馬 莉 李玉紅 王保和 谷旭放△

（1.天津中醫(yī)藥大學，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，天津 300150）

心血管疾病是引起全球范圍內(nèi)人口死亡的重大衛(wèi)生公共事件之一，其中心肌梗死（MI）是導致心血管疾病高死亡率的“罪魁禍首”，據(jù)估計全世界每年有730萬人死于MI［1］。目前MI的治療主要包括藥物治療、經(jīng)皮冠狀動脈介入治療、冠狀動脈搭橋術等外科手術療法［2］，雖然這些治療有一定的療效，但它們均不能降低MI不良預后的風險。面對此挑戰(zhàn)，中醫(yī)藥憑借其多種活性成分和多種作用機制的特性，在MI的治療中具有獨特的優(yōu)勢和良好的應用前景。

中醫(yī)學中并無病名，但依據(jù)其臨床表現(xiàn)，將其歸屬于“胸痹”“真心痛”等范疇［3］；其病機為本虛標實，即氣虛為本，血瘀為標。治療應標本兼顧，因而采用補氣通脈、活血化瘀的治療大法［4］。“黃芪-丹參”是補氣活血的常用藥對。黃芪為補氣圣藥，可補氣益心。丹參具有活血，通心包絡之功，常與黃芪配伍治療胸痹［5］。目前研究表明“黃芪-丹參”藥對具有改善微循環(huán)、抗纖維化、抗炎等作用，廣泛應用于治療心腦血管疾病、肝腎和呼吸系統(tǒng)疾病等［6］。網(wǎng)絡藥理學是具有整體性和系統(tǒng)性的“網(wǎng)絡靶點”的新方法，通過多學科交叉互補結合，根據(jù)藥物對疾病靶點的調控作用，構建蛋白網(wǎng)絡節(jié)點圖，進而預測中藥治療的有效途徑［7］。本文研究依托國家自然科學基金，初步對“黃芪-丹參”抗MI的分子機制進行預測性挖掘，從生物信息學、網(wǎng)絡生物學角度探索關鍵活性成分及靶點，為課題后續(xù)研究把握較為精準的方向。

1 數(shù)據(jù)庫的建立與可視化分析

1.1 檢索“黃芪-丹參”藥對的活性化合物及對應靶點

中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP）是一個包含中國藥典中注冊的所有中草藥的數(shù)據(jù)庫，利用TCMSP數(shù)據(jù)檢索黃芪—丹參化合物成分，并以口服利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18為條件［8］篩選黃芪、丹參的有效化合物成分及對應靶點。然后利用Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/uniprot/）統(tǒng)一進行標準化處理，最后利用Microsoft Office Excel文本進行去重，梳理藥物活性成分和靶點基因。

1.2 構建藥物-疾病共同靶點

GeneCard是一個可提供有關所有帶注釋和預測的人類基因的集成數(shù)據(jù)庫。OMIM是人類基因和遺傳表型的全面而又權威的數(shù)據(jù)庫。以“Myocardial infarction”為檢索詞，應用GeneGard和OMIM數(shù)據(jù)庫檢索MI相關靶點，之后MI疾病靶點去重，最后利用Venny2.1.0軟件，構建可視化共有基因和差異基因的韋恩圖。

1.3 構建“藥物-有效成分-靶點-疾病”可視化網(wǎng)絡

利用Cytoscape3.7.1軟件，構建“藥物-成分-靶點-疾病”的可視化網(wǎng)絡圖。并通過Cytoscape3.7.1軟件中的“Network Analyzer”功能對網(wǎng)絡進行分析，節(jié)點（node）代表藥物、藥物有效成分、疾病、疾病-藥物共同潛在作用靶點，邊（edge）代表“藥物-有效成分-靶點-疾病”的聯(lián)系。

1.4 藥物-疾病共同靶點的PPI網(wǎng)絡構建及預測關鍵靶點

利用BisoGenet構建蛋白質互作（PPI）網(wǎng)絡。將藥物靶點和疾病靶點分別導入BisoGenet內(nèi)，生成2個PPI網(wǎng)絡，利用Cytoscape中的Merge功能篩選出2個PPI網(wǎng)絡的交集網(wǎng)絡，并利用CytoNCA對交集網(wǎng)絡進行拓撲學分析，然后根據(jù)拓撲學分析節(jié)點屬性值進行篩選，從而預測出關鍵靶點。

1.5 GO和KEGG富集分析

富集分析是將目標基因與基因數(shù)據(jù)庫中的成千上萬的基因集進行比較，得出目標基因參與特定的生物學過程、蛋白質注釋、基因的功能或基因的其他特征性的過程。利用Omicshare平臺對核心靶點進行基因本體（GO）二級分類富集分析。Metascape是一個可進行富集分析的可靠且權威的數(shù)據(jù)平臺，將篩選后的關鍵靶點輸入Metascape平臺進行KEGG途徑富集分析，識別關鍵靶點治療疾病的信號通路。并利用Omicshare平臺對KEGG富集分析結果構建可視化氣泡圖。

