劉松南，田 旭，高 晶，蘭 韜，李 曼，李延梅，趙 焱，董曉倩,*，潘燦平

（1.北京食品科學(xué)研究院北京市茶葉質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站，北京 100162；2.中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，北京 100029；3.中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院，北京 100191；4.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，北京 100193）

特丁硫磷，又名特丁磷，是一種高效、廣譜有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑，主要用于防治土壤線蟲(chóng)和地下害蟲(chóng)[1]。特丁硫磷在動(dòng)物和植物體內(nèi)代謝生成特丁硫磷亞砜、特丁硫磷砜、特丁硫磷-OXON、特丁硫磷亞砜-OXON和特丁硫磷砜-OXON 5種代謝產(chǎn)物[2-3]。因特丁硫磷對(duì)人體存在潛在危害，很多國(guó)家都制定了嚴(yán)格的殘留限量。其中，歐盟規(guī)定特丁硫磷在食品中的最大殘留限量均為0.01 mg/kg，日本在“食品中農(nóng)業(yè)化學(xué)品殘留肯定列表制度”中規(guī)定茶葉中特丁硫磷最大殘留限量為0.005 mg/kg。在我國(guó)，農(nóng)業(yè)部第1586號(hào)公告明確規(guī)定禁止特丁硫磷在茶樹(shù)上使用，GB 2763—2021《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[4]中規(guī)定茶葉中特丁硫磷最大殘留限量（以特丁硫磷及其代謝物亞砜和砜之和計(jì)）為0.01 mg/kg，但是并未指定檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)。特丁硫磷有限量要求卻沒(méi)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法的情況導(dǎo)致了在監(jiān)管層面無(wú)法執(zhí)法。有研究表明某些特丁硫磷代謝產(chǎn)物具有更強(qiáng)的移動(dòng)性和環(huán)境持久性，如特丁硫磷砜和特丁硫磷亞砜在天然水和蒸餾水的半衰期分別為18～40 d和280～350 d，遠(yuǎn)長(zhǎng)于特丁硫磷天然水和蒸餾水中的半衰期（3～3.5 d）[5]。而特丁硫磷-OXON、特丁硫磷亞砜-OXON和特丁硫磷砜-OXON的毒理學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)較少，其環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)及對(duì)人類(lèi)危害程度尚不可知，因此更加需要加大對(duì)該3種代謝產(chǎn)物的研究和關(guān)注。

在現(xiàn)行有效的國(guó)家檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中，多數(shù)只針對(duì)特丁硫磷及其中1種或者2種代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)[6-8]，最新發(fā)布的GB 23200.121—2021《植物源性食品中331種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測(cè)定 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》[9]中也只檢測(cè)了特丁硫磷、特丁硫磷亞砜及特丁硫磷砜3種化合物。由于國(guó)內(nèi)外對(duì)特丁硫磷的代謝產(chǎn)物研究較少，特別是對(duì)特丁硫磷-OXON、特丁硫磷亞砜-OXON和特丁硫磷砜-OXON三種代謝產(chǎn)物的關(guān)注不夠，因此尚未有對(duì)這3種重要代謝產(chǎn)物的檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)。國(guó)內(nèi)外關(guān)于特丁硫磷及其代謝產(chǎn)物的檢測(cè)多數(shù)僅限于對(duì)特丁硫磷的檢測(cè)，檢測(cè)手段多為氣相色譜法、液相色譜法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10-13]。僅有少部分研究采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)了特丁硫磷、特丁硫磷亞砜及特丁硫磷砜。劉佳等[14]采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法同時(shí)檢測(cè)了果蔬中該3種化合物的殘留量，該方法提取后直接上機(jī)檢測(cè)，未對(duì)提取液進(jìn)行凈化，并不適用于茶葉這種復(fù)雜樣品基質(zhì)。陳泳等[15]的方法也只檢測(cè)了植物源性食品中特丁硫磷、砜及亞砜3種物質(zhì)。目前鮮見(jiàn)對(duì)特丁硫磷及其5種代謝產(chǎn)物同時(shí)檢測(cè)的研究報(bào)道。

