盧蘭香，薛 霞，宿書芳，張艷俠，尹麗麗，程 志，鄭文靜，孫立臻，王 駿，祝建華，劉艷明

（山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東省特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，山東省食品藥品安全檢測(cè)工程技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250101）

特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品是指針對(duì)患有特殊紊亂、疾病或醫(yī)療狀況等特殊醫(yī)學(xué)狀況嬰兒的營(yíng)養(yǎng)需求而設(shè)計(jì)制成的粉狀或液態(tài)配方食品[1]。部分嬰兒由于各種疾病原因，不能喂養(yǎng)母乳或普通嬰兒配方食品，特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品，是這些嬰兒生命早期或出生后相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)賴以生存的主要食物[2]。

氨基酸是構(gòu)成人體營(yíng)養(yǎng)所需蛋白質(zhì)的基本物質(zhì)，常被加入到特醫(yī)食品中，起到促進(jìn)發(fā)育、調(diào)節(jié)人體代謝等作用[3]；?；撬幔═au）與胱氨酸的代謝密切相關(guān)，并且結(jié)構(gòu)與氨基酸類似，被稱為類氨基酸物質(zhì)[4]。目前，GB 25596—2010《特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品通則》可用于特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品的氨基酸有19種，但是并未給出相應(yīng)的檢測(cè)方法。國(guó)內(nèi)關(guān)于食品中氨基酸的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)僅有GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測(cè)定》[5]，該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了16種氨基酸的檢測(cè)方法，沒有覆蓋GB 25596—2010中包含的胱氨酸、色氨酸以及谷氨酰胺3種氨基酸的檢測(cè)。GB 25596—2010規(guī)定了Tau的添加量為0～3 mg/100 kcal，而GB 5009.169—2016《食品中牛磺酸的測(cè)定》[6]檢測(cè)范圍不包括特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品。國(guó)內(nèi)外報(bào)道的氨基酸檢測(cè)涉及的研究對(duì)象大多為生物樣品或普通食品，而Tau的研究對(duì)象多為嬰幼兒配方乳粉和飲料；對(duì)特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品中氨基酸和Tau的同時(shí)檢測(cè)鮮有報(bào)道。由于醫(yī)用食品因其特殊的功能性用途，產(chǎn)品基質(zhì)和結(jié)構(gòu)成分與嬰幼兒配方乳粉及普通食品有著較大的區(qū)別[7]，使得常規(guī)食品或嬰幼兒配方乳粉中氨基酸和Tau的檢測(cè)方法在醫(yī)用食品檢測(cè)領(lǐng)域難以直接應(yīng)用。

目前，氨基酸和Tau的檢測(cè)技術(shù)主要有氨基酸分析儀[5,8-9]、高效液相色譜儀[10-17]及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀[18-24]等。GB 5009.124—2016采用的是離子交換茚三酮柱后衍生的方法，該方法中使用的氨基酸自動(dòng)分析儀價(jià)格昂貴、用途專一、靈活性差，大大限制了其推廣和使用。而液相色譜分析法，普適性廣，具有分析速度快、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，已成為檢測(cè)氨基酸的首選方法。因氨基酸和Tau屬于極性大且無(wú)紫外吸收的一類化合物，故需進(jìn)行衍生化。常用的衍生劑有異硫氰酸苯酯（phenylisothiocyanate，PITC）[11,17]、2,4-二硝基氟苯（2,4-dinitrofluorobenzene，DNFB）[10]、鄰苯二甲醛（o-phthaldiadehyde，OPA）[15]、9-氯甲酸芴甲酯（9-fluorenyl methyl chloroformate，F(xiàn)MOC）、OPAFMOC聯(lián)用[12]、丹磺酰氯（1-dimethylaminonaphthalene-5-sulphonyl-chloride，Dansyl-Cl）[25]、6-氨基喹啉基-N-羥基-琥珀酰亞氨基甲酸酯（6-aminoquinolyl-Nhydroxysuccinimidyl carbamate，AQC）[26-28]等。DNFB衍生過程中能夠產(chǎn)生對(duì)測(cè)定結(jié)果有干擾的副產(chǎn)物，PITC衍生試劑具有揮發(fā)性且毒性較大，需真空干燥裝置去除過量衍生劑，F(xiàn)MOC衍生過量的反應(yīng)劑必須用戌烷萃取除去[29]；OPA衍生產(chǎn)物在室溫不穩(wěn)定，分解率高[30]；Dansyl-Cl反應(yīng)活性較差，反應(yīng)速度慢，且易生成多級(jí)衍生產(chǎn)物干擾測(cè)定。AQC[31]可與伯胺和仲胺反應(yīng)生成穩(wěn)定的衍生物脲，其衍生物有很強(qiáng)的紫外吸收和熒光吸收，衍生操作簡(jiǎn)單，衍生速度快，過量的試劑能自然水解，不需要特殊的處理或提取；而且還不受樣品基質(zhì)、大量電解質(zhì)、維生素和微量元素的干擾，特別適用于食品等復(fù)雜基質(zhì)中氨基酸的分析。

