張麗媛，戚綠葉，周明昊

（浙江省食品藥品檢驗研究院，浙江 杭州 310052）

維生素是人體代謝中必不可少的有機化合物，是維持人體健康所必須的物質(zhì)。這種物質(zhì)在人體內(nèi)不能合成或合成量太少，雖然需要量很少，但必須由食物供給[1]。保健食品是一種具有特定保健功能或者以補充維生素、礦物質(zhì)為目的的食品，適宜于特定人群食用，具有調(diào)節(jié)機體功能的作用[2]。維生素類保健食品具有廣泛的市場。VA又稱視黃醇，能夠促進骨骼生長，維持正常視力，缺乏可導(dǎo)致生長發(fā)育緩慢，干眼癥等癥狀[3]。VD是一組具有抗佝僂病作用，結(jié)構(gòu)類似的固醇類衍生物的總稱，具有調(diào)節(jié)鈣、磷代謝，促進骨骼發(fā)育的作用。最主要的是VD2（麥角鈣化醇）和VD3（膽鈣化醇）[4-6]。VA和VD都是脂溶性維生素，通常在食物中共存，主要存在于動物肝臟、蛋類、魚肝油中。VA和VD在人體發(fā)育特別是對嬰幼兒視力、生殖器官、骨骼、牙齒發(fā)育中的重要作用，促進了一系列維生素AD類保健食品的上市。VE又稱生育酚，是重要的抗氧化劑，具有促生育、抗衰老，提高抵抗力的作用。生育酚主要有4種衍生物，按甲基位置分為α-、β-、γ-和δ-生育酚[7]。其中α-生育酚在自然界中分布最廣泛，含量最豐富[8]。

目前，分離VE異構(gòu)體的方法有薄層色譜法、氣相色譜法和基于正相色譜的液相色譜法[9-12]。VD的測定方法有液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、超臨界流體色譜法、放射免疫與薄層色譜法等[13-15]。應(yīng)用較廣泛的為正相色譜凈化、分離、反相色譜定量檢測的液相色譜法。目前，對于VA、VD、VE類產(chǎn)品含量測定的研究，主要集中在嬰幼兒配方乳粉以及配方飼料或中藥方面[16-20]，對于保健食品領(lǐng)域研究較少。保健食品中VA、VD、VE的測定主要依據(jù)GB 5009.82—2016《食品中維生素A、D、E的測定》。其中，VA、VE主要采用第一法，皂化萃取后用反相色譜定量檢測；VD主要采用第四法，由于含量低，基質(zhì)干擾嚴重，需采用正相色譜凈化、分離、收集，反相色譜定量檢測。同時測定VA、VD、VE需采用兩個方法，兩次前處理，兩套液相色譜，對儀器、人員要求較高。整個實驗過程繁瑣復(fù)雜，多次轉(zhuǎn)移復(fù)溶，且VA、VD、VE對光、熱、氧氣等較敏感，影響測定結(jié)果。

二維液相色譜基于其良好的分離效果，已廣泛用于復(fù)雜基質(zhì)樣品中目標(biāo)組分或全組分的分析[17]。二維液相色譜采用色譜柱串聯(lián)技術(shù)，將樣品凈化、分離、收集、測定過程連續(xù)自動進行。樣品經(jīng)過一維色譜柱的初步分離，通過閥切換使其中一種或多種目標(biāo)組分進入二維色譜柱中進一步分離，從而實現(xiàn)在復(fù)雜基質(zhì)中排除干擾物質(zhì)的在線凈化分析過程[21-22]。隨著二維液相色譜的發(fā)展普及，用于檢測VA、VD、VE的文獻也時有報道[11,16,19-25]。檢測方法為，樣品通過第一維色譜柱分離VA和VE，同時對VD進行凈化，將初步凈化后的VD在線引入第二維色譜柱進行分離測定，整個過程只需一次進樣，便可完成樣品中VA、VD、VE的測定，減少了前處理過程，提高了實驗效率。但是，由于VE四個異構(gòu)體及VD2、VD3分離難度大，目前，文獻報道的多為同時檢測VA、VD2、VD3、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚中的其中幾個，沒有同時檢測7種組分的方法。本實驗基于GB 5009.82—2016樣品前處理方法，建立一種高效、準確同時測定保健食品中7種VA、VD、VE組分的二維反相高效液相色譜法，以期為保健品中多種維生素同時檢測提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

