尚麗娜，熊學(xué)艷，蔣益，戴標(biāo)，王春來，毛旭華

(1.寧夏吳忠市人民醫(yī)院兒科，寧夏吳忠 751100；2.銀川市婦幼保健院普兒科，銀川 750000；3.江蘇大學(xué)附屬宜興醫(yī)院 a.兒科，b.體檢中心，c.檢驗科，江蘇無錫 214200)

發(fā)育性癲癇性腦病9型(developmental and epileptic encephalopathy-9，DEE9)是一種以認(rèn)知功能障礙、發(fā)育遲緩、精神異常為特征的早發(fā)性癲癇癥。該疾病與位于Xq22染色體上的原鈣黏蛋白19(Protocadherin 19, PCDH19)密切相關(guān)，PCDH19基因可以編碼鈣依賴性細(xì)胞黏附蛋白——PCDH19[1]，該蛋白質(zhì)主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞增殖、細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移以及突觸傳遞?；螯c突變或基因片段缺失、插入、重復(fù)等致病變異形式均可能會導(dǎo)致PCDH19基因功能異常。PCDH19基因突變被認(rèn)為是DEE9的主要誘因。在DEE9患者中，攜帶PCDH19基因突變的雜合子女性發(fā)病，攜帶此突變的半合子男性不發(fā)病，但含有2種不同遺傳特征細(xì)胞群的嵌合體男性發(fā)生PCDH19基因突變時，會出現(xiàn)DEE9疾病癥狀[2]。本研究擬調(diào)查一DEE9家系的基因型，對患兒及其父母外周血進(jìn)行外顯子組高通量測序，確定患兒遺傳學(xué)病因，以期提高臨床醫(yī)師對DEE9的認(rèn)識。

1 對象與方法

1.1研究對象 患兒女性，3歲5個月，主因“半天內(nèi)抽搐4次”于2021年10月入住銀川市婦幼保健院兒科?；純喝朐呵鞍胩鞜o明顯誘因出現(xiàn)抽搐，表現(xiàn)為意識喪失，呼之不應(yīng)，雙眼凝視、口吐白沫，雙手握拳，四肢抖動持續(xù)10余秒抽搐自行緩解，無大小便失禁，無發(fā)熱及頭痛。追問病史，患兒1歲5月齡有無熱驚厥病史，腦電圖異常，經(jīng)口服左乙拉西坦口服液1.5 mL/次，2次/日抗癲癇治療，服藥1年后無發(fā)作故而自行停藥。出生史無異常，父母體健，否認(rèn)近親婚配及家族遺傳性疾病。

入院體格檢查T：36.8 ℃，P：90次/分，R：20次/分，神志清楚，咽部充血，雙側(cè)扁桃體1度腫大。雙肺呼吸音清晰，未聞及干濕性啰音。心率90次，心律齊，未聞及病理性雜音。腹部無異常。生理反射存在，病理反射未引出，四肢肌力正常。入院后輔助檢查血常規(guī)：血細(xì)胞計數(shù)8.82×109/L，紅細(xì)胞4.49×1012/L，血紅蛋白128 g/L，血小板247×109/L，淋巴細(xì)胞百分比20.3%，中性粒細(xì)胞百分比74.7%。C-反應(yīng)蛋白0.29 mg/L，肌鈣蛋白6.45 pg/mL。血糖、肝腎功、電解質(zhì)、血氣均正常。腦脊液常規(guī)及生化無異常。顱腦核磁示：右側(cè)額葉近中線處及右側(cè)頂枕葉交界處皮層下DWI異常信號影，不除外缺血缺氧后遺改變。監(jiān)測腦電圖：幼兒期異常腦電監(jiān)測，檢測中1次強(qiáng)直-陣攣發(fā)作。