快速濾過(guò)型凈化（multi-plug filtration cleanup，m-PFC）技術(shù)是根據(jù)固相萃取凈化原理，在QuEChERS凈化基礎(chǔ)上進(jìn)一步簡(jiǎn)化形成的一種快速新型的凈化手段。該技術(shù)是通過(guò)篩板將凈化劑預(yù)先固定于注射器中，然后將待凈化樣品提取液加入注射器中，通過(guò)單次或反復(fù)推拉注射器活塞即完成凈化過(guò)程，操作簡(jiǎn)便，凈化速度快，前處理效率高，目前已經(jīng)應(yīng)用于水果、蔬菜、茶葉等中農(nóng)藥的檢測(cè)[16-19]。

本實(shí)驗(yàn)擬結(jié)合m-PFC前處理技術(shù)，建立液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法同時(shí)檢測(cè)茶葉中特丁硫磷及其5種代謝產(chǎn)物殘留的方法，彌補(bǔ)現(xiàn)有方法的不足，以期更為準(zhǔn)確地評(píng)估茶葉中特丁硫磷及其代謝物總量的真實(shí)殘留水平，同時(shí)為研究特丁硫磷在茶葉上的代謝過(guò)程提供技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶葉（紅茶、綠茶、普洱茶） 市購(gòu)。

特丁硫磷、特丁硫磷亞砜、特丁硫磷砜標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（100 μg/mL） 天津阿爾塔科技有限公司；特丁硫磷-OXON、特丁硫磷亞砜-OXON、特丁硫磷砜-OXON（100 μg/mL） 德國(guó)Dr. Ehrensorfer公司。

乙腈、甲醇（均為色譜純） 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；甲酸、乙酸銨（均為色譜純） 美國(guó)Thermo Fisher公司；無(wú)水硫酸鎂、氯化鈉（均為分析純），30%過(guò)氧化氫溶液 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；N-丙基乙二胺（N-propylethylenediamine，PSA）（40～60 μm）、多壁碳納米管（multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs）（10～20 nm）、m-PFC凈化柱管 北京科德諾思技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)用水由Milli-Q純水機(jī)（0.22 μm過(guò)濾膜，美國(guó)Millipore公司）制得。

1.2 儀器與設(shè)備

TSQ Quantum Ultra EMR液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有電噴霧離子源（electrospray ion source，ESI）） 賽默飛世爾（中國(guó)）科技有限公司；AEL200分析天平（感量0.1 mg） 日本島津公司；JJ500電子天平（感量0.01 g） 常熟雙杰測(cè)試儀器廠；LD5-2B離心機(jī) 北京京立離心機(jī)有限公司；KDC-140HR離心機(jī)（配有2 mL轉(zhuǎn)頭） 安徽中科中佳公司；MVS-1渦旋混勻器 北京金紫光公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

空白基質(zhì)溶液：稱(chēng)取空白茶葉（經(jīng)測(cè)定不含待測(cè)農(nóng)藥）樣品進(jìn)行提取、m-PFC凈化，收集凈化液，于4 ℃冰箱冷藏保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液：準(zhǔn)確吸取質(zhì)量濃度為100 μg/mL的各標(biāo)準(zhǔn)溶液母液0.200 mL至10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，混勻，配制成質(zhì)量濃度為2.00 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液，4 ℃冰箱冷藏保存，有效期為1個(gè)月。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液0.005、0.025、0.050、0.250、0.50、1.00、2.50 mL分別置于10 mL容量瓶中，用50%乙腈溶液定容，配制為質(zhì)量濃度為1、5、10、50、100、200、500 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液0.005、0.025、0.050、0.250、0.50、1.00、2.50 mL分別置于10 mL容量瓶中，用空白基質(zhì)溶液定容，配制為質(zhì)量濃度為1、5、10、50、100、200、500 μg/L且稀釋液濃度為50%乙腈的系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

含0.1%甲酸的乙酸銨混合溶液（5 mmol/L）：稱(chēng)取0.385 4 g乙酸銨，用體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液溶解并稀釋至1 000 mL，搖勻。

1.3.2 提取

取茶葉樣品經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過(guò)80 目篩，裝袋， -18 ℃避光保存，備用。