2 結果

2.1 “黃芪-丹參”藥對有效成分及作用靶點 見表1。利用TCMSP檢索“黃芪-丹參”活性化學成分，篩選出85個有效成分，其中黃芪相關化學成分20個，與丹參相關化學成分65個。85個有效成分對應1 239個作用靶點，其中與黃芪相關靶點308個，與丹參相關靶點931個。再借助Uniport數(shù)據(jù)庫將靶點轉化成已驗證的相應基因，去重和刪去無對應靶點后，獲得藥物靶點基因58個。

表1 “黃芪-丹參”有效活性成分表

2.2 “黃芪-丹參”和MI共同靶點

通過檢索MI疾病靶點共獲得3 677個，將MI靶點及“黃芪-丹參”藥物有效成分對應的基因輸入Venny2.1.0軟件，得出疾病和藥物活性化學成分共同靶點50個（見圖1）。

2.3 構建“藥物-有效成分-靶點-疾病”相互作用網(wǎng)絡

利用Cytocsape3.7.1軟件構建“藥物-有效成分-靶點-疾病”相互作用網(wǎng)絡，網(wǎng)絡中有211個節(jié)點（node）和1 156條邊，節(jié)點大小與節(jié)點度值成正比。六邊形為活性化合物成分，圓形為藥物，菱形為藥物—疾病共同靶點，余為疾?。ㄒ妶D2）。

2.4 “黃芪-丹參”治療MI蛋白相互作用網(wǎng)絡構建和篩選關鍵靶點

2.4.1 “黃芪-丹參”治療MI蛋白相互作用網(wǎng)絡構建利用BisoGenetfen分別構建疾病和藥物的蛋白質互作（PPI）網(wǎng)絡，心肌梗死潛在靶點通過251 771種直接或間接關系與14 814個靶點產(chǎn)生作用，“黃芪-丹參”潛在靶點通過76 382種直接或者間接關系與3 031個靶點產(chǎn)生作用。二者交集網(wǎng)絡見圖3，交集網(wǎng)絡共有3 023個靶點，交集網(wǎng)絡靶點的網(wǎng)絡拓撲學分析得出靶點自由度值的中位數(shù)為30。

2.4.2 篩選關鍵靶點 首次篩選出大于自由度中位數(shù)2倍的“Big hubs”節(jié)點［9］，然后依據(jù)“Big hubs”節(jié)點的幾個屬性值（具體篩選策略見圖4）篩選出一個具有9 505條邊，251個關鍵靶點的PPI網(wǎng)絡圖（圖5），“黃芪-丹參”治療MI可能就是通過這些關鍵靶點發(fā)揮治療作用的。

2.5 富集分析

借助Omicshare平臺，對251個關鍵靶點進行GO富集分析。并以P＜0.05作為差異統(tǒng)計的篩選條件。發(fā)現(xiàn)細胞氮化合物、細胞蛋白質、細胞芳香化合物、細胞大分子的細胞代謝過程及基因表達調控等介導生物過程；通過DNA結合、泛素蛋白連接酶結合、酶結合、核糖體的結構成分、轉錄因子結合、蛋白質結合等介導分子功能；通過細胞外泌體、細胞器、核質、細胞內(nèi)膜結合細胞器等介導細胞成分（如圖6）；借助Metascape平臺，對篩選出的251個關鍵靶點進行KEGG通路富集分析。并以P＜0.05作為差異統(tǒng)計的篩選條件，選取Log10（P）值排名前20的信號通路，并利用Omicshare平臺對KEGG富集分析結果進行可視化氣泡圖處理（如圖7）氣泡顏色由藍色到紅色代表Log10（P）值從小到大，橫軸代表通路上的關鍵節(jié)點數(shù)量占核心靶點的比值。

3 討 論

中醫(yī)藥對MI相關描述最早記載可追溯于《黃帝內(nèi)經(jīng)》。病機的梳理在《張氏醫(yī)通·諸血門》記載“蓋氣與血，兩相維附。氣不得血，則散而無統(tǒng)；血不得氣，則凝而不流”。又如中醫(yī)理論，“氣為血之帥，血為氣之母”，均闡明了氣血互根互用，相輔相成的關系，即氣虛則可致血瘀，治療應予補氣活血。且在臨床實驗發(fā)現(xiàn)，益氣活血療法能夠明顯升高心肌梗死患者心臟射血功能、減輕中醫(yī)癥候、改善MI預后和提高患者生活質量［10-11］。在中藥學研究中，黃芪-丹參是治療MI的重要藥對，且被證明具有廣泛的心血管藥理作用。黃芪提取物可預防缺血性和缺氧性的心肌細胞損傷，增強心肌收縮力，改善心臟舒張功能障礙，減輕血管內(nèi)皮功能障礙，并促進血管生成等。丹參藥理作用包括抗氧化、抗炎、內(nèi)皮保護、心肌保護，抗凝和抗動脈粥樣硬化，以及有助于減少血管平滑肌細胞的增殖和遷移等［6，12］。