入院后給予苯巴比妥鈉，咪達(dá)唑侖鎮(zhèn)靜治療，吸氧甘露醇降顱壓，患兒仍有反復(fù)抽搐。結(jié)合腦電圖結(jié)果，抗癲癇治療的左乙拉西坦口服液調(diào)整劑量3 mL/次，2次/日，抽搐次數(shù)減少。根據(jù)患兒臨床特征及輔助檢查高度懷疑遺傳學(xué)疾病可能。為進(jìn)一步明確診斷，經(jīng)家長同意抽取患兒及父母外周血2 mL進(jìn)行全外顯子基因測序(委托北京邁基諾基因科技股份有限公司檢測)。

1.2方法

1.2.1試劑與儀器 Blood Genomic DNA提取試劑盒(加拿大Norgen Biotek公司)，快速高保真DNA聚合酶(北京索萊寶公司)，DNA凝膠回收試劑盒(南京諾唯贊公司)，Sanger測序試劑盒(美國ThermoFisher公司)。NanoDrop One超微量紫外分光光度計(美國Thermo Fisher公司)，GTC96S梯度PCR基因擴(kuò)增儀、CSL-RVMSCHOICE一體式核酸電泳儀(英國Cleaver Scientific公司)，ABI 3730XL自動測序儀(美國ABI 公司)，Illumina MiSeq測序系統(tǒng)(美國Illumina公司)。

1.2.2樣本收集及DNA抽提 用EDTA-K2抗凝血常規(guī)真空管采集患兒及其父母外周血樣本2 mL,置于-80 ℃保存。按照Blood Genomic DNA提取試劑盒說明書提取外周血DNA，產(chǎn)物用NanoDrop One超微量紫外分光光度計進(jìn)行質(zhì)量及純度檢測，取吸光度(A260 nm/A280 nm)值為1.7～1.8的DNA樣本進(jìn)行后續(xù)試驗，樣本置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3全外顯子基因檢測突變位點 患兒及其父母外周血的全外顯子基因檢測按照參考文獻(xiàn)[3]，由北京邁基諾基因科技股份有限公司完成，該公司利用自主研發(fā)的GenCap?全外顯子基因捕獲技術(shù)結(jié)合Illumina MiSeq測序系統(tǒng)(美國Illumina公司)對目標(biāo)區(qū)域內(nèi)的23 000種基因進(jìn)行檢測，序列讀數(shù)與GRCh37/hg19人類基因組組裝比對。為保證數(shù)據(jù)分析的精確性，利用蛋白質(zhì)功能預(yù)測軟件REVEL(Rare Exome Variant Ensemble Learner)[4]對變異位點進(jìn)行注釋解讀，按照突變形式、人群頻率、遺傳方式等指標(biāo)對數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，選擇與表型相關(guān)的致病位點進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2.4Sanger測序驗證突變位點 對患兒及其父母基因組運用Sanger測序進(jìn)一步驗證全外顯子測序所獲得的致病位點，引物序列使用在線軟件Primer 6.0設(shè)計，并由上海擎科生物科技有限公司合成。序列覆蓋PCDH19基因(NC_000023.10)第1號外顯子中待驗證的致病位點及其側(cè)翼序列(PCDH19F：5′-CAAGGTGACCGACTCCAAT-3′，PCDH19R：5′-CGCCTATCTGCTCTCTGTGT-3′)。使用快速高保真DNA聚合酶對目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為50 μL，包括：ddH2O 40 μL，10×PCR mix 5 μL，PCDH19F 1 μL，PCDH19R 1 μL，dNTP 1 μL，DNA模板1 μL，高保真酶1 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)35次；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后用DNA凝膠回收試劑盒純化，利用Sanger測序試劑盒進(jìn)行測序反應(yīng)，使用ABI 3730XL自動測序儀進(jìn)行測序驗證。

2 結(jié)果

2.1先證者及其父母的PCDH19基因突變檢測結(jié)果 全外顯子組測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，患兒基因PCDH19(NM_001184880)在1號外顯子處存在c.851_852dupGC變異，且為雜合型，即在基因CDS序列中，第851和852位置處的核苷酸序列GC發(fā)生了重復(fù)性插入(圖1)?；純焊改肝窗l(fā)生該突變。