本研究針對(duì)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中檢測(cè)對(duì)象覆蓋不全、檢測(cè)范圍不包含醫(yī)用食品，無(wú)法滿足監(jiān)管需求的問題，采用AQC衍生，建立超高效液相色譜同時(shí)測(cè)定特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品中19種游離氨基酸和Tau的檢測(cè)方法，填補(bǔ)醫(yī)用食品中氨基酸和Tau檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)空白和技術(shù)缺失，可以為殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品的質(zhì)量控制和監(jiān)管提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)用特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品：無(wú)乳糖配方、乳蛋白部分水解配方、乳蛋白深度水解配方、氨基酸配方、早產(chǎn)/低出生體質(zhì)量嬰兒配方、氨基酸代謝障礙配方、母乳營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑均為市售。

標(biāo)準(zhǔn)品：天冬氨酸（Asp，純度≥99.7%）、絲氨酸（Ser，純度≥99.9%）、谷氨酸（Glu，純度≥ 98.0%）、組氨酸（His，純度≥99.9%）、精氨酸（Arg，純度≥91.3%）、蘇氨酸（Thr，純度≥ 99.9%）、脯氨酸（Pro，純度≥99.5%）、酪氨酸（Tyr，純度≥99.6%）、纈氨酸（Val，純度≥ 99.4%）、蛋氨酸（Met，純度≥98.3%）、賴氨酸（Lys，純度≥88.1%）、異亮氨酸（Ile，純度≥ 99.5%）、亮氨酸（Leu，純度≥99.9%）、苯丙氨酸（Phe，純度≥99.4%）、谷氨酰胺（Gln，純度≥ 99.2%）、色氨酸（Trp，純度≥99.6%），均購(gòu)自Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；丙氨酸（Ala，純度≥ 99.8%）、胱氨酸（Cys，純度≥99.9%），均購(gòu)自北京曼哈格生物科技有限公司；甘氨酸（Gly，純度≥99.0%） 中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；Tau（純 度≥99.8%） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

乙腈（色譜純） 美國(guó)Fisher公司；甲酸（色譜純）、Waters AccQ-Tag氨基酸測(cè)定試劑盒（AccQ-Fluor 試劑盒（包括硼酸緩沖液1、衍生劑粉2A、稀釋 液2B））；α-淀粉酶（活力≥1.5 U/mg） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；甲酸銨（色譜純） 美國(guó)Fisher公司；鹽酸（優(yōu)級(jí)純）、氫氧化鈉（分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；有機(jī)微孔濾膜（0.22 μm） 上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

H-CLASS超高效液相色譜儀（配備二極管陣列檢 測(cè)器） 美國(guó)Waters公司；AB204-S型電子天平 瑞士 Mettler Toledo公司；SB-800DTD型超聲波清洗器 寧波新芝生物科技股份有限公司；3-18K型冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；MS3渦旋混合器 德國(guó)IKA公司；SW22型恒溫水浴振蕩搖床 優(yōu)萊博技術(shù)（背景）有限公司；Milli-Q超純水制備器 美國(guó)Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（10.0 mmol/L）：分別準(zhǔn)確稱取適量（精確至0.1 mg）標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，分別用0.1 mol/L鹽酸定容至刻度。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：將以上各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋，配成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用前逐級(jí)稀釋至各組分均為3.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0、200.0、250.0 μmol/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，待用。