3.1 藥物活性成分分析

MI是一種心肌細胞進展性死亡的疾病，其死亡方式包括壞死、凋亡、自噬等。冠狀動脈廣泛的炎癥風暴和高含量的活性氧（ROS）是疾病發(fā)生、發(fā)展和預后的關鍵因素。通過“藥物-有效成分-靶點-疾病”的可視化網(wǎng)絡發(fā)現(xiàn)黃芪-丹參治療MI的核心成分可能為山柰酚、木樨草酸、丹參酮ⅡA等。山柰酚和木樨草酸分別屬于黃芪和丹參的活性成分之一，且均屬于黃酮類［13］。兩者在抑制與凋亡相關蛋白的表達、抗氧化、抗炎、調節(jié)自噬通量等方面具有積極的作用。此外兩者均可通過減少肌酸激酶和乳酸脫氫酶等心臟損傷標記物的釋放，衰減MI誘導的心臟損傷，改善MI后的心臟功能［14］。丹參酮ⅡA屬于丹參親脂性活性成分之一，具有多種生物學效應。研究表明丹參酮ⅡA能夠通過提高心臟射血分數(shù)、減少左室收縮末期容積，改善MI患者的心功能［15］。另外，丹參酮ⅡA也可通過激活JAK2/STAT3信號通路和減少細胞凋亡，保護心肌細胞免受缺血再灌注的損傷［16］，具體機制包括降低炎性因子水平、抑制血小板聚集、減少ROS的產(chǎn)生等。不僅如此，丹參酮ⅡA還能夠顯著抑制慢性缺氧誘導的細胞色素C釋放、線粒體膜電位去極化和促凋亡蛋白的表達，抑制缺氧誘導的細胞凋亡等［17］。

3.2 關鍵靶點的確定

經(jīng)過PPI篩選，共獲得251個關鍵靶點，包括淀粉樣前體蛋白、雌激素受體α、腫瘤蛋白53等。實驗研究證實，心臟中的淀粉樣蛋白過度積累可激活線粒體凋亡途徑，最終導致心肌細胞凋亡［18］。雌激素受體是心臟保護的潛在藥理靶點，雌激素受體α是其亞型之一，廣泛地分布于心血管系統(tǒng)中。此外，還具有抗炎、抗凋亡、保護內(nèi)皮細胞和心臟的作用，因此被認為是治療MI的潛在靶點［19］。MI后的脆弱心肌可誘導心臟破裂，過度的炎癥和細胞凋亡是MI后形成脆弱心肌的主要危險因素，而P53是炎癥和凋亡的激活因子，因此下調P53的表達可抑制炎癥和細胞凋亡，從而預防MI誘導的心臟破裂［20］。

3.3 通路和生物學過程分析

本研究通過富集分析，發(fā)現(xiàn)了黃芪-丹參治療MI的主要途徑：包括泛素介導的蛋白水解途徑、MAPK信號通路、甲狀腺激素信號通路、缺氧誘導因子-1信號通路、轉化生長因子β信號通路、P3信號通路等。泛素介導的蛋白水解途徑，是降解某些異常細胞內(nèi)蛋白的主要途徑。在參與清除與炎癥調節(jié)、細胞增殖和分化、信號轉導、細胞凋亡和DNA修復以及其他生物學功能的受損蛋白質方面發(fā)揮著重要作用。且已被證實參與心血管疾病的發(fā)展和心室重構［21］。促分裂原活化蛋白激酶途徑是一個重要的信號傳導級聯(lián)，通過抑制P38 Mapk的磷酸化，可減少氧化應激和炎性因子的產(chǎn)生，進而改善MI之后的心室重構和心肌細胞收縮功能障礙［22］。甲狀腺激素信號通路可通過減少梗死疤痕面積改善心臟功能，并防止MI向心力衰竭發(fā)展，這種有益效應歸因于其增加毛細血管的形成、防止心肌細胞死亡、挽救線粒體生物發(fā)生和功能等［23］。缺氧誘導因子-1在缺氧條件下協(xié)調凋亡與自噬的平衡狀態(tài)，以維持缺氧細胞的存活［24］。轉化生長因子β信號通路參與MI中的多種信號級聯(lián)通路的調節(jié)，如在梗死的心臟中，通過轉化生長因子β/Smad信號通路抑制MI大鼠心肌纖維化，逆轉心臟的不良重塑，改善心功能［25］。

綜上所述，在這項研究中，我們通過網(wǎng)絡藥理學探討了一系列“黃芪-丹參”治療MI的有效成分、作用靶點及關鍵通路。課題組將在本研究基礎上，開展動物、細胞實驗加以驗證靶點；同時會深入開展對“中藥藥對”之間協(xié)同/拮抗作用的研究。