注：Reference，參考序列；A，先證者測序結(jié)果；B，先證者父親測序結(jié)果及反向互補(bǔ)序列；C，先證者母親測序結(jié)果；紅色箭頭，GC插入突變。

2.2蛋白質(zhì)翻譯預(yù)測結(jié)果 運用DNAMAN軟件對序列進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述二核苷酸插入導(dǎo)致該基因編碼的蛋白質(zhì)發(fā)生移碼突變，破壞了第284位氨基酸后的讀碼框，使第285位氨基酸由T變?yōu)锳，且在第305位處獲得一終止密碼子，從而使該蛋白質(zhì)翻譯提前終止(圖2)。根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(ACMG)指南[5]，該變異初步判定為致病性變異(Pathogenic)：該變異為零效變異(移碼突變)，可能導(dǎo)致基因功能喪失(極強(qiáng)致病性證據(jù)PVS1)。經(jīng)家系驗證分析，患兒父親該位點無變異，患兒母親該位點無變異，此變異為自發(fā)突變(強(qiáng)致病性證據(jù)PS2)。該突變形式在正常人群頻率1 000 genomes(千人基因組)、ESP6500(NHLBI Exome Sequencing Project)、EXAC(The Exome Aggregation Consortium)和 EXAC-EAS(EXAC約 4000東亞人數(shù)據(jù))數(shù)據(jù)庫中未見報道(中等致病性證據(jù)PM2)。經(jīng)公共數(shù)據(jù)庫查詢，基因PCDH19(OMIM：300460)的突變可導(dǎo)致患者發(fā)生X染色體相關(guān)的DEE9(OMIM：300088)，該疾病特征與本案例先證者表型相符，但突變類型不一樣。Sanger測序驗證結(jié)果證實，受檢者PCDH19基因發(fā)生c.851_852dupGC雜合突變，父親和母親均未發(fā)生突變，突變類型屬于從頭突變，該家系圖譜見圖3。

圖3 該例DEE9患兒的家系圖譜

3 討論

DEE9又稱限于女性的癲癇伴智力低下病癥(epilepsy with mental retardation limited to females，EFMR)[6]，是一種嚴(yán)重的神經(jīng)發(fā)育障礙疾病，主要由Xq22染色體上PCDH19基因突變導(dǎo)致其編碼的PCDH19蛋白在神經(jīng)元連接、突觸膜信號傳遞等生物過程中的作用失調(diào)而致病[7]。PCDH19主要在海馬和大腦皮層的Ⅱ/Ⅲ層和Ⅴ層表達(dá)，也會與N-鈣黏蛋白相互作用，影響突觸可塑性[8]。DEE9的主要臨床特征包括：嬰幼兒時期發(fā)病、局灶性癲癇發(fā)作、失張力癲癇發(fā)作、智力缺陷、全面發(fā)育遲緩、全面性強(qiáng)直-陣攣發(fā)作、失神發(fā)作、全身性肌陣攣發(fā)作、發(fā)育倒退，其他臨床特征還包括自閉癥、精神異常。該病癥嚴(yán)重影響患兒的身心健康，同時會給患者家庭帶來較大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