1.3.2 樣品前處理

1.3.2.1 提取

樣品混勻后稱取1 g（精確到0.000 1 g）至50 mL離心管中，加入20 mL 45～50 ℃的水，混勻。充分搖勻，加入0.1 gα-淀粉酶，混勻后，置于（55±5）℃的恒溫水浴振蕩搖床中30 min。取出，冷卻至室溫后，用鹽酸溶液調(diào)節(jié)試樣溶液的pH值至1.7±0.1，放置約2 min后，再用氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至4.5±0.1后，超聲約10 min。將試樣溶液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用水沖洗比色管，洗液合并于25 mL容量瓶中，加水定容后，搖勻，樣液全部轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，8 000 r/min離心5 min，上清液經(jīng)0.22 μm有機(jī)相微孔濾膜過濾后待用。

1.3.2.2 衍生

AccQ-Fluor衍生劑的制備：吸取2B瓶中1 mL AccQFluor稀釋劑放入裝有AccQ-Fluor衍生劑粉末的2A瓶中，加蓋密封，渦旋10 s，在55 ℃加熱裝置上加熱2A瓶，直至AccQ-Fluor衍生劑粉末全部溶解，加熱時(shí)間不超過10 min。密封，室溫下保存于干燥器中，有效期1 周。

衍生樣品或標(biāo)準(zhǔn)溶液：移取10 μL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液或1.3.2.1節(jié)的樣品提取液于6 mm×50 mm試管的底部，加入70 μL AccQ-Fluor硼酸鹽緩沖液（Buffer 1）渦旋混合后，加入20 μL AccQ×Fluor衍生劑，立即渦旋混合，室溫放置1 min，將樣品溶液轉(zhuǎn)移至微量自動(dòng)進(jìn)樣樣品瓶中，加蓋密封，置于55 ℃加熱裝置上加熱10 min，冷卻至室溫后上機(jī)測(cè)定。

衍生試劑空白溶液：移取80 μL AccQ-Fluor硼酸鹽緩沖液（Buffer 1）于6 mm×50 mm試管的底部，加入20 μL AccQ-Fluor衍生劑，立即渦旋混合，將樣品溶液轉(zhuǎn)移至微量自動(dòng)進(jìn)樣樣品瓶中，加蓋密封，上機(jī)測(cè)定。

1.3.3 色譜條件

超高效液相色譜柱：AccQ-Tag Ultra C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：A為甲酸-甲酸銨緩沖溶液（20 mmol/L，pH 2.25），B為甲酸-甲酸銨緩沖溶液（20 mmol/L，pH 3.00），C為乙腈；進(jìn)樣體積1 μL；柱溫55 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm，梯度洗脫程序如表1所示。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過與儀器配套的Empower 3色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)完成數(shù)據(jù)采集與處理，以及Origin 8.0進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 沉淀方式的選擇

特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品的配方及其多樣復(fù)雜，樣品中含有大量的碳水化合物、氨基酸、蛋白質(zhì)、麥芽糊精等物質(zhì)，若不除去會(huì)嚴(yán)重干擾目標(biāo)物的測(cè)定。由于氨基酸和Tau結(jié)構(gòu)相似，都包含羧基（磺酸基）和氨基的極性化合物，很難靠單純的陰陽(yáng)離子固相萃取法同時(shí)實(shí)現(xiàn)多種氨基酸和Tau的凈化，所以實(shí)驗(yàn)采用沉淀法除去樣品中的干擾物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)以某乳蛋白深度水解配方特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品為代表，考察調(diào)pH值沉淀、亞鐵氰化鉀-乙酸鋅沉淀劑、體積分?jǐn)?shù)80%乙腈溶液3種沉淀方式對(duì)特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品中19種氨基酸和Tau提取量（圖1A）和回收率（圖1B）的影響。

圖1 沉淀方式對(duì)19種氨基酸和Tau提取的影響Fig. 1 Effect of precipitation methods on the recovery of 19 amino acids and taurine

