秦建品，許詣，沈文婷，趙夢

(湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院，襄陽市中心醫(yī)院兒科，湖北襄陽 441021)

支氣管哮喘發(fā)病率呈逐年上升趨勢，目前其具體的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，闡明支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制對(duì)改善其預(yù)后具有重要意義[1]。研究表明，微小RNA(microRNAs，miRNAs)通過調(diào)控靶基因，參與支氣管哮喘的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸，并證實(shí)miR-155、miR-21與哮喘發(fā)生密切相關(guān)[2]。miR-21可通過調(diào)控靶基因活化轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)/ Smad信號(hào)通路，促進(jìn)哮喘小鼠的氣道重塑[3]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)在支氣管哮喘中呈異常表達(dá)，且與炎癥因子水平有關(guān)，并可用于診斷支氣管哮喘[4]。新近研究顯示，在嚴(yán)重哮喘中癌癥易感候選基因7(cancer susceptibility candidate 7，CASC7)通過靶向miR-21，抑制磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號(hào)通路，增加皮質(zhì)類固醇的敏感性[5]。目前miR-21、LncRNACASC7在支氣管哮喘急性發(fā)作期患兒外周血中的水平變化與病情嚴(yán)重程度以及對(duì)疾病診斷價(jià)值尚無明確研究。本研究旨在檢測支氣管哮喘急性發(fā)作期、緩解期患兒外周血LncRNACASC7、miR-21的表達(dá)水平并研究其臨床價(jià)值。

1 研究對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 選擇2020年6月至2021年10月在襄陽市中心醫(yī)院收治的115例支氣管哮喘急性發(fā)作期患兒作為急性發(fā)作期組，其中男61例，女54例，年齡(5.8±1.7)歲，根據(jù)支氣管哮喘防治指南[6]將患兒分為輕度組45例，中度組39例，重度組31例。支氣管哮喘緩解期患兒97例作為緩解期組，其中男50例，女47例，年齡(6.2±1.9)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合急性發(fā)作期與緩解期支氣管哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；(2)年齡小于14歲。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并肺結(jié)核、支氣管擴(kuò)張、心源性哮喘等其他呼吸系統(tǒng)疾病患者；(2)呼吸道、肺部以外的其他器官感染；(3)1個(gè)月內(nèi)服用糖皮質(zhì)激素或1周內(nèi)使用支氣管擴(kuò)張劑。另選擇體檢健康兒童(無哮喘史)100例作為健康人對(duì)照組，其中男55例，女45例，年齡(5.7±1.8)歲。本研究經(jīng)襄陽市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(No.XY-2020-1729)，患者及家屬知情同意。

1.2主要試劑與儀器 CFX96熒光定量PCR儀、Microfugr 20R高速冷凍離心機(jī)(美國Bio-Rad公司)，MR-96A酶聯(lián)免疫檢測儀(武漢科爾達(dá)醫(yī)療科技公司)，PA-600免疫比濁儀(深圳普門科技股份有限公司)，肺功能TAED檢測儀(美國通用電氣公司)，NanoDrop OneC型超微量紫外分光光度計(jì)(賽默飛世爾科技有限公司)。Trizol試劑(上海碧云天生物科技有限公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptRTReagent Kit、SYBR Green熒光定量PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)，TNF-α、IL-6酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(北京全式金公司)，超敏C反應(yīng)蛋白(hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3研究方法

1.3.1標(biāo)本采集 采集急性發(fā)作期組、緩解期組患兒入院第1天時(shí)(健康兒童于體檢當(dāng)日采集)的空腹外周血10 mL，置于肝素鈉抗凝管中。取5 mL于4 ℃、3 000 r/min離心10 min，收集血清樣本，置于-80 ℃保存。另取5 mL外周血，用于分離單個(gè)核細(xì)胞，置于-80 ℃保存。

1.3.2RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 取上述各組的外周血標(biāo)本，用Trizol試劑提取外周血單個(gè)核細(xì)胞中的總RNA，采用NanoDrop OneC型超微量紫外分光光度計(jì)檢測并收集吸光度(A260 nm/A280 nm)值為1.8～2.0的樣本，將濃度定量為0.5 μg/μL，用于后續(xù)試驗(yàn)。按照PrimeScriptRTReagent Kit說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，cDNA樣本置于-20 ℃保存。

1.3.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測LncRNACASC7、miR-21的表達(dá) 采用基于TB Green染料RT-qPCR法檢測血清樣本中LncRNACASC7、miR-21的表達(dá)水平，引物序列見表1，并由上海生工生物工程有限公司合成。按照SYBR Green熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，RT-qPCR反應(yīng)體系為20 μL，包括TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，正、反向引物(10 μmol/L)各0.8 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH、U6為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計(jì)算LncRNACASC7和miR-21相對(duì)表達(dá)量，公式:ΔΔCt=[(實(shí)驗(yàn)組Ct目的基因-實(shí)驗(yàn)組Ct內(nèi)參基因)-(對(duì)照組Ct目的基因-對(duì)照組Ct內(nèi)參基因)]。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

