李 姣，蘇繼磊，陳 敏，尹 浩

（1.中國科學(xué)院南海海洋研究所，中國科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510301；2.中國科學(xué)院大學(xué)地球與行星科學(xué)學(xué)院，北京 100049）

高血壓是各種心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展的主要病因之一，預(yù)計到2025年，發(fā)病人數(shù)將超過15億[1]。在高血壓的發(fā)病機(jī)理中，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）起著至關(guān)重要的作用，它一方面可以催化血管緊張素I轉(zhuǎn)化為血管緊張素II，另一方面它還促進(jìn)緩激肽的降解，這兩個行為均會引起血壓的升高[2-4]。因此，抑制ACE是目前臨床上治療高血壓的有效方法?，F(xiàn)階段常用的ACE抑制劑包括卡托普利、依那普利和貝那普利等。然而，這些化學(xué)合成的藥物通常表現(xiàn)出一些顯而易見的不良作用[5-7]。根據(jù)最近的文獻(xiàn)報道，某些食品諸如大豆、牛奶、魚蝦貝類的肉中含有豐富的蛋白質(zhì)，它們的蛋白水解物呈現(xiàn)出一定生物活性，如抗氧化、降壓、抗菌及降血糖等[8-12]。因此大量研究開始致力于從天然無毒的食品蛋白水解物中開發(fā)用于治療高血壓的活性肽，而對蛋白水解物的水解特征及起活性作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究是開發(fā)高價值活性肽最重要的一步。

馬氏珍珠貝（Pinctada fucata）是我國南方沿海地帶用作珍珠培育的經(jīng)濟(jì)貝類，然而，珍珠貝經(jīng)采珠后，其貝肉大多僅具有食用價值。因此，使用蛋白酶對貝肉進(jìn)行酶解，開發(fā)珍珠貝肉的附加價值，是實(shí)現(xiàn)珍珠貝蛋白資源高效利用的關(guān)鍵步驟。目前，對珍珠貝蛋白的酶解多集中在抗氧化、ACE抑制、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合等活性的研究[13-16]。其研究思路大多以活性為追蹤目標(biāo)，利用傳統(tǒng)的分離純化方法鑒定出活性肽，方法繁瑣復(fù)雜，費(fèi)時耗力，且純化出的活性肽可能是由某幾個肽組成的共洗脫組分，對于單個活性肽的鑒定依然很困難，并且鑒定出的肽的特征及活性機(jī)理仍不可知。

近年來，隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，大量具有預(yù)測肽序列及其理化特征的數(shù)據(jù)庫應(yīng)運(yùn)而生，給多肽的初步篩選提供了極大的便捷。并且，計算機(jī)輔助藥物篩選技術(shù)的更新對多肽篩選及大分子和小分子之間相互作用機(jī)制的研究也起到了推動作用。BIOPEP、PeptideCutter等各大網(wǎng)站被用于預(yù)測從特定蛋白質(zhì)中釋放出來的活性肽序列[17-21]，然而，這些網(wǎng)站采用的是虛擬酶解法，其釋放出的肽段可能在真實(shí)酶解中并不存在，因?yàn)檎鎸?shí)酶解釋放出的活性肽序列受蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)、酶解溫度及pH值等各種條件的影響。Fu等[22]采用虛擬酶解與體外真實(shí)酶解相結(jié)合研究了膠原蛋白α-1(I)和α-2(I)的酶解情況，發(fā)現(xiàn)胃蛋白酶酶解產(chǎn)物中經(jīng)鑒定有序列為Gly-Pro-Arg-Gly-Phe的ACE抑制肽，然而，其在虛擬酶解中并未被發(fā)現(xiàn)，這主要是因?yàn)樘摂M酶解中預(yù)測的肽是理論上釋放的肽序列，而真實(shí)酶解則受多種外部條件的影響。因此，只有將酶解活性實(shí)驗(yàn)與以計算機(jī)為輔助的篩選相結(jié)合，才能高效地篩選出高活性的目標(biāo)肽段。

