于莉，宋貴波，靳冰玉，干學(xué)東,邱雪平，王陳，程亞婷，鄭芳

(1.武漢大學(xué)中南醫(yī)院 a.基因診斷中心&檢驗科 b.心血管內(nèi)科，武漢 430071；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，昆明 650032)

擴張型心肌病(dilated cardiomyopathy, DCM)簡稱擴心病，是一種以心室(左室或雙室)收縮功能受損及心室擴張為主要特征的常見心肌病，其發(fā)病率約為1∶250～1∶2 500，可進展為心力衰竭，是世界范圍內(nèi)心臟移植最常見的適應(yīng)證[1]。研究表明，高達40%的患者由遺傳因素致病，除常見致病基因如肌聯(lián)蛋白基因(titin，TTN)、肌球蛋白重鏈基因(myosin heavy chain 7，MYH7)和核纖層蛋白A/C基因(lamin A/C，LMNA)等外，約有1%～2%的DCM患者與結(jié)蛋白(desmin，DES)基因突變有關(guān)[2-3]。DES基因編碼中間絲(intermediate filament, IF)蛋白質(zhì)中的結(jié)蛋白，其特異性表達于肌細胞，在心臟的生長發(fā)育中起重要作用，該基因突變后可能會影響中間絲正常的組裝、結(jié)構(gòu)及功能，從而誘發(fā)心肌病和骨骼肌病[3]。本研究擬通過全外顯子組測序、Sanger測序等方法鑒定1個新的致遺傳性擴張型心肌病的DES基因變異，以期為家系遺傳咨詢提供試驗依據(jù)。

1 資料和方法

1.1一般資料 先證者(Ⅱ-9)，男，52歲，曾于2013年至2021年在武漢大學(xué)中南醫(yī)院就診，臨床確診為擴張型心肌病，在39歲時因房室傳導(dǎo)阻滯行心臟起搏器植入術(shù)，目前已發(fā)展為心力衰竭，同時氣促伴雙下肢無力。該擴張型心肌病的家系圖譜見圖1。

注：*，采集過外周血標本的個體。

先證者自述其父親(Ⅰ-1)為健康人，89歲去世，且兄弟姐妹未曾出現(xiàn)相關(guān)表型，其母親(Ⅰ-2)在59歲時因心臟疾病去世，同時母親的妹妹也患有心臟疾病。該家系的另外4名成員(Ⅱ-1、Ⅱ-5、Ⅱ-11及Ⅲ-1)也被確診為擴張型心肌病伴房室傳導(dǎo)阻滯。Ⅱ-1個體于52歲去世，曾因房室傳導(dǎo)阻滯進行過2次心臟起搏器植入術(shù)。其余3名成員Ⅱ-5、Ⅱ-11及Ⅲ-1也都進行了心臟起搏器植入術(shù)，最終發(fā)展為心力衰竭需進行心臟移植治療。此外，Ⅲ-1個體發(fā)病早，26歲時就植入心臟起搏器，目前同樣出現(xiàn)氣促和下肢無力的情況。該家系患者的心電圖和超聲心動圖結(jié)果見表1。

表1 擴張型心肌病家系患者臨床資料

1.2方法

1.2.1主要儀器及試劑 普通PCR儀及核酸電泳儀(美國Bio-Rad公司)，ABI 3730s型DNA序列自動分析儀(美國ABI公司)，NanoDrop one超微量紫外分光光度計(美國Thermo Scientific公司)。PCR擴增試劑2×Taq Plus Master Mix(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)，外周血DNA提取試劑盒(Quick-DNA Miniprep Plus Kit，美國Zymo Research公司)。

1.2.2外周血采集及DNA提取 采集該家系成員就診時的靜脈血(EDTA-K2抗凝)2 mL，采集后立即按照外周血DNA提取試劑盒說明書提取DNA樣本。DNA樣本的純度和濃度用NanoDrop one超微量紫外分光光度計測定，選取純度(A260 nm/A280 nm為1.7～1.9，A260 nm/A230 nm≥2.0)及濃度較高的樣本，置于-20 ℃保存。