表1 RT-qPCR引物序列

1.3.4hs-CRP檢測 取外周血2 mL置于EDTA-K2抗凝管中，送至本院檢驗(yàn)科，按照普門PA-600免疫比濁儀及hs-CRP檢測試劑盒說明書檢測hs-CRP的表達(dá)水平，參考區(qū)間：0.68～0.88 mg/L。

1.3.5ELISA法檢測血清IL-6、TNF-α水平 取凍存的血清樣本200 μL，恢復(fù)至室溫，按照TNF-α、IL-6酶聯(lián)免疫吸附試劑盒說明書進(jìn)行檢測。通過NanoDrop OneC型超微量紫外分光光度計(jì)檢測樣本A450 nm值，并計(jì)算樣本濃度。IL-6參考區(qū)間：370～460 ng/L；TNF-α參考區(qū)間：0.74～1.54 ng/mL。

1.3.6肺功能指標(biāo)檢測 所有研究對(duì)象均在呼吸內(nèi)科檢測以下肺功能評(píng)價(jià)指標(biāo)，包括第1秒用力呼氣容積(forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1)、用力肺活量(forced vital capacity，F(xiàn)VC)、最大呼吸峰流速(peak expiratory flow rate，PEF)[8]，測量3次，取其均值。FEV1參考區(qū)間：>4.26 L，F(xiàn)VC參考區(qū)間：>4.13 L，PEF參考區(qū)間：450～600 L/min。

2 結(jié)果

2.13組觀察對(duì)象一般資料、炎癥因子及肺功能指標(biāo)的比較 健康人對(duì)照組、緩解期組、急性發(fā)作期組患兒之間的年齡、性別、哮喘家族史比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但血清炎癥因子hs-CRP、TNF-α、IL-6的表達(dá)水平依次升高(P<0.05)，而肺功能指標(biāo)FEV1、FVC、PEF的表達(dá)水平依次降低(P<0.05)。與健康人對(duì)照組比較，急性發(fā)作期組、緩解期組患兒外周血LncRNACASC7的表達(dá)水平降低，而miR-21的表達(dá)水平升高(P<0.05)；與緩解期組比較，急性發(fā)作期組患兒外周血LncRNACASC7的表達(dá)水平降低，而miR-21的表達(dá)水平升高(P<0.05)，見表2。

2.2急性發(fā)作期不同嚴(yán)重程度哮喘患兒外周血LncRNACASC7、miR-21表達(dá)水平的比較 輕度組、中度組、重度組哮喘患者外周血LncRNACASC7的表達(dá)水平依次降低，而miR-21的表達(dá)水平依次升高(P<0.05)，見表3。

表3 急性發(fā)作期不同嚴(yán)重程度哮喘患兒外周血LncRNA CASC7、miR-21表達(dá)水平的比較

2.3支氣管哮喘急性發(fā)作期患兒外周血LncRNACASC7、miR-21的表達(dá)與炎癥因子和肺功能指標(biāo)的相關(guān)性 相關(guān)性分析顯示，支氣管哮喘急性發(fā)作期患兒外周血LncRNACASC7與miR-21的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.568，P<0.05)。支氣管哮喘急性發(fā)作期患兒外周血LncRNACASC7與hs-CRP、TNF-α、IL-6水平呈負(fù)相關(guān)，而與FEV1、FVC、PEF呈正相關(guān)(P<0.05)；miR-21與hs-CRP、TNF-α、IL-6水平呈正相關(guān)，而與FEV1、FVC、PEF呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，見表4。

表4 支氣管哮喘急性發(fā)作期患兒外周血LncRNA CASC7、miR-21的表達(dá)與炎癥因子和肺功能指標(biāo)的相關(guān)性

2.4LncRNACASC7、miR-21對(duì)支氣管哮喘急性發(fā)作期、緩解期患兒的鑒別診斷價(jià)值 將支氣管哮喘急性發(fā)作期患兒作為急性發(fā)作期組，緩解期患兒作為緩解期組，繪制ROC曲線。根據(jù)Youden指數(shù)最大原則，明確cut-off值，并計(jì)算ROC曲線下面積(AUCROC)、敏感性、特異性，評(píng)估LncRNACASC7、miR-21單獨(dú)及聯(lián)合檢測對(duì)支氣管哮喘急性發(fā)作期的診斷效能。結(jié)果顯示，外周血LncRNACASC7鑒別診斷支氣管哮喘急性發(fā)作期患兒的AUCROC為0.863(95%CI:0.809～0.906)，當(dāng)cut-off值為0.76時(shí)，其敏感性為78.26%，特異性82.47%。外周血miR-21鑒別診斷支氣管哮喘急性發(fā)作期患兒的AUCROC為0.922(95%CI:0.877～0.954)，當(dāng)cut-off值為2.14時(shí)，其敏感性為82.61%，特異性為83.51%。二者聯(lián)合檢測的AUCROC為0.955(95%CI:0.918～0.979)，敏感性為89.57%，特異性為88.66%，見圖1。