實(shí)驗(yàn)表明，3種沉淀方式對(duì)不同氨基酸和Tau的提取和回收率的影響趨勢(shì)基本一致。亞鐵氰化鉀-乙酸鋅和80%乙腈溶液兩種沉淀方式沉淀效果良好，濾液澄清透明；但樣品中19種氨基酸和Tau回收率大部分有不同程度的偏低現(xiàn)象，樣品中除谷氨酰胺未檢出外，其他18種氨基酸和Tau的含量大部分也出現(xiàn)不同程度的偏低現(xiàn)象，與對(duì)回收率的影響相符。而調(diào)pH值沉淀，除蛋白深度水解配方和氨基酸配方濾液出現(xiàn)輕微渾濁外，剩余其他配方特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品的濾液均為澄清透明溶液，沉淀效果良好，且提取效果良好和回收率正常。原因可能是氨基酸和Tau在乙腈中的溶解度較低，而且乙腈在沉淀干擾物質(zhì)時(shí)可能同時(shí)沉淀了目標(biāo)物；亞鐵氰化鉀-乙酸鋅是通過生成氰化亞鐵酸鋅絡(luò)合物與干擾物質(zhì)共沉淀，可能吸附或包裹了部分目標(biāo)物。調(diào)pH值沉淀凈化效果良好，目標(biāo)物提取效率高，所以實(shí)驗(yàn)選擇調(diào)pH值沉淀去除樣品中的干擾物質(zhì)。

2.1.2 提取方式的選擇

由于特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品基質(zhì)的特殊性和復(fù)雜性，實(shí)驗(yàn)以某乳蛋白深度水解配方特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品為代表，考察α-淀粉酶酶解和不酶解對(duì)樣品中19種氨基酸和Tau提取的影響結(jié)果表明，用α-淀粉酶酶解和不酶解，樣品中氨基酸和Tau含量沒有明顯差異；但是不用α-淀粉酶酶解直接調(diào)pH值沉淀時(shí)，樣品處理液渾濁，離心后濾液仍然很渾濁無(wú)法通過微孔濾膜過濾，酶解后濾液相對(duì)較澄清，濾液均可順利通過微孔濾膜。所以實(shí)驗(yàn)選擇用α-淀粉酶酶解。

2.1.3 衍生試劑用量的影響

氨基酸本身無(wú)紫外吸收，需衍生化后才能進(jìn)行超高效液相色譜分析，因此衍生試劑的用量直接影響氨基酸和Tau分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。實(shí)驗(yàn)向250 μmol/L 的19種氨基酸和Tau混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別加入5、10、20、30 μL的衍生化試劑，考察衍生試劑體積對(duì)19種氨基酸和Tau衍生物峰面積的影響（圖2）。結(jié)果表明，隨著衍生試劑用量的增加，19種氨基酸和Tau衍生物的峰面積逐漸增加，超過20 μL之后趨于平穩(wěn)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)衍生試劑加入量為5、10 μL時(shí)，在His和Tau之間會(huì)產(chǎn)生一個(gè)色譜峰，而且與Tau不能完全分離；可能是因?yàn)檠苌煌耆a(chǎn)生的異構(gòu)體。衍生過程中的副產(chǎn)物6-氨基喹啉（6-aminoquinoline，AMQ）很強(qiáng)的紫外吸收，隨著衍生試劑的增加AMQ峰面積逐漸增加，且會(huì)在氨基酸和Tau衍生物的峰前形成一個(gè)大的試劑峰并伴有拖尾現(xiàn)象，從而干擾目標(biāo)物的測(cè)定。所以實(shí)驗(yàn)選擇衍生試劑的用 量為20 μL。

圖2 衍生試劑用量對(duì)19種氨基酸和Tau衍生物峰面積的影響Fig. 2 Effect of derivatization reagent dosage on peak area of 19 amino acids and taurine

2.2 超高效液相色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

實(shí)驗(yàn)選取Waters Acquity UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、BEH Shield RP18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）和AccQ-Tag Ultra C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）3種色譜柱對(duì)分離效果的影響。結(jié)果表明：BEH Shield RP18分離效果最差，HSS T3分離時(shí)Arg和Gly不能完全分離，Ile、Leu、Phe、Trp不能完全分離；AccQ-Tag Ultra C18分離效果最好，能夠?qū)崿F(xiàn)19種氨基酸和Tau的完全分離。因此，實(shí)驗(yàn)選擇 AccQ-Tag Ultra C18色譜柱。