本研究采用超濾及凝膠色譜Sephadex G-25對馬氏珍珠貝肉酶解物進(jìn)行初步分離，獲得相對高活性的ACE抑制組分F2和F3。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谘芯狂R氏珍珠貝肉在不同酶解時間下的分子質(zhì)量變化，以及隨著酶解時間一些特征峰的變化，并對F2、F3組分進(jìn)行鑒定，從而解析酶解物中活性肽的結(jié)構(gòu)特征，最后采用分子對接的方法篩選其中潛在的ACE抑制肽，對其抑制機(jī)理進(jìn)行初探，以期為珍珠貝來源活性肽應(yīng)用于降血壓功能性食品和藥品開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

珍珠貝肉購于湛江海鮮市場，解凍后使用研磨機(jī)磨碎，采用貝肉-異丙醇1∶4（g/mL）脫脂3 h后，將其晾在空氣中干燥并貯存在-20 ℃以備用。

堿性蛋白酶（200 000 U/g） 廣西南寧龐博生物工程有限公司；馬尿酰-組氨酸-亮氨酸（hippuryl-histidylleucine，HHL）、ACE（來自兔肺） 美國Sigma 公司；截留分子質(zhì)量為3 kDa的超濾管 美國Millipore 公司；合成肽（純度＞98%） 吉爾生化（上海）有限公司；其他試劑均為分析純或色譜純。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-8D數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金怡儀器科技有限公司； 5810R臺式高速大容量離心機(jī) 德國艾本得公司；冷凍干燥機(jī) 德國Christ公司；電泳儀 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；1260分析型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國Agilent公司；Impact X高分辨四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜 美國Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 酶解物的制備

稱取一定量脫脂后的珍珠貝肉干，加入堿性蛋白酶酶解，溫度50 ℃，pH 10.0，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%，酶-底物比8 000 U/g，酶解時間分別為2、4、6、8、10 h。酶解結(jié)束后將酶解產(chǎn)物放入沸水15 min滅酶活，接著8 000×g離心20 min，得上清液，過0.45 μm濾膜，即得珍珠貝肉酶解物，凍干，存放在-20 ℃下備用。

1.3.2 酶解物的Tricine-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

分別配制18%分離膠及5%濃縮膠，灌膠后等待膠凝固。將不同酶解時間的酶解物溶于水中，配制成 100 mg/mL多肽溶液。吸取多肽溶液20 μL，加入同等體積上樣緩沖液，煮沸6 min，離心3 min，分別吸取20 μL多肽與上樣緩沖液的混合溶液到膠孔中，以60 V電壓將混合液在濃縮膠中壓縮成一條線后，再以100 V電壓跑分離膠。電泳完畢后加入固定液固定條帶30 min，加入考馬斯亮藍(lán)R250染色1 h，隨后脫色至背景顏色完全褪去。

1.3.3 酶解物的分子質(zhì)量分布測定

配制1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品（細(xì)胞色素C、胰島素、抑肽酶、VB12、N-HHL水合物），上樣10 μL，經(jīng)Agilent Bio SEC-5柱等度洗脫，洗脫液為0.5 mol/L磷酸緩沖液（含2 mol/L NaCl），流速0.5 mL/min，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品與洗脫時間之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時，將樣品配制成10 mg/mL，上樣到HPLC系統(tǒng)中，在與標(biāo)準(zhǔn)品同樣的條件下洗脫，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出樣品的分子質(zhì)量分布。

1.3.4 酶解物在反相高效液相色譜（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）上的洗脫

將不同水解時間的酶解物上樣到RP-HPLC中，觀察不同酶解時間樣品的洗脫情況，進(jìn)樣20 μL，流速為1 mL/min，流動相A為0.1%三氟乙酸溶液，B為甲醇（色譜純），洗脫程序?yàn)椋?～5 min，99% A、1% B；5～35 min，99%～39% A、1%～61% B；35～38 min，39%～0% A、61%～100% B；38～46 min，0% A、100% B；46～48 min，0%～99% A、100%～1% B；48～56 min，99% A、1% B平衡至初始狀態(tài)。