1.2.3全外顯子組測序及可疑致病基因篩選 全外顯子組測序委托深圳華大臨床檢驗中心進行，通過打斷DNA制備文庫，用Roche KAPA HyperExome探針捕獲和富集目標基因外顯子及鄰近剪切區(qū)，最后使用MGISEQ-2000測序平臺進行檢測，質(zhì)控為目標區(qū)域平均測序深度≥180×，其中目標區(qū)平均深度>20×的位點占比>95%。測序數(shù)據(jù)分析通過BWA(Burrows-Wheeler Aligner)軟件與UCSC數(shù)據(jù)庫提供的hg19版的人類參考基因組進行比對，去除重復(fù)。然后使用GATK(Genome Analysis Toolkit)工具包尋找變異。最后通過在多個人群和疾病數(shù)據(jù)庫(如千人數(shù)據(jù)庫、HGMD數(shù)據(jù)庫、ESP數(shù)據(jù)庫等)中比對、生物信息工具注釋，根據(jù)位點的數(shù)據(jù)庫頻率篩選可能的致病性位點，根據(jù)ACMG制定的變異分類標準與指南[4]評分進行變異致病性分類，即可得到與擴張型心肌病相關(guān)的可疑致病位點。最后篩選出符合先證者家系遺傳模式及發(fā)病特點的可疑致病基因突變位點進行Sanger測序及變異致病性分析驗證。

1.2.4Sanger測序驗證 針對上述分析獲得的可疑致病變異位點DESc.140G>T(p.Ser47Ile)，用在線引物設(shè)計工具NCBI Primer-BLAST設(shè)計突變位點的引物，并交由武漢擎科生物技術(shù)有限公司合成。引物序列涵蓋DES基因(NC_000002.12)的該變異位點。正向引物序列(5′→3′)：CCAGGCCTACTCGTCCAGC，反向引物序列(5′→3′)：CTCCTCCTCGTAGAGCTCGG，產(chǎn)物片段長度為469 bp，退火溫度為60 ℃。普通PCR擴增體系為20 μL，包括：2×Taq Plus Master Mix(Vazyme biotech，P211)10 μL，正、反向引物(濃度為10 μmol/L)各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 6 μL。循環(huán)參數(shù):95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，循環(huán)35次;72 ℃延伸10 min;4 ℃低溫保存。

PCR結(jié)束后，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳驗證擴增效果，將469 bp片段大小的擴增產(chǎn)物送至武漢擎科生物技術(shù)有限公司，用ABI 3730s型DNA序列自動分析儀直接測序分析。采用Chromas軟件讀取并比對測序結(jié)果以驗證突變位點序列。

1.2.5變異致病性分析 針對DESc.140G>T(p.Ser47Ile)變異位點，用在線工具UniProt、PolyPhen-2和Mutation taster對該位點的保守性和致病效應(yīng)進行確認。隨后用ANTHEPROT 6.9.3軟件分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)(親疏水性、抗原性等)的改變，并用PyMOL軟件對蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的影響進行分析。最后用PhosphoSitePlus數(shù)據(jù)庫(https://www.phosphosite.org/homeAction)對突變造成蛋白質(zhì)翻譯后修飾的改變進行預(yù)測。

2 結(jié)果

2.1全外顯子組測序分析 該家系的全外顯子組測序結(jié)果提示共存在十余種基因變異位點，其中與擴張型心肌病有關(guān)的基因有橋粒芯蛋白2基因(desmoglein 2，DSG2)、PRDM16基因(PR/SET domain 16，PRDM16)、DES基因。然而在該家系中與疾病共分離的只有DES基因突變，同時該突變的致病特點也符合該家系疾病的常染色體顯性遺傳模式(圖1)。故最終篩選出1個位于2號染色體DES基因的雜合錯義突變c.140G>T(p.Ser47Ile)。

2.2Sanger測序結(jié)果 先證者(Ⅱ-9)及家系其他已發(fā)病患者(Ⅱ-5、Ⅱ-9、Ⅱ-11、Ⅲ-1)DES基因第一外顯子均存在c.140G>T(p.Ser47Ile)的雜合突變。而健康的家系成員Ⅱ-3、Ⅱ-7、Ⅲ-3、Ⅲ-5、Ⅲ-8均為野生型(圖2)。