PCDH19基因有6個外顯子，其編碼的PCDH19包括信號肽、6個保守鈣黏蛋白重復(fù)序列組成的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)域和細(xì)胞內(nèi)C末端結(jié)構(gòu)域。至今為止至少發(fā)現(xiàn)約有160多種PCDH19突變類型，包括堿基缺失或插入、剪切位點突變、無義突變、錯義突變等，大多數(shù)的突變發(fā)生在第1個外顯子，以新生突變?yōu)橹鳌；蛲蛔冃问接衏.812G>A(p.Gly271Asp)[9]、c.1508_1509 insT(p.Thr504Hisfs Ter19)[10]等，這些突變形式都可能導(dǎo)致PCDH19功能異常。但不是所有的PCDH19基因突變都會導(dǎo)致DEE9，還可能引起睡眠障礙等疾病[11]。PCDH19基因突變形式與疾病的相關(guān)性需要臨床醫(yī)生結(jié)合受檢者的臨床表現(xiàn)、家族史及其他檢測結(jié)果進(jìn)行綜合分析。Depienne等[12]于2009 年報道了1 例男性DEE9患者存在PCDH19基因缺失的體細(xì)胞嵌合突變，患者外周血白細(xì)胞中整個PCDH19基因缺失，但在患者部分皮膚成纖維細(xì)胞中存在PCDH19等位基因，該發(fā)現(xiàn)提示了一種致病機(jī)理：PCDH19基因突變需要2個細(xì)胞群(突變體和野生型)才能發(fā)生疾病，而同質(zhì)細(xì)胞群(無論是突變體還是野生型)都不會導(dǎo)致疾病。PCDH19基因突變與X染色體遺傳疾病發(fā)育性癲癇性腦病密切相關(guān)，臨床醫(yī)師應(yīng)了解PCDH19基因的不同突變形式，提高對DEE9的認(rèn)識。

在本研究中，對先證者及其父母進(jìn)行全外顯子組測序，結(jié)果表明先證者的PCDH19基因在1號外顯子處存在c.851_852dupGC二核苷酸重復(fù)插入雜合突變，經(jīng)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，PCDH19基因編碼區(qū)第851～852位的核苷酸GC發(fā)生重復(fù)插入，該異常插入使得蛋白質(zhì)翻譯發(fā)生移碼突變而提前終止于305位氨基酸處。PCDH19基因的第1個外顯子編碼PCDH19蛋白的細(xì)胞外重復(fù)序列[13]，該結(jié)構(gòu)主要介導(dǎo)細(xì)胞之間的黏附作用及信號傳導(dǎo)功能，蛋白質(zhì)翻譯的提前終止嚴(yán)重影響其正常生理功能。Lamers等[14]通過監(jiān)測DEE9小鼠模型中大腦皮質(zhì)活動的電生理學(xué)表征，發(fā)現(xiàn)成年早期缺失PCDH19會導(dǎo)致疾病發(fā)作。該患兒出生后就有癲癇反復(fù)發(fā)作、驚厥、腦電監(jiān)測異?，F(xiàn)象，癥狀與DEE9相一致。由于PCDH19突變所致的DEE9為X染色體相關(guān)的遺傳疾病，PCDH19基因突變已被認(rèn)為是DEE9的主要發(fā)病原因[15]，當(dāng)表達(dá)野生型PCDH19的神經(jīng)元和表達(dá)突變型PCDH19的神經(jīng)元共存，或根本不表達(dá)，會破壞同質(zhì)細(xì)胞群之間的黏附作用，擾亂細(xì)胞通訊，導(dǎo)致疾病發(fā)作[16]。高通量外顯子測序及Sanger測序證實本研究的先證者是致病雜合突變型，但患兒的父母未發(fā)生突變。先證者的PCDH19基因在1號外顯子發(fā)生c.851_852dupGC p.T285Afs*21從頭突變，是DEE9的一種新型突變方式。

隨著DEE9患者的數(shù)量不斷增加，PCDH19基因的突變形式不斷被發(fā)現(xiàn)，但對該基因突變導(dǎo)致這種綜合征的詳細(xì)分子機(jī)制知之甚少。本次研究中，筆者分析了患者的測序數(shù)據(jù)，后續(xù)可進(jìn)一步通過分子細(xì)胞實驗評估該P(yáng)CDH19突變形式對神經(jīng)元細(xì)胞的影響，進(jìn)而明確該突變形式的具體致病分子機(jī)制。綜上所述，本研究擴(kuò)展了PCDH19關(guān)于DEE9疾病的突變形式，為遺傳咨詢、預(yù)后檢測和產(chǎn)前診斷提供了有力支持。