2.2.2 流動(dòng)相條件的選擇

2.2.2.1 流動(dòng)相種類

由于實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜，考慮到磷酸鹽對(duì)輸液泵和色譜柱的影響以及梯度設(shè)置的限制，所以比較常用的甲酸-甲酸銨緩沖液和乙酸-乙酸銨緩沖液對(duì)19種氨基酸和Tau分離效果的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，甲酸-甲酸銨緩沖液能實(shí)現(xiàn)19種氨基酸和Tau的有效分離，且峰形良好，所以實(shí)驗(yàn)選取甲酸-甲酸銨緩沖液作為流動(dòng)相。

2.2.2.2 流動(dòng)相濃度

實(shí)驗(yàn)比較10、20、30 mmol/L的甲酸-甲酸銨緩沖液，對(duì)19種氨基酸和Tau分離效果的影響。實(shí)驗(yàn)表明，Gly和Arg比較難分離，在10 mmol/L甲酸-甲酸銨緩沖液中分離度為0.89，不能實(shí)現(xiàn)完全分離；在20、30 mmol/L的甲酸-甲酸銨緩沖液中的分離度分別為1.76、3.16均大于1.5，都能實(shí)現(xiàn)完全分離，但考慮到鹽濃度對(duì)超高效液相色譜儀的輸液泵和色譜柱的影響，所以實(shí)驗(yàn)選擇甲酸-甲酸銨緩沖液的濃度為20 mmol/L。

2.2.2.3 流動(dòng)相pH值

一級(jí)或二級(jí)氨基酸與AQC的衍生產(chǎn)物脲含有羧基，流動(dòng)相pH值對(duì)其分離度影響很大，在相同pH值條件下難以使所有目標(biāo)物實(shí)現(xiàn)完全分離。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Ser、Gln、Gly、Arg、Asp完全分離需要的pH值高于Cys、Lys、Tyr、Met、Val，所以實(shí)驗(yàn)針對(duì)不同氨基酸性質(zhì)擬采用不同pH值的流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。實(shí)驗(yàn)分別考察pH 2.00、2.25、2.50對(duì)Cys、Lys、Tyr、Met、Val分離效果的影響（圖3A），pH 2.75、3.00、3.25對(duì)其他氨基酸和Tau分離效果的影響（圖3B）。

圖3 緩沖液pH值對(duì)19種氨基酸和Tau分離的影響Fig. 3 Effect of buffer pH on separation of 19 amino acids and taurine

實(shí)驗(yàn)表明，流動(dòng)相pH值較小范圍內(nèi)變化，對(duì)19種氨基酸和Tau的分離度影響較大，與文獻(xiàn)[32]報(bào)道一致，因此，為保證流動(dòng)相pH值的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，pH值數(shù)值需精確到小數(shù)點(diǎn)后兩位。

由圖3A可知，pH 2.50時(shí)Cys與衍生峰不能完全分離，pH 2.25和pH 2.00對(duì)Cys、Lys、Tyr、Met、Val分離效果都比較好，因此，從保護(hù)色譜柱的角度考慮，在15.5～22.0 min內(nèi)甲酸-甲酸銨緩沖溶液的酸度選擇為pH 2.25。

圖3B表明，甲酸-甲酸銨緩沖溶液pH 3.25時(shí)，Arg與Asp難以分離；pH 2.75時(shí)，Gly與Arg幾乎重疊為一個(gè)峰，難以實(shí)現(xiàn)完全分離；pH 3.00時(shí)，目標(biāo)化合物的分離度效果和峰形都很好，所以，除15.5～22.0 min，甲酸-甲酸銨緩沖溶液的pH值選擇為3.00。

綜上所述，實(shí)驗(yàn)選擇20 mmol/L的甲酸-甲酸銨緩沖溶液為流動(dòng)相，15.5～22.0 min范圍內(nèi)緩沖溶液pH值為2.25，梯度洗脫程序中其他時(shí)間的緩沖溶液pH 3.00。

2.2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取配制好的19種氨基酸和Tau混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（100.0 μmol/L），用Waters H-CLASS超高效液相色譜儀配備的Waters二極管陣列檢測(cè)器于190～400 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜全波長(zhǎng)掃描，得光譜圖見圖4?？梢钥闯?，目標(biāo)化合物的最大吸收波長(zhǎng)均為260 nm，故選擇260 nm為最佳波長(zhǎng)。