視黃醇（純度95%）、γ-生育酚（純度96%）、δ-生育酚（純度90%） 美國Sigma公司；α-生育酚（純度100%） 美國Supelco公司；β-生育酚（純度98%） 百靈威科技有限公司；VD2（純度99.9%）、VD3（純度99%） 中國食品藥品檢定研究院。

甲醇、乙腈（均為色譜純） 德國Meker公司；無水乙醇、氫氧化鉀、2,6-二叔丁基對甲酚（2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol，BHT）、抗壞血酸、石油醚（30～60 ℃）、乙醚（分析純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1260高效液相色譜系統(tǒng)（配有雙四元泵、自動進樣器、柱溫箱內(nèi)置兩位六通閥、2個二極管陣列檢測器和Open LAB CDS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)） 美國安捷倫公司；XPE 205電子天平 瑞士梅特勒公司；Hei-VAP旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)儀 德國Heidolph公司；Genpure超純水儀 美國熱電公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

采用中心切割的柱切換法對保健食品中VA、VD、VE進行分析，該分析過程包含3個階段：第1階段（0～5.35 min）為進樣、檢測VA，此時閥的位置為1-2；第2階段（5.35～5.80 min）為凈化、捕獲VD，此時閥的位置為1-6；第3階段（5.80～15.0 min）為第一維繼續(xù)檢測4種VE，第二維檢測VD，此時閥的位置為1-2。系統(tǒng)流路見圖1。

圖1 二維柱切換流路系統(tǒng)示意圖Fig. 1 Schematic diagram of two-dimensional column switching system

一維色譜柱：Agilent Poroshell 120 PFP（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）；二維色譜柱：Agilent Zorbax Eclipse PAH（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）；捕獲柱：Agilent Poroshell 120 EC C18（4.6 mm×5 mm，4 μm）；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長：一維檢測器325 nm和294 nm，二維檢測器264 nm；一維流速：1.0 mL/min，二維流速：0.3 mL/min。流動相梯度洗脫見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

1.3.2 對照品溶液的配制

分別稱取視黃醇、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、VD2和VD3對照品各20 mg，于10 mL棕色容量瓶中，加無水乙醇溶解并定容至刻度，得對照品單標(biāo)儲備溶液。使用時用甲醇配制成系列標(biāo)準混合溶液。

1.3.3 供試品溶液制備及測定

參照GB 5009.82—2016中有關(guān)樣品前處理方法，樣品先經(jīng)過熱皂化，皂化液經(jīng)石油醚-乙醚 （1∶1，V/V）混合液萃取，石油醚-乙醚混合萃取液經(jīng)過無水硫酸鈉脫水后低溫減壓回收溶劑，再以甲醇溶解殘留物并定容后，上機分析。本法使用的所有器皿不得含有氧化性物質(zhì)；分液漏斗活塞玻璃表面不得涂油；處理過程應(yīng)避免紫外光照，盡可能避光操作；提取過程應(yīng)在通風(fēng)柜中操作。具體操作如下：