1.3.5 酶解物初分離及鑒定

將酶解物經(jīng)超濾管（截留分子質(zhì)量為3 kDa）及Sephadex G-25凝膠過濾柱（3.5 cm×30 cm）進(jìn)行初步分離，活性跟蹤得到2個ACE抑制活性相對較強(qiáng)的組分F2、F3，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對這兩組分進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。將F2、F3組分配制成一定質(zhì)量濃度的溶液（20 μL，10 mg/mL），上樣到安捷倫液相色譜系統(tǒng)中，色譜柱為安捷倫ODS-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），洗脫液A為0.1%甲酸溶液，洗脫液B為甲醇（色譜純），洗脫梯度為：0～5 min，99%A、1% B；5～65 min，99%～39% A、1%～61% B。流速為1.0 mL/min。質(zhì)譜為電噴霧電離源的maXis Impact MS質(zhì)譜儀，以正離子模式進(jìn)行，m/z范圍為200～3 000。其他質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置如下：干燥溫度180 ℃，電噴霧毛細(xì)管電壓4.5 kV，干氣流量4.0 L/ min。本研究采用PEAKS Studio 8.5中的從頭測序法對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行解析，母離子和碎片離子分別設(shè)置為10-5、0.02 Da，僅保留具有高平均置信度（average local confidence，ALC）值（＞85%）的肽序列。

1.3.6 潛在的ACE抑制肽篩選及合成

為了篩選潛在的ACE抑制肽，使用Autodock vina對鑒定的肽進(jìn)行分子對接。ACE的晶體結(jié)構(gòu)（編碼：4APH）從PDB網(wǎng)站（http://www.pdb.org）下載獲得。刪除了水和原始配體，并為受體蛋白添加了極性氫原子，隨后該受體由Autodock Tools（版本1.5.6）保存為pdbqt文件。配體小分子結(jié)構(gòu)由ChemOffice 2018生成，也使用Autodock工具打開，并自動添加了Gasteiger電荷，設(shè)置旋轉(zhuǎn)鍵，保存為pdbqt文件。對接時采用文獻(xiàn)[23]方法，搜索空間中心坐標(biāo)為center_x=12.41，center_y= -4.333，center_z=-18.973，搜索空間大小為size_x=34， size_y=36，size_z=52，對接的結(jié)果以結(jié)合能值表示，值越低代表小分子與蛋白結(jié)合得越緊，其抑制活性越強(qiáng)。使用PyMOL分析具有最低結(jié)合能的穩(wěn)定構(gòu)象，然后生成3D圖以顯示肽與ACE之間相互作用的最佳構(gòu)象。另外，使用Discovery Studio Visualizer可視化軟件獲得2D圖。并且，多肽等電點(diǎn)（pI）、凈電荷及水溶性通過多肽特性計算網(wǎng)站獲得（https://pepcalc.com/）[24]。通過比較結(jié)合能，篩選活性肽進(jìn)行固相合成以驗(yàn)證其活性。

1.3.7 ACE抑制活性的測定

根據(jù)Lan等[25]的方法作修改。首先，將實(shí)驗(yàn)所需的所有試劑溶解在硼酸鹽緩沖液（100 mmol/L硼酸鹽，300 mmol/L NaCl，pH 8.3）中，將30 μL 5 mmol/L HHL和10 μL的樣品溶液混合，在37 ℃下預(yù)熱6 min。同時，用10 μL硼酸鹽緩沖液代替10 μL樣品溶液制備空白溶液。然后，將30 μL預(yù)熱過的ACE溶液（0.1 U）分別加入到空白和樣品溶液中，37 ℃保溫反應(yīng)30 min，最后通過添加60 μL 0.1 mol/L HCl溶液終止整個反應(yīng)。馬尿酸的含量通過RP-HPLC測定，用25%乙腈和75% milli-Q水（0.05% TFA）作為流動相進(jìn)行等度洗脫，流速為 1 mL/min，于228 nm波長處檢測馬尿酸的吸收峰。ACE抑制活性由下式計算：

式中：A1為空白溶液中馬尿酸峰面積；A2為含多肽的樣品液中馬尿酸峰面積。

1.4 統(tǒng)計分析

使用GraphPad Prism 8.0.1繪制圖形，對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)表示為±s，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 珍珠貝肉不同酶解時間樣品的Tricine-SDS-PAGE