圖4 19種氨基酸和Tau（100.0 μmol/L）的光譜圖Fig. 4 Ultraviolet absorption spectra of 19 amino acids and taurine (100.0 μmol/L)

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性范圍、檢出限和定量限測(cè)定結(jié)果

將1.3.1節(jié)步驟配制的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液按1.3.2.2節(jié)衍生后，按質(zhì)量濃度由低到高的順序依次經(jīng)超高效液相色譜進(jìn)行分析測(cè)定，以各目標(biāo)化合物的峰面積（Y）對(duì)其質(zhì)量濃度（X）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999。按1.3.2節(jié)前處理方法處理后，以RSN≥3得到目標(biāo)化合物的檢出限，以RSN≥10得到目標(biāo)化合物的定量限 （表2）。圖5為19種氨基酸和Tau標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μmol/L）、無(wú)乳糖配方特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品及其加標(biāo)水平為100 μmol/L的超高效液相色譜圖。

表2 19種氨基酸和Tau的線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、 檢出限及定量限Table 2 Linear equations, linear ranges, correlation coefficients, and limits of detection and quantitation for 19 amino acids and taurine

圖5 19種氨基酸和Tau樣品標(biāo)準(zhǔn)溶液與樣品及其加標(biāo)的 超高效液相色譜圖Fig. 5 HPLC chromatograms of mixed standard solution of 19 amino acids and taurine, blank sample and spiked sample

2.3.2 回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

選取某早產(chǎn)/低出生體質(zhì)量嬰兒配方和氨基酸配方為代表進(jìn)行特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品回收率實(shí)驗(yàn)。樣品中未檢出的目標(biāo)化合物按其定量限、5 倍定量限、10 倍定量限，已知含量的目標(biāo)化合物按其含量的50%、100%、150%，分別添加3個(gè)不同水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，各個(gè)水平平行測(cè)定6 次。由表3可知，加標(biāo)回收率在90.16%～109.84%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.03%～4.77%之間。

表3 方法的回收率和精密度（n=6）Table 3 Recoveries and RSDs for the developed method (n = 6)

續(xù)表3

2.3.3 實(shí)際樣品的測(cè)定結(jié)果

應(yīng)用本方法對(duì)市售不同配方的特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品：無(wú)乳糖配方、乳蛋白部分水解配方、乳蛋白深度水解配方、氨基酸配方、早產(chǎn)/低出生體質(zhì)量嬰兒配方、氨基酸代謝障礙配方、母乳營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑中的19種氨基酸和Tau進(jìn)行分析（表4）。結(jié)果表明，特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品中均含有Tau，所測(cè)得的含量與其產(chǎn)品標(biāo)簽標(biāo)示基本一致；乳蛋白深度水解配方、氨基酸配方和氨基酸代謝障礙配方中均含有大量游離氨基酸，且與氨基酸配方和氨基酸代謝障礙配方配料表中氨基酸種類相符。

表4 特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品中19種氨基酸和Tau的含量Table 4 Contents of 19 amino acids and taurine in formulas for special medical purpose intended for infants

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)考察不同沉淀?xiàng)l件和不同提取條件對(duì)氨基酸和Tau提取的影響，優(yōu)化流動(dòng)相種類、濃度、pH值和色譜柱對(duì)19種氨基酸和Tau分離的影響，采用操作簡(jiǎn)單、衍生速度快的AQC為衍生試劑，建立了超高效液相色譜法測(cè)定特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品中19種游離氨基酸和Tau的分析方法。

本方法前處理采用α-淀粉酶酶解后調(diào)pH值去除蛋白等雜質(zhì)，操作簡(jiǎn)單；針對(duì)不同氨基酸的性質(zhì)，采用不同酸度流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，實(shí)現(xiàn)19種氨基酸和Tau的完全分離。該方法簡(jiǎn)單易行，選擇性好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，靈敏度高；適用于特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品中游離氨基酸和Tau的測(cè)定。

本研究填補(bǔ)了殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品中氨基酸和Tau的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)空白和技術(shù)缺失，滿足了殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品的質(zhì)量控制和監(jiān)管的技術(shù)要求，為產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展提供了技術(shù)支持。