注：A，攜帶雜合突變成員的Sanger測序結(jié)果；B，健康個體的Sanger測序結(jié)果；紅色箭頭所指即為突變位點。

2.3變異位點致病性分析 生物信息學(xué)方法的驗證與預(yù)測結(jié)果顯示，在人、猩猩、小鼠、大鼠、牛等多個物種中該位點高度保守(圖3)；而PolyPhen-2和Mutation taster均提示該突變?yōu)橛泻ν蛔?圖4A)；該突變會造成蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的改變(圖4B)，蛋白質(zhì)疏水性增強和抗原性下降(圖4C)，蛋白質(zhì)內(nèi)部氫鍵缺失(圖4D)；該變色位點的絲氨酸是潛在的磷酸化位點，突變可能會影響蛋白質(zhì)磷酸化狀態(tài)的改變(圖4E)。故而該變異位點滿足PP3證據(jù)項(當(dāng)用多種生物信息學(xué)軟件進行預(yù)測時，均提示該突變有害)。此外，根據(jù)家系Sanger測序結(jié)果，該變異位點在家系中滿足共分離(PP1證據(jù)項)。該家系變異攜帶者的表型和家族史高度符合某種單基因遺傳疾病(PP4證據(jù)項)。

注：箭頭處為人結(jié)蛋白頭部第47位絲氨酸，顯示該位點在多種物種中高度保守。

該DCM家系的DES基因發(fā)生雜合錯義突變c.140G>T(p.Ser47Ile)，遺傳模式為常染色體顯性遺傳。在全外顯子組測序報告中，該變異位點被解讀為意義未明的變異(PM1：該變異位于熱點突變區(qū)域+PM2：在千人基因組、ESP數(shù)據(jù)庫和gnomAD數(shù)據(jù)庫中均未被收錄)。但當(dāng)對該家系的疾病共分離以及突變功能預(yù)測的生物信息學(xué)等情況進行分析后，發(fā)現(xiàn)該變異可升級為“可能致病的”變異(PM1+PM2+PP1+PP3+PP4)。

注：A，Mutation taster和Polyphen-2預(yù)測結(jié)果；B，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果，突變位點紅線標記，野生型(上)突變型(下)；C，理化性質(zhì)預(yù)測結(jié)果對比圖，突變位點紅線標記，野生型(左)突變型(右)，3條曲線依次代表疏水性、抗原性和親水性；D，蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測，白框部分顯示突變型第47位氨基酸氫鍵消失；E，PhosphoSitePlus數(shù)據(jù)庫中對人結(jié)蛋白潛在的磷酸化位點預(yù)測圖，箭頭處為突變位點。

3 討論

本研究涉及一遺傳性擴張型心肌病家系的基因診斷，該家系的致病突變DESc.140G>T(p.Ser47Ile)出現(xiàn)在染色體2q35上DES基因第一外顯子區(qū)域，導(dǎo)致第47位的絲氨酸被異亮氨酸取代，可能使蛋白質(zhì)的二、三級結(jié)構(gòu)以及蛋白質(zhì)的疏水性和抗原性等理化性質(zhì)發(fā)生改變，甚至可能影響蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)。

DES基因編碼一種特異性表達于肌細胞的Ⅲ型中間絲蛋白即結(jié)蛋白，對于維持心臟正常的結(jié)構(gòu)、傳導(dǎo)及心肌收縮等功能非常重要，同時也參與細胞器定位組裝、細胞機械應(yīng)力傳遞、細胞信號傳導(dǎo)等過程[3,5]。因此，當(dāng)DES基因發(fā)生突變，就可能導(dǎo)致結(jié)蛋白結(jié)構(gòu)及中間絲網(wǎng)絡(luò)的異常，影響上述生物過程的正常進行，最終導(dǎo)致心肌病和骨骼肌病，又稱為結(jié)蛋白相關(guān)肌病(desmin-related myopathies，DRM)[6]。