如圖1所示，泳道1可以看出珍珠貝肉中的蛋白種類繁多，分子質(zhì)量多集中在10～35 kDa之間。酶解2 h后大于35 kDa的條帶基本消失，出現(xiàn)了大量小于35 kDa甚至10 kDa左右的條帶。而酶解到第10小時，10～35 kDa之間的條帶也消失，說明酶解產(chǎn)生了大量10 kDa以下的肽，這些分子質(zhì)量較小的肽難以通過電泳完全跑開。在整個酶解過程中，有一條35 kDa左右的蛋白條帶始終存在，推測它可能是珍珠貝肉中某種或幾種難以被堿性蛋白酶酶解的蛋白。

圖1 珍珠貝肉蛋白水提物及其不同酶解時間酶解物的Tricine-SDS-PAGEFig. 1 Tricine-SDS-PAGE patterns of water-soluble protein extracted from P. fucata meat and its hydrolysates at different hydrolysis times

2.2 珍珠貝肉酶解物的分子質(zhì)量分布特征

由表1可知，酶解2 h后，蛋白可能只是初步降解，產(chǎn)生的肽段分子質(zhì)量仍在3 000 Da以上。在酶解時間達(dá)到4 h時，產(chǎn)生了大量小于3 000 Da的多肽，占總量的28.39%。在酶解時間為10 h時，產(chǎn)生的低于500 Da小分子肽含量達(dá)到最高，為5.82%。隨著酶解時間的進(jìn)行，大分子蛋白含量逐漸降低，小分子肽含量逐漸升高，這是因?yàn)殡S著酶解的進(jìn)行，已產(chǎn)生的長肽鏈，可能再次被蛋白酶切割，導(dǎo)致了更多小分子肽的產(chǎn)生。同時，由于底物的消耗，反應(yīng)產(chǎn)物的生成，以及酶切位點(diǎn)的有限性，使得新的小分子肽段產(chǎn)生的速率變慢。

表1 不同酶解時間酶解物的分子質(zhì)量分布Table 1 Molecular mass distribution of hydrolysates at different hydrolysis times

2.3 RP-HPLC對不同酶解時間酶解物的表征

如圖2所示，可以觀察到一個保留時間為20 min左右的特征峰（a），其在2、4、6、8、10 h酶解物樣品中峰面積比分別為3.69%、6.49%、9.23%、10.42%、12.46%。隨著酶解的進(jìn)行，其相對含量越來越大，特別是從2～4 h之間增加的幅度最大。根據(jù)文獻(xiàn)報道[26]，具有ACE抑制活性肽的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是含有大量疏水性氨基酸，這種疏水的特性會使得它們在反相柱上的保留時間相對較長，這與本研究相符，即疏水性的特征峰面積占比隨著酶解時間逐漸增大，說明疏水性的肽含量在逐漸增加，其ACE抑制活性隨著酶解進(jìn)行可能在逐漸增強(qiáng)。并且，實(shí)驗(yàn)中使用的堿性蛋白酶因具有廣泛的酶切位點(diǎn)，也使得酶解過程中更易產(chǎn)生疏水性的末端氨基酸[5]，含疏水性末端氨基酸的肽隨著酶解進(jìn)行逐漸累積。

圖2 不同酶解時間酶解物在RP-HPLC上的洗脫Fig. 2 RP-HPLC profiles of hydrolysates at different hydrolysis times

2.4 珍珠貝10 h酶解物活性肽的鑒定、篩選及理化特性

在本研究中，10 h酶解物中小分子肽含量占比最大，并且據(jù)報道ACE抑制活性肽大多為小分子肽[27]，因此，在本實(shí)驗(yàn)中選擇10 h的珍珠貝肉蛋白酶解物繼續(xù)進(jìn)行研究。采用超濾及凝膠色譜法對酶解物進(jìn)行初步的分離及活性跟蹤，經(jīng)Sephadex G-25柱洗脫后，收集了4個組分（圖3），發(fā)現(xiàn)F2和F3組分的ACE抑制活性最強(qiáng)，因此采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對這兩個組分進(jìn)行鑒定。以PEAKS Studio軟件對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行de novo測序，選擇ALC值大于85%的肽段進(jìn)行分析。接著以Autodock vina軟件對這些肽段進(jìn)行分子對接，得到的理論結(jié)合能如表2所示。同時，通過在線網(wǎng)站對這些肽段的等電點(diǎn)、凈電荷及水溶性進(jìn)行了預(yù)測，發(fā)現(xiàn)其等電點(diǎn)范圍在0.67～10.9，凈電荷在-1～1之間，水溶性大部分都不好，說明它們的疏水性強(qiáng)，而疏水性強(qiáng)的肽相對親水肽往往具有更高的生理活性[28]。可以看出PDFF、PPDPAAW、GLQW、FGPW、WFHAVFW、WHAFLW的結(jié)合能分別為-10.9、 -10.7、-10.6、-10.8、-10.8、-12.0 kcal/mol，相對其他的肽更低，與ACE結(jié)合得更為緊密，其活性可能更高，因此選擇這6個肽進(jìn)行了固相合成。