稱取2 g樣品經(jīng)均質(zhì)后于150 mL平底燒瓶中，加入20～30 mL溫水（40～50 ℃），1.0 g抗壞血酸和0.1 g BHT，混勻。加入30 mL無水乙醇，加入10～20 mL質(zhì)量濃度為50 g/100 mL的氫氧化鉀溶液，邊加邊振搖，混勻后于恒溫振蕩器上80 ℃皂化30 min，皂化后立即用冷水冷卻至室溫。一般皂化時間為30 min，如皂化液冷卻后，液面有浮油，需要加入適量上述氫氧化鉀與無水乙醇溶液，并適當(dāng)延長皂化時間。將皂化液用30 mL水轉(zhuǎn)入250 mL的分液漏斗中，加入50 mL石油醚-乙醚混合溶液振蕩萃取5 min，將下層溶液轉(zhuǎn)移至另一250 mL的分液漏斗中，加入50 mL的石油醚-乙醚混合溶液再次萃取，合并醚層。用約150 mL水洗滌醚層，約需重復(fù)3 次，直至將醚層洗至中性（可用pH試紙檢測下層溶液pH值），去除下層水相。將洗滌后的醚層經(jīng)無水硫酸鈉（約3 g）濾入250 mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶或氮氣濃縮管中，用約15 mL石油醚-乙醚混合溶液沖洗分液漏斗及無水硫酸鈉2 次，并入蒸發(fā)瓶內(nèi)，并將其接在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器或氣體濃縮儀上，于40 ℃水浴中減壓蒸餾或氣流濃縮，待瓶中醚剩下約2 mL時，取下蒸發(fā)瓶，立即用氮氣吹至近干，用甲醇分次轉(zhuǎn)移到容量瓶中，并定容至刻度。溶液過0.22 μm有機系濾膜后上機測定。定容體積視待測物目標(biāo)濃度而定，處在線性范圍內(nèi)進行定量。分別精密吸取對照品溶液10 μL與供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀 進行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱的選擇

一維色譜柱的選擇主要依據(jù)其對VA與4種生育酚的分離效果。其中，4種生育酚的分離較難，特別是β-生育酚和γ-生育酚的分離對色譜柱要求較高。作為異構(gòu)體的4種生育酚，普通C18柱達不到較好的分離效果。國標(biāo)方法GB 5009.82—2016第一法選擇C30柱分離含有4種生育酚的保健食品，且溫度控制在（20±2）℃，條件較為嚴格，分析時間較長。Agilent Poroshell 120 PFP柱為五氟苯基柱，可用于鹵代化合物的位置異構(gòu)體和非鹵代化合物的選擇性分析，如含羥基、羧基、硝基和其他極性基團的極性化合物。且當(dāng)官能團處于芳香或其他剛性環(huán)狀系統(tǒng)上時，色譜柱選擇性會增強[26]。生育酚是色滿（苯并二氫呋喃）的衍生物，由一個具有氧化活性的6-羥色環(huán)和一個類異戊二烯側(cè)鏈構(gòu)成。根據(jù)苯環(huán)上甲基數(shù)及位置的不同分為α-、β-、γ-和δ-生育酚（圖2）[27]。因此，4種生育酚可以在Agilent Poroshell 120 PFP柱上得到有效分離。

圖2 生育酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 2 Structural formula of vitamin E

二維色譜柱的選擇主要依據(jù)其對VD2和VD3的分離效果。Agilent Zorbax Eclipse PAH多環(huán)芳烴柱采用聚合C18鍵合填料填充，能夠為多環(huán)芳烴的分離提供高選擇性。其還可以用于需要空間選擇性的鍵合相或不同鍵合方式的C18柱以實現(xiàn)分離的化合物。VD2和VD3是兩種同效的維生素，其結(jié)構(gòu)來源于類固醇的環(huán)戊氫烯菲環(huán)結(jié)構(gòu)[28]。VD2和VD3只是側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的不同，前者較后者在側(cè)鏈上多了1個雙鍵和1個甲基[29]。因此，VD2和VD3可以在Agilent Zorbax Eclipse PAH柱上得到有效分離。

二維液相色譜條件選擇需考慮色譜柱的差異性和流動相的兼容性[12]。Agilent Poroshell 120 PFP （4.6 mm×100 mm，2.7 μm）柱和Agilent Zorbax Eclipse PAH（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）柱良好的正交性和流動相的相容性，確保了4種生育酚的有效分離及VD2和VD3的準確定量（圖3）。