稱(chēng)取上述茶葉粉末1 g（精確至0.001 g）于10 mL塑料離心管中，加入2.00 mL水充分混勻后，靜置10 min，再加入5.00 mL乙腈充分混勻，旋渦振蕩提取1 min，浸泡提取10 min，再次旋渦振蕩1 min，加入2 g氯化鈉旋渦振蕩1 min，6 000 r/min離心3 min，收集上清液，待凈化。

1.3.3 凈化

取前述提取液1.00 mL，移入m-PFC小柱上端，緩慢推動(dòng)注射桿，控制流出速率1 滴/s，收集流出液。準(zhǔn)確吸取0.500 mL凈化液于2 mL離心管中，加入0.500 mL水，混勻，經(jīng)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾，上機(jī)分析。實(shí)驗(yàn)流程如圖1所示。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖Fig. 1 Flow chart of m-PFC combined with LC-MS/MS

1.3.4 儀器條件

1.3.4.1 色譜條件

色譜柱：Shim-pack GIST-HP C18（2.1 mm×100 mm，3 μm），配備相應(yīng)保護(hù)柱；柱溫40 ℃；進(jìn)樣體積10 μL；流動(dòng)相：A為含0.1%甲酸的乙酸銨混合溶液，B為含0.1%甲酸的甲醇混合溶液；流速0.30 mL/min。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.3.4.2 質(zhì)譜條件

毛細(xì)管電壓4 000 V，氣化溫度300 ℃，鞘氣流速15 mL/min，輔助氣流速15 mL/min，離子傳輸管溫度320 ℃，碰撞氣壓力2.0×10-4kPa。電離模式：ESI+，選擇反應(yīng)模式監(jiān)測(cè)，其他參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)Table 2 Mass spectrometric parameters

1.4 數(shù)據(jù)處理

圖譜采集及數(shù)據(jù)定量分析采用Thermo Xcalibur數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行，圖像處理采用Origin 8.0進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相的選擇

目前采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)農(nóng)藥時(shí)使用最為廣泛的流動(dòng)相為乙腈-水體系，本研究首先采用乙腈-水（含0.1%甲酸）體系作為流動(dòng)相進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在該體系下特丁硫磷的靈敏度很低，無(wú)法達(dá)到檢測(cè)要求。陳泳等[15]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用甲醇-乙酸銨體系時(shí)，特丁硫磷、特丁硫磷亞砜及特丁硫磷砜3種化合物可以達(dá)到檢測(cè)要求。本實(shí)驗(yàn)采用含0.1%甲酸的乙酸銨混合溶液以及含0.1%甲酸的甲醇混合溶液體系作為流動(dòng)相，同時(shí)優(yōu)化洗脫梯度，進(jìn)行特丁硫磷及其5種代謝產(chǎn)物的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)特丁硫磷的峰強(qiáng)度得到了明顯改善，6種化合物靈敏度高、出峰時(shí)間穩(wěn)定，滿足定性、定量分析。因此，采用含0.1%甲酸的乙酸銨混合溶液和含0.1%甲酸的甲醇混合溶液體系作為流動(dòng)相進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。特丁硫磷及其5種代謝產(chǎn)物的提取離子流圖見(jiàn)圖2。

圖2 特丁硫磷及其代謝產(chǎn)物的提取離子流圖Fig. 2 Extracted ion chromatograms of terbufos and its metabolites

2.2 提取溶劑的選擇

目前用于農(nóng)藥提取的溶劑主要有甲醇、乙腈、乙酸乙酯、丙酮等。與其他溶劑相比，乙腈具有很好的破壁作用，能夠沉淀提取液中的蛋白質(zhì)和脂肪等雜質(zhì)，提高農(nóng)藥的回收率。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明采用乙腈作為提取溶劑時(shí)，提取液中的干擾組分最少[20]，因此采用乙腈作為提取溶劑。