圖3 Sephadex G-25的洗脫圖譜Fig. 3 Elution of hydrolysates on Sephadex G-25

表2 F2及F3組分中肽段的鑒定及其他理化特征Table 2 Identification and physicochemical properties of peptides in fractions F2 and F3

續(xù)表2

2.5 合成肽的活性驗(yàn)證及構(gòu)效關(guān)系

取合成肽適量，配制成1 mg/mL的肽溶液，采用1.3.7節(jié)方法測定每個樣品的ACE抑制活性，結(jié)果如圖4 所示，可知，除了FGPW外，PDFF、PPDPAAW、GLQW、WFHAVFW及WHAFLW均表現(xiàn)出不同程度的ACE抑制活性，特別是肽WFHAVFW及WHAFLW，在 1 mg/mL時，其ACE抑制率分別達(dá)到了（95.57±0.37）%及（98.59±0.08）%。因此，肽WHAFLW相比于其他合成肽具有更高的ACE抑制活性，經(jīng)鑒定，其二級質(zhì)譜圖如圖5所示。將活性最高的WHAFLW稀釋一系列梯度濃度，測得其IC50值為52.39 μmol/L。因此，該肽可作降壓藥物的先導(dǎo)物以進(jìn)行后續(xù)的研究開發(fā)。WFHAVFW及WHAFLW這兩條多肽序列的共同特點(diǎn)是兩端均有疏水性極強(qiáng)的Trp（W），且中間位置均包含帶正電的氨基酸His（H）。推測正是這個特征使得它們具有相對更高的ACE抑制活性。

圖4 合成肽的ACE抑制率Fig. 4 ACE inhibitory rates of synthetic peptides

圖5 六肽WHAFLW的二級質(zhì)譜信息Fig. 5 MS/MS spectrum of hexapeptide WHAFLW

最近的構(gòu)效關(guān)系表明，分子質(zhì)量過大或過小的肽均不利于與ACE結(jié)合，其ACE抑制活性相對更低，最有潛力的ACE抑制肽由5個或6個氨基酸組成[27]。其次，C端具有疏水性氨基酸（Trp、Leu、IIe等），N端具有芳香族氨基酸（Trp、Tyr等），有利于ACE抑制活性的增加。并且，肽序列中如果含有帶正電的氨基酸（比如Lys、Arg、His），也會增強(qiáng)其抑制ACE的能力，其原因是疏水性的氨基酸容易接近ACE活性口袋中的疏水性殘基，與其形成相互作用。同時，帶正電的氨基酸因?yàn)榕cACE的C端活性口袋中帶負(fù)電的氨基酸（Glu403、Glu162）結(jié)合，因此相比于N端，抑制劑更傾向于與C端結(jié)合，從而增強(qiáng)了ACE抑制活性。本研究2個高活性肽也是因?yàn)閮啥撕惺杷约娣枷阕灏被酺rp，中間帶有正電性氨基酸His，從而使得其ACE抑制活性增強(qiáng)。Girgih等[29]報道了四肽WVYY和三肽WYT就是因?yàn)镃-端氨基酸不同導(dǎo)致了活性差異，四肽WVYY的IC50為27 μmol/L，而WYT的IC50值為547 μmol/L，認(rèn)為C-端的第3位置疏水性的Val（V），以及C端第1、2位置的2個疏水性Tyr（Y）促進(jìn)了WVYY中ACE抑制活性的增強(qiáng)，而WYT則由于C端有1個親水性的氨基酸蘇氨酸（T），減弱了其ACE抑制活性，可見C端的疏水性對ACE抑制活性起重要作用。本研究2個高活性肽兩端的Trp（W）也是一種高度疏水的氨基酸，常見的氨基酸疏水順序如下：F＞L=I＞ W=Y＞V＞M＞P＞C＞A＞G＞T＞S＞K＞Q＞N＞H＞E＞ D＞R。Xie Jingli等[30]對一種微藻蛋白進(jìn)行胃腸道在線模擬消化，從消化的片段中篩選高活性的ACE抑制肽，其篩選的原則之一就是C端氨基酸為芳香族或者環(huán)狀氨基酸，比如Trp、Tyr。最終，其篩選到了兩種C端為Trp的高活性ACE抑制三肽TTW和VHW，其IC50值分別為（0.61±0.12）、（0.91±0.31）μmol/L。