結(jié)蛋白的結(jié)構(gòu)分為兩側(cè)非螺旋的頭尾部及中間的螺旋桿狀區(qū)域，本研究涉及的突變發(fā)生在結(jié)蛋白的頭部結(jié)構(gòu)域，結(jié)蛋白的頭部結(jié)構(gòu)域參與自身的組裝過程，與尾部相互作用可以保護結(jié)蛋白的氨基末端免受蛋白酶的分解從而維持穩(wěn)定，同時由于在結(jié)蛋白頭部絲氨酸的數(shù)量占比超過1/5，故而存在多個潛在的磷酸化修飾位點,可參與蛋白質(zhì)翻譯后的修飾。而本研究報道的DESc.140G>T(p.Ser47Ile)突變使原來的絲氨酸被異亮氨酸取代，疏水性增強的同時或可改變結(jié)蛋白的磷酸化狀態(tài)。筆者發(fā)現(xiàn)的突變與其他報道的致病突變具有一定共性，如第6、7、12、13、28、46位絲氨酸同樣被預(yù)測為潛在的磷酸化位點[1,7]，其致病性突變也都是被疏水性氨基酸所取代，當(dāng)患者出現(xiàn)心臟表型時皆表現(xiàn)出DCM同時都伴有包括房室傳導(dǎo)阻滯(atrioventricular block，AVB)在內(nèi)的心律失常，且除心肌外其他肌肉癥狀較輕。此外，這些突變體的組織病理學(xué)結(jié)果較為相似，均顯示中間絲網(wǎng)絡(luò)的損壞、異常結(jié)蛋白胞漿內(nèi)聚集、線粒體和溶酶體結(jié)構(gòu)功能異常等，DESc.140G>T(p.Ser47Ile)突變導(dǎo)致該家系擴張型心肌病的病理機制可能與之相似。

DES基因突變的臨床表型與DCM常見的MYH7致病基因突變類似，均具有較大的異質(zhì)性[8]，可導(dǎo)致除DCM外的多種心肌病和(或)近遠端肌病，甚至影響面部、呼吸和消化功能等，推測DRM的異質(zhì)性可能與心肌骨骼肌結(jié)構(gòu)及再生能力的不同有關(guān)。而DES基因突變致心肌病的同時往往伴隨傳導(dǎo)阻滯等問題，考慮因結(jié)蛋白在浦肯野纖維中含量豐富[3]，突變會影響心臟正常的傳導(dǎo)功能。本研究中，患者發(fā)病年齡總體較對照提前，但幼年不發(fā)病，首先出現(xiàn)房室傳導(dǎo)阻滯，隨后發(fā)展為DCM伴Ⅲ°AVB，最終結(jié)局為心衰。如Ⅲ-1個體在26歲時就已植入心臟起搏器，而Ⅲ-7和Ⅳ-1個體雖攜帶DESc.140G>T(p.Ser47Ile)突變但目前尚未發(fā)病，考慮和年紀較小有關(guān)。此外，該家系部分成員隨年齡增長出現(xiàn)下肢無力的癥狀，但無法判斷是由心衰造成的還是突變導(dǎo)致的肌肉改變。

雖然已經(jīng)報道的DES致病性突變已有100多種，但DRM具體的致病機制尚不清晰。有研究認為DRM隨年齡進展的原因是肌細胞中間絲網(wǎng)絡(luò)受損，機械應(yīng)力損傷增加及線粒體功能的紊亂，而不是結(jié)蛋白的聚集[9]。本研究中該家系患者主要出現(xiàn)的是心臟表型，有1～2例心臟移植的患者，然而手術(shù)均是在外院完成難以獲得其心臟組織，故未能進行病理機制及組織病理學(xué)方面的驗證，這也是本研究的不足之處，后續(xù)可通過構(gòu)建細胞或動物模型對其機制進行深入研究。

本研究發(fā)現(xiàn)了DES基因的新突變c.140G>T(p.Ser47Ile)，在一定程度上豐富了DES基因突變譜，也為遺傳咨詢提供數(shù)據(jù)支持。由于該突變還伴有心臟的傳導(dǎo)阻滯，嚴重時有發(fā)生心臟驟停和猝死的風(fēng)險，如果能進行分子診斷將有助于臨床的早期確診，以及在癥狀出現(xiàn)前確定合適的預(yù)防和管理策略。