在植物源食品的農(nóng)藥提取過(guò)程中，除了有機(jī)溶劑外，加入一定量的水能夠增加樣品細(xì)胞的通透性，從而提高樣品中農(nóng)藥的析出[21]。雖然有文獻(xiàn)報(bào)道稱(chēng)不加水進(jìn)行提取亦能獲得較好的回收率[22]，但是其采用的是后加標(biāo)的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，所添加的農(nóng)藥均在樣品表面或是直接在提取溶液中，難以模擬真實(shí)樣品中農(nóng)藥從茶葉細(xì)胞內(nèi)部提取出來(lái)的過(guò)程。特丁硫磷及其5種代謝產(chǎn)物均為極性化合物，研究表明檢測(cè)極性農(nóng)藥時(shí)采用加水浸泡的預(yù)處理方式能夠提高農(nóng)藥的回收率[23]，因此本實(shí)驗(yàn)首先加水使茶葉充分浸潤(rùn)。

因提取溶劑含水，需要加入無(wú)機(jī)鹽使水和乙腈分層，并通過(guò)鹽析作用使農(nóng)藥分配于乙腈層。傳統(tǒng)的QuEChERS法中通常會(huì)添加無(wú)水硫酸鎂和氯化鈉作為提取添加劑，但無(wú)水硫酸鎂遇水容易結(jié)塊并釋放大量的熱，會(huì)導(dǎo)致特丁硫磷等農(nóng)藥發(fā)生分解，影響其回收率，因此本實(shí)驗(yàn)在提取過(guò)程中只選取氯化鈉一種無(wú)機(jī)鹽作為提取添加劑。研究表明，氯化鈉溶液在氯化鈉濃度達(dá)到飽和時(shí)，乙腈-水體系的分層效果最好[24-25]，本實(shí)驗(yàn)直接選用飽和氯化鈉溶液進(jìn)行后續(xù)研究。

鹽析分層后，富乙腈相的體積直接影響農(nóng)藥的回收率。研究表明富乙腈相的獲得率（分層后富乙腈相的體積與初始加入乙腈的體積比）和初始加入的乙腈與水的體積比有關(guān)[26]，因此考察乙腈和飽和氯化鈉溶液在不同比例混合分層后，富乙腈相的獲得率。

將乙腈與飽和氯化鈉溶液按照3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3和8∶2的體積比混合均勻于刻度離心管中，溶液總體積為10 mL，經(jīng)離心溶液分層為富乙腈相（上層）和富水相（下層）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用3 mL乙腈與7 mL氯化鈉飽和溶液進(jìn)行分層實(shí)驗(yàn)時(shí)，富乙腈相只有1.9 mL（乙腈獲得率63.3%）。隨乙腈比例的增加，乙腈獲得率逐漸增大，即逐漸接近初始加入乙腈的體積（圖3）。當(dāng)乙腈與飽和氯化鈉溶液體積比為7∶3時(shí)，富乙腈相比例為97.1%。繼續(xù)降低飽和氯化鈉（水）的比例，將無(wú)法全部浸透部分比重較輕的茶葉。根據(jù)此結(jié)論，選擇加入2 mL水浸泡茶葉，然后加入5 mL乙腈進(jìn)行提取，后加入2 g氯化鈉確保充分飽和進(jìn)行鹽析分層。

圖3 乙腈與飽和氯化鈉溶液按照不同比例混合時(shí)乙腈獲得率Fig. 3 Effect of ratio between acetonitrile and saturated sodium chloride solution on the yield of acetonitrile phase