2.6 肽與ACE相互作用機(jī)理

本研究篩選出的2個最高活性的ACE抑制肽，即七肽WFHAVFW與六肽WHAFLW，與ACE的結(jié)合模式如圖6所示?？梢钥闯觯腤FHAVFW（綠色）與WHAFLW（藍(lán)色）中結(jié)合能最低的構(gòu)象在ACE中有一部分存在著空間重疊，說明重疊的官能團(tuán)可能與ACE存在相同的作用，而從2D圖可以看出，兩個肽中這一重疊結(jié)構(gòu)的六元環(huán)及五元環(huán)中心均與ACE的Phe391形成了Pi-Pi相互作用。

圖6 七肽WFHAVFW、六肽WHAFLW與ACE的分子對接Fig. 6 Molecular docking between peptides and ACE

另外，在抑制劑與酶的作用中，氫鍵也十分重要。氫鍵的數(shù)量以及長短影響抑制劑與酶的結(jié)合力。在本研究中，2個肽與ACE的殘基均形成了多個氫鍵。七肽WFHAVFW與Ala356、Asn66各形成2個氫鍵，與Asn70、Ser517各形成了1個氫鍵，共6個氫鍵。而六肽WHAFLW與Ala356、Tyr523、Ala354、His513、Gln281、Lys511以及Cys370各形成了1個氫鍵，共7個氫鍵。ACE活性部位主要由3個活性口袋組成，即S1（Ala354、Glu384和Tyr523）、S2（Gln281、His353、His513、Lys511和Tyr520）和S1′（Glu162）[30]，可以看出，與六肽WHAFLW形成氫鍵的氨基酸殘基有一部分也屬于這些活性口袋，比如Tyr523、Ala354屬于S1口袋，His513、Gln281、Lys511屬于S2口袋，而與七肽WFHAVFW形成氫鍵的氨基酸殘基均不屬于活性口袋，可見，與活性口袋的氨基酸形成氫鍵對于維持肽-酶復(fù)合物穩(wěn)定性極其重要。因此，六肽WHAFLW的活性在一定程度上高于七肽WFHAVFW。并且，六肽與Zn2+也存在相互作用，有研究報道稱，Zn2+還聯(lián)合其他3個氨基酸殘基（Glu411、His383、His 387）一起形成一個可扭轉(zhuǎn)的四面體結(jié)構(gòu)，對整個復(fù)合物的穩(wěn)定起到了關(guān)鍵的 作用[31]。其次，除氫鍵和與金屬離子的相互作用，范德華作用及Pi-Pi作用對復(fù)合物的穩(wěn)定也不可或缺。

3 結(jié) 論

馬氏珍珠貝肉蛋白是ACE抑制活性肽產(chǎn)生的重要來源，其酶解特征表明，合適的酶解時間可以定向產(chǎn)生一定分子質(zhì)量的活性肽。另外，本研究還實(shí)現(xiàn)了傳統(tǒng)的酶解實(shí)驗(yàn)與現(xiàn)代計算機(jī)輔助篩選技術(shù)相結(jié)合，高效篩選出了一個高活性的ACE抑制六肽，其氨基酸序列為WHAFLW，體外對ACE抑制的IC50值為52.39 μmol/L，對它的結(jié)構(gòu)分析表明，兩端具有疏水性的Trp（W），中間包含帶正電的His（H），是其具有高ACE抑制活性的重要原因。