圖3 VD的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 3 Structural formula of vitamin D

2.2 閥切換時間的確定

采用在線柱切換二維色譜法分離樣品中的VA、VD、VE。樣品進樣后通過一維色譜柱進行初步分離，通過閥切換將含有VD2和VD3的餾分切割至捕獲柱，捕獲柱與二維色譜柱串聯(lián)，由二維色譜柱進一步分離VD2和VD3，一維色譜柱繼續(xù)分離4種生育酚，一維檢測器檢測VA與生育酚。二維檢測器檢測VD2和VD3。閥切換圖見圖1。為確定閥的準確切換時間，減少溶劑效應(yīng)和提高回收率，需要確定VD2和VD3出峰時間的起點和終點。通過關(guān)閉閥切換命令在一維色譜柱與一維檢測器上進行標(biāo)準品分析，測定VD2和VD3的出峰時間起點和終點。由于使用捕獲柱收集一維色譜柱的VD2和VD3的餾分，而捕獲柱柱容量小，需要考慮在閥切換的時間段內(nèi)捕獲柱是否能完全將VD2和VD3收集[16]。因此，需要在一維色譜柱上盡量減小VD2和VD3的分離度，縮短峰寬。通過多次實驗確定，Agilent Poroshell 120 PFP（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）為一維色譜柱，流速為1.0 mL/min，由標(biāo)準品測試確定出閥切換時間為5.35 min，更改閥的位置端口1-6，5.80 min更改閥的位置端口1-2。

2.3 取樣量的選擇

目前，食品中VA、VD、VE的測定主要依據(jù)GB 5009.82—2016，固體樣品取樣量為2～5 g或5～10 g，取樣量較大且不固定，這主要是因為食品種類繁多，劑型不固定，含量差距較大。保健食品相對食品有較固定的劑型，且保健食品主要是以補充營養(yǎng)物質(zhì)為目的，而人體需要的維生素含量有一定的范圍，所以市售保健食品中維生素含量有較固定的范圍。本研究調(diào)研了國內(nèi)幾大維生素生產(chǎn)企業(yè)市售VA、VD、VE類保健食品，結(jié)果顯示，VA、VD、VE類保健食品主要以片劑和膠囊劑為主，VA含量范圍為0.1～1.0 mg/g，VD含量范圍為0.69～17.2 μg/g，VE含量范圍為3.7～500 mg/g。其中，單方VE保健食品VE含量范圍為80～500 mg/g，復(fù)方VE保健食品VE含量范圍為3.7～26.2 mg/g。因保健食品樣品較均勻，且較大取樣量可能對提取效率產(chǎn)生影響，結(jié)合VD較低的含量，選擇2 g作為樣品取樣量，10 mL作為測定VD時的定容體積，VA、VE稀釋至線性范圍內(nèi)進行定量。

2.4 提取溶劑的選擇

選擇石油醚-乙醚混合液萃取保健食品中VA、VD、VE。因乙醚為易制毒試劑，使用時受到嚴格管制，為方便實驗，考察只用石油醚的萃取效果。結(jié)果表明，石油醚提取只含有VA、VD和α-生育酚的保健食品時萃取效果與石油醚-乙醚混合液沒有顯著差異；萃取含有β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚3種生育酚的保健食品時，萃取效果不好，這是因為這3種生育酚較α-生育酚極性強，根據(jù)相似相溶原理，弱極性的石油醚對他們達不到較好的萃取效果。故在提取含有這3種生育酚的保健食品時必須用石油醚-乙醚混合液。