2.3 吸附劑材料的選擇

茶葉中含有大量的脂肪酸、色素、多酚以及生物堿類(lèi)[27]，如果不進(jìn)行充分凈化不僅會(huì)干擾目標(biāo)化合物的檢測(cè)而且還會(huì)污染色譜柱和質(zhì)譜系統(tǒng)。目前常用的雜質(zhì)吸附劑材料主要有石墨化炭黑（graphitized carbon black，GCB）、MWCNTs、C18、PSA等[28-29]。GCB和MWCNTs對(duì)茶葉提取液中的色素有很強(qiáng)的吸附能力[30-31]。PSA具有弱陰離子交換能力，可通過(guò)氫鍵作用吸附小分子化合物如脂肪酸、有機(jī)酸、糖類(lèi)、花青素等[32]，還對(duì)酯型結(jié)構(gòu)和多酚類(lèi)物質(zhì)具有很強(qiáng)的吸附作用[33-34]。C18對(duì)非極性組分有吸附作用，能夠通過(guò)非極性相互作用吸附弱極性的脂肪酸、甾類(lèi)、色素、油脂等大分子物質(zhì)。研究表明MWCNTs比GCB有更大的比表面積，吸附色素的能力更強(qiáng)[30]，C18對(duì)于茶葉中多酚、色素等雜質(zhì)的去除效果不明顯[33-35]，因此選取MWCNTs和PSA作為凈化吸附劑材料。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果表明，采用100 mg MWCNTs和100 mg PSA的復(fù)合填料制備的m-PFC凈化柱對(duì)茶葉提取液具有很好的凈化效果[19]，因此直接選取該2種凈化填料按照質(zhì)量比1∶1充分混合后，稱(chēng)取200 mg填裝至空m-PFC柱管中，通過(guò)上下篩板將填料固定制備成m-PFC凈化柱，將質(zhì)量濃度為0.200 μg/mL的6種化合物的溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液直接過(guò)柱，流出液用等體積水稀釋后上機(jī)，考察其對(duì)特丁硫磷及5種代謝產(chǎn)物的吸附情況。由圖4可知，特丁硫磷及其代謝產(chǎn)物的回收率均在95%～103%之間，滿足方法學(xué)要求，說(shuō)明該復(fù)合填料對(duì)目標(biāo)待測(cè)物幾乎無(wú)吸附，適合用于特丁硫磷及其代謝產(chǎn)物的凈化。

圖4 特丁硫磷及5種代謝產(chǎn)物直接凈化回收率Fig. 4 Recoveries of terbufos and its five metabolites directly purified on m-PFC column

2.4 脫水劑含量的確定

按照GB 5009.3—2016《食品中水分的測(cè)定》中 第四法——卡爾·費(fèi)休法測(cè)定當(dāng)乙腈與飽和氯化鈉溶液比例為7∶3時(shí)，富乙腈相中的含水量為7.06%。1 mL待凈化乙腈提取液中約含水分0.07 g，為保障提取液中的水分充分被吸附，加入過(guò)量的無(wú)水硫酸鎂（100 mg）作為脫水劑。乙腈提取液中水分以及m-PFC柱中無(wú)水硫酸鎂的絕對(duì)量很少，不會(huì)因無(wú)水硫酸鎂吸水釋放大量的熱量而影響農(nóng)藥的回收率。

綜上，選取100 mg MWCNTs和100 mg PSA作為吸附劑，100 mg無(wú)水硫酸鎂作為脫水劑復(fù)合后制備成m-PFC凈化柱進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)、線性關(guān)系、檢出限及定量限

2.5.1 基質(zhì)效應(yīng)

在液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)行農(nóng)藥檢測(cè)的過(guò)程中，基質(zhì)效應(yīng)普遍存在。基質(zhì)效應(yīng)的存在會(huì)抑制或加強(qiáng)目標(biāo)化合物的電離，從而影響其定性和定量分析[36-37]。當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)在0.9～1.1范圍內(nèi)時(shí)，則表明基質(zhì)效應(yīng)可忽略；當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)＜0.9時(shí)，具有基質(zhì)抑制效應(yīng)；當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)＞1.1時(shí)，具有基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)[38]。分別制備綠茶、普洱茶和紅茶的空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，考察不同類(lèi)型茶葉的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明不同種類(lèi)茶葉的基質(zhì)效應(yīng)差別較小，除特丁硫磷亞砜-OXON和特丁硫磷砜-OXON外，其他4種農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)均在0.9～1.1范圍內(nèi)。特丁硫磷亞砜-OXON和特丁硫磷砜-OXON的基質(zhì)效應(yīng)均在0.9以下，具有較強(qiáng)的基質(zhì)減弱效應(yīng)。為確保定量檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，采取基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。

2.5.2 線性關(guān)系、檢出限及定量限

選取不含特丁硫磷及其5種代謝產(chǎn)物的茶葉作為空白基質(zhì)，準(zhǔn)確配制質(zhì)量濃度為1、5、10、50、100、200、500 μg/L的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液上機(jī)分析。以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，6種化合物在1～500 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.999。通過(guò)逐級(jí)稀釋基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的方式，以信噪比3、10分別作為本方法的檢出限（limits of detection，LOD）、定量限（limits of quantification，LOQ），結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 綠茶、普洱茶及紅茶中特丁硫磷及其代謝產(chǎn)物的基質(zhì)效應(yīng)、 線性相關(guān)系數(shù)、LOD及LOQTable 3 Matrix effect, correlation coefficients (r2), LODs and LOQs of terbufos and its metabolites in green tea, Pu-erh tea and black tea

