胞核，呈棕黃色或棕褐色；SIgA蛋白在模型組中僅有少量表達(dá)；電針組在同時間點的SIgA蛋白表達(dá)均較模型組增強。模型組及電針組造模后各時間點與假手術(shù)組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），電針組在各時間點與模型組相比，也均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

3 討 論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為急性胰腺炎多屬于“脾心痛”“脾熱病”“結(jié)胸病”等范疇。病位涉及脾胃、肝膽、腸腑，病勢危重時累及多臟器。多種病因?qū)е職庥?、濕熱、實熱、血瘀之實邪結(jié)聚于脾胃肝膽，致腹痛、嘔吐、腹脹、腸腑不通等癥候，以“少陽陽明合病”為主要特點，治療上普遍以通里攻下法為主，輔以疏肝理氣、清熱除濕、活血化瘀等治法［12］。根據(jù)“肚腹三里留”這一經(jīng)典針灸選穴規(guī)律，足三里穴治療脾胃及腸道病癥最具優(yōu)勢，是臨床治療重癥急性胰腺炎腸道功能障礙最常用的穴位。同時，足三里穴還是足陽明胃經(jīng)的合穴，根據(jù)《靈樞·邪氣臟腑病形》中“合治內(nèi)腑”以及胃腸相連、氣機(jī)相通，《靈樞·本輸》中“大腸、小腸皆屬于胃”的原則，凡胃腸的疾患皆可選之，故足三里穴向來被作為首選穴廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代臨床的腹部疾病中［13］。已有臨床研究［14-15］表明電針足三里等穴位可有效改善急性胰腺炎患者腸黏膜的通透性，緩解患者腹痛、腹脹等癥狀，促進(jìn)急性胰腺炎病情恢復(fù)，但具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

目前認(rèn)為SAP腸黏膜損傷引起的腸黏膜屏障功能障礙、腸內(nèi)細(xì)菌微生態(tài)失衡和免疫功能下降，是引發(fā)胰腺及其周圍感染、全身炎性反應(yīng)和多器官功能障礙綜合征的重要因素［16］。當(dāng)SAP發(fā)生時腸黏膜通透性明顯增高，腸內(nèi)細(xì)菌易位，引起內(nèi)皮細(xì)胞活化，導(dǎo)致白細(xì)胞過度活化、促炎因子過度表達(dá)。而炎癥遞質(zhì)和細(xì)胞因子的釋放又能進(jìn)一步增加腸黏膜通透性，促使腸道中的細(xì)菌和內(nèi)毒素不斷侵入體內(nèi)形成惡性循環(huán)［17-18］。SIgA作為腸道黏膜表面的第一道免疫防線，抵抗各種內(nèi)源及外源性病原體。其主要由腸黏膜中的IgA漿細(xì)胞分泌，能抑制腸道內(nèi)的細(xì)菌黏附在腸黏膜表面，中和腸道內(nèi)的毒素、酶和病毒。TGF-β1是重要的IgA轉(zhuǎn)化生長因子，可通過刺激CD5+B細(xì)胞和IgA+細(xì)胞間接促進(jìn)SIgA的產(chǎn)生［19］；而細(xì)胞因子中的IFN-γ對SIgA的分泌有下調(diào)作用。血清中的IL-4和IL-10不僅能反映SAP的炎癥程度，同時還與免疫調(diào)節(jié)有明顯關(guān)系［20-21］。研究表明［22］IL-4與IL-10是一種重要的抗炎和免疫抑制細(xì)胞因子，主要由Th2淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，其通過抑制活化單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，抑制巨噬細(xì)胞協(xié)同炎性因子的表達(dá)，還能抑制Th1淋巴細(xì)胞釋放促炎因子，有效抑制巨噬細(xì)胞的表達(dá)。

本次研究結(jié)果顯示，在電針組各時間點大鼠血清中IL-4與IL-10的濃度均明顯低于模型組，表明電針組炎癥程度低于模型組。IFN-γ水平的高低與人體內(nèi)的免疫反應(yīng)具有相關(guān)性，IFN-γ是由Th1細(xì)胞分泌的一種促炎性因子，可促進(jìn)Th1與巨噬細(xì)胞發(fā)生炎性反應(yīng)。本次研究結(jié)果顯示模型組及電針組各時間點大鼠血清中的IFN-γ濃度均高于假手術(shù)組，說明高濃度IFN-γ與急性胰腺炎的炎癥反應(yīng)具有相關(guān)關(guān)系，而電針組IFN-γ濃度低于模型組，同樣也表明了電針組腸道炎癥程度較模型組有所改善；另一方面，IFN-γ對SIgA的分泌有下調(diào)作用，其濃度與SIgA的表達(dá)成負(fù)相關(guān)。TGF-β1可間接促進(jìn)SIgA的產(chǎn)生，本次研究中電針組各時間點血清TGF-β1含量均高于模型組，小腸SIgA表達(dá)電針組也均高于模型組，以上數(shù)據(jù)提示電針“足三里”穴可能在一定程度上通過影響IFN-γ、TGF-β1的濃度從而使SIgA的表達(dá)增強。腸道作為機(jī)體最大的免疫器官，SIgA在腸道黏膜免疫屏障中發(fā)揮著核心作用，因此，增加SIgA的表達(dá)是改善SAP腸道免疫功能，進(jìn)而減輕全身炎癥反應(yīng)的重要環(huán)節(jié)。

綜上所述，電針“足三里”穴可以減輕SAP大鼠模型炎癥反應(yīng)程度，其機(jī)制可能是增高TGF-β1、降低IFN-γ濃度，上調(diào)小腸SIgA蛋白的表達(dá)水平，從而保護(hù)腸黏膜屏障，提高大鼠腸道免疫功能，減少細(xì)菌過度生長或遷移到腹膜腔中感染已發(fā)生壞死的胰腺組織，改善SAP預(yù)后。