圖1 LncRNA CASC7、miR-21鑒別診斷支氣管哮喘急性發(fā)作期患兒的ROC曲線

3 討論

支氣管哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，研究證實(shí)，促炎癥反應(yīng)及抑炎癥反應(yīng)失衡導(dǎo)致氣道處于慢性炎癥狀態(tài)，引發(fā)氣道高反應(yīng)性而發(fā)生該疾病[9]。hs-CRP、TNF-α、IL-6與支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制及轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)，TNF-α還可促進(jìn)炎癥細(xì)胞浸潤，導(dǎo)致肺損傷及肺功能下降，而FEV1、FVC、PEF是反映肺功能的常見指標(biāo)[10]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)支氣管哮喘發(fā)病伴隨炎性因子分泌增加，以及肺功能異常，證實(shí)支氣管哮喘發(fā)病與炎癥反應(yīng)有關(guān)，并且隨著患兒病情加重，肺功能損傷嚴(yán)重。

LncRNACASC7能夠加強(qiáng)重癥哮喘患者對(duì)激素治療敏感性，其通過調(diào)控miR-98-5p/SIRT3軸，抑制氣道炎癥因子分泌，抑制支氣管平滑肌細(xì)胞增殖[11]。另有研究顯示，過表達(dá)LncRNACASC7可降低IL-1β、IL-6和TNF-α的水平[12]。本研究顯示，支氣管哮喘急性發(fā)作期患兒外周血LncRNACASC7表達(dá)水平降低，提示LncRNACASC7可能通過調(diào)控炎癥反應(yīng)，參與急性發(fā)作期哮喘的發(fā)生、發(fā)展[11-12]。最近有報(bào)道發(fā)現(xiàn)[13]，在肺結(jié)核外周血單核細(xì)胞中LncRNACASC7表達(dá)下調(diào)，且活動(dòng)性肺結(jié)核組LncRNACASC7高于非活動(dòng)性肺結(jié)核組。本研究結(jié)果表明，LncRNACASC7的表達(dá)水平隨病情加重而降低，且LncRNACASC7與炎癥因子、肺功能指標(biāo)具有相關(guān)性，提示外周血LncRNACASC7異常表達(dá)與病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)，推測由于LncRNACASC7水平受抑制，導(dǎo)致炎癥加重，最終表現(xiàn)為患兒病情嚴(yán)重程度加重。

miR-21在參與支氣管哮喘炎癥反應(yīng)、氣道重塑等方面發(fā)揮重要作用[14]。尚朋娟等[7]研究顯示，支氣管哮喘患兒血清中miR-21呈高表達(dá)，與TNF-α、IL-17、IL-6呈顯著正相關(guān)。本研究中，急性發(fā)作期組患兒外周血miR-21表達(dá)水平升高，與先前報(bào)道的結(jié)果類似。研究證實(shí)，抑制miR-21表達(dá)可抑制肺泡M2巨噬細(xì)胞的極化，降低TH2嗜酸性氣道炎癥，同時(shí)降低氣道反應(yīng)和氣道重塑過程[15]。本研究顯示，miR-21表達(dá)水平隨著病情加重而升高，與鄧穎云等[16]研究結(jié)果一致，且miR-21表達(dá)水平與炎癥因子、肺功能指標(biāo)存在明顯相關(guān)性，筆者推測miR-21與支氣管哮喘疾病發(fā)作期嚴(yán)重程度確有關(guān)系，病情越嚴(yán)重，其水平越高，分析原因可能是miR-21水平升高通過調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子分泌，加重氣道炎癥，以及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、氣道重塑有關(guān)。此外，LncRNACASC7與miR-21表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)性，提示LncRNA-CASC7可能通過調(diào)控miR-21表達(dá)，參與兒童支氣管哮喘的發(fā)生、發(fā)展。筆者進(jìn)一步繪制ROC曲線以評(píng)估LncRNACASC7、miR-21對(duì)支氣管哮喘急性發(fā)作期的鑒別診斷價(jià)值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者聯(lián)合鑒別診斷的AUCROC可增至0.955。

綜上所述，支氣管哮喘急性發(fā)作期患兒外周血中LncRNACASC7呈低表達(dá)，miR-21呈高表達(dá)，且與病情嚴(yán)重程度有關(guān)，二者聯(lián)合對(duì)支氣管哮喘急性發(fā)作期有一定的鑒別診斷價(jià)值。然而，外周血LncRNACASC7、miR-21的表達(dá)參與調(diào)控支氣管哮喘的具體調(diào)控機(jī)制尚未明確，今后需擴(kuò)大樣本量，并通過細(xì)胞試驗(yàn)等深入探究。