2.5 標(biāo)準曲線與定量限測定

精密吸取各對照品單標(biāo)儲備溶液，加甲醇配制成VA質(zhì)量濃度為2.50、10.0、20.0、40.0、50.0 μg/mL，4種生育酚質(zhì)量濃度為 5.00、20.0、40.0、80.0、100.0 μg/mL， VD2和VD3質(zhì)量濃度為0.10、0.20、0.50、1.00、 2.00 μg/mL的標(biāo)準系列混合溶液。分別吸取系列標(biāo)準混合溶液各10 μL，依次注入液相色譜儀。以質(zhì)量濃度（μg/mL） 為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，計算回歸方程。以10 倍信噪比確定定量限。結(jié)果（表2）表明：VA在2.50～50.0 μg/mL線性范圍內(nèi)，4種生育酚在5.00～100.0 μg/mL線性范圍內(nèi)，VD2和VD3在0.10～2.00 μg/mL線性范圍內(nèi)，線性相關(guān)性良好。

表2 7種化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)和定量限Table 2 Linear equations, correlation coefficients and limits of quantitation for seven vitamin compounds

2.6 精密度及系統(tǒng)適用性檢測

分別精密吸取VA質(zhì)量濃度為50.0 μg/mL、4種生育酚質(zhì)量濃度為100.0 μg/mL、VD2和VD3質(zhì)量濃度為2.00 μg/mL的標(biāo)準混合溶液10 μL，連續(xù)進樣6 次，記錄峰面積。相對標(biāo)準偏差（relative standard deviation，RSD）均小于0.5%。各組分理論塔板數(shù)均大于10 000，分離度均大于1.5（表3）。表明儀器精密度良好，滿足系統(tǒng)適用性要求。標(biāo)準混合溶液圖譜見圖4。

表3 精密度及系統(tǒng)適用性結(jié)果Table 3 Results of precision and system suitability

圖4 標(biāo)準品二維液相色譜圖Fig. 4 Two-dimensional chromatogram of mixed vitamin standard solution

2.7 回收率與重復(fù)性實驗結(jié)果

采用陰性樣品加標(biāo)回收法測定回收率。分別向陰性樣品中加入適量對照品溶液，按1.3.3節(jié)方法制備供試品溶液，使加標(biāo)溶液質(zhì)量濃度分別為VA：5.0、20.0、40.0 μg/mL；4種生育酚：10.0、40.0、80.0 μg/mL；VD2和VD3：0.20、0.80、1.60 μg/mL，分別作為低、中、高3個水平加標(biāo)溶液。平行制備3 份樣，計算回收率，作為回收率樣品。中水平加標(biāo)溶液平行制備6 份樣，作為重復(fù)性樣品，記錄峰面積，計算RSD。不同質(zhì)量濃度水平平均回收率為89%～99%，RSD均小于4%。表明該方法準確度高、重復(fù)性好，結(jié)果見表4、5。

表4 樣品加標(biāo)回收率及RSDTable 4 Recoveries and RSDs for spiked samples

表5 重復(fù)性結(jié)果Table 5 Results of repeatability

2.8 樣品測定結(jié)果

選取市售VA、VD、VE類保健食品，采用本法對樣品進行檢測。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，市售VD類保健食品中主要添加VD3，VE類保健食品中主要添加的為α-生育酚，所測樣品均符合各企業(yè)標(biāo)準規(guī)定，結(jié)果見表6，某樣品圖譜見圖5。

表6 樣品測定結(jié)果Table 6 Results of vitamin determination in actual samples

圖5 樣品二維液相色譜圖Fig. 5 Two-dimensional chromatograms of samples

3 結(jié) 論

本實驗基于在線柱切換法二維液相色譜技術(shù)建立了保健食品中VA、VD、VE的測定方法，系統(tǒng)適用性實驗結(jié)果表明，本方法可滿足VA、VD、VE的測定要求，利用一維色譜柱可完成VA、4種生育酚的分離和VD的凈化，利用二維色譜柱可完成VD2、VD3的分離及定量分析。本方法的線性關(guān)系、準確度和精密度良好，采用優(yōu)化的在線二維系統(tǒng)連接設(shè)計，一次進樣可完成VA、VD、VE的定量測定，大大提高了實際樣品的分析效率，可進行推廣應(yīng)用。