2.6 回收率及精密度結(jié)果

選取空白綠茶、普洱茶、紅茶樣品，分別添加0.01、0.50、2.00 mg/kg的6種化合物，按照前述操作進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)添加量重復(fù)6 次，計(jì)算各農(nóng)藥的回收率及精密度。結(jié)果表明，綠茶、普洱茶、紅茶中添加6種化合物的平均回收率為81.5%～103.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%～10.1%（表4），結(jié)果符合農(nóng)藥殘留檢測(cè)要求[39]。

表4 特丁硫磷及其代謝產(chǎn)物在綠茶、普洱茶和紅茶中的添加 回收率及精密度（n= 6）Table 4 Recoveries and RSDs of terbufos and its metabolites spiked in green tea, Pu-erh tea and black tea (n = 6)

2.7 茶葉基質(zhì)樣品中特丁硫磷代謝模擬實(shí)驗(yàn)

稱(chēng)取1 g空白綠茶樣品，分別加入100 μg/mL的特丁硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液10.0 μL，同時(shí)加入100 μL 30% H2O2溶液，補(bǔ)水至2.0 mL，于室溫及自然光下分別放置24 h和72 h，然后按照1.3節(jié)方法進(jìn)行提取、凈化及檢測(cè)分析，同時(shí)進(jìn)行不加H2O2的對(duì)照實(shí)驗(yàn)，模擬考察1.00 mg/kg添加量時(shí)，特丁硫磷在茶葉中的代謝情況，見(jiàn)表5。

表5 特丁硫磷代謝模擬實(shí)驗(yàn)Table 5 Simulated degradation of terbufos in tea

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，特丁硫磷易氧化，在室溫下放置24 h后主要生成特丁硫磷亞砜和特丁硫磷砜，繼續(xù)放置至72 h，特丁硫磷亞砜的含量減少，進(jìn)一步被氧化為特丁硫磷砜、特丁硫磷亞砜-OXON和特丁硫磷砜-OXON。在H2O2環(huán)境條件下的加速代謝模擬實(shí)驗(yàn)中，特丁硫磷氧化更迅速，放置24 h后便完全消失（＜0.01 mg/kg），相較于對(duì)照組氧化生成了更多的特丁硫磷亞砜，且更早地檢測(cè)到了特丁硫磷亞砜-OXON和特丁硫磷砜-OXON。本實(shí)驗(yàn)表明，特丁硫磷的代謝產(chǎn)物并非只有GB 2763—2021列出的特丁硫磷亞砜和特丁硫磷砜，還至少會(huì)存在特丁硫磷亞砜-OXON和特丁硫磷砜-OXON。無(wú)論在對(duì)照組還是H2O2組均未檢測(cè)到特丁硫磷-OXON，這可能是因?yàn)樘囟×蛄?OXON是一種中間代謝產(chǎn)物，本身不穩(wěn)定易于直接被氧化為特丁硫磷亞砜-OXON和特丁硫磷砜-OXON。

2.8 實(shí)際樣品檢測(cè)

隨機(jī)選取40個(gè)茶葉樣品進(jìn)行農(nóng)藥的檢測(cè)分析，均未檢出特丁硫磷及其5種代謝產(chǎn)物。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)將快速濾過(guò)型凈化手段與液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合，建立茶葉中特丁硫磷及其5種代謝產(chǎn)物的檢測(cè)方法。相較于傳統(tǒng)的固相萃取法，本方法提取、凈化方法簡(jiǎn)單快速，不必旋蒸、濃縮，大大提高了批量檢測(cè)的工作效率，方法的線性、回收率、精密度等均符合農(nóng)藥殘留檢測(cè)要求。本研究建立特丁硫磷-OXON、特丁硫磷亞砜-OXON和特丁硫磷砜-OXON的檢測(cè)方法，為茶葉中特丁硫磷及其多種代謝產(chǎn)物殘留量的準(zhǔn)確定量提供 技